Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le Drosophila Antenne

L’objectif global de l’expérience suivante est de visualiser les neurones récepteurs olfactifs à l’aide de la coloration des antennes entières. Anesthésie d’abord la mouche pour lui couper la tête verticalement. Ensuite, placez la tête de mouche disséquée sur une assiette de pommes.

Ensuite, coupez le troisième segment de l’antenne et placez-le dans la boîte de culture à fond de verre afin d’effectuer une immunochimie histologique. Après avoir monté les antennes dans une diapositive de verre, nous pouvons visualiser les différents types de neurones récepteurs olfactifs à travers le microscopique confocal hi. Nous travaillons sur le système olfactif.

Le système olfactif est utilisé pour distinguer une variété immersive d’autres molécules. La large gamme de neurones olfactifs distincts qui existent dans ce système permet la transmission précise et coordonnée de l’information des récepteurs cibles aux neurones du cerveau. Aujourd’hui, nous allons décrire l’ensemble de la coloration de l’antenne de la monture pour détecter la diversification de ces neurones récepteurs olfactifs.

Afin d’assurer une coloration réussie de l’ensemble du support et de l’antenne, il est essentiel de préparer un nouveau lot de fixateur immédiatement avant de commencer le protocole. Anesthésie la mouche Et puis coupe la tête de la mouche verticalement en tenant son corps avec des pinces. Maintenant, placez soigneusement l’antenne disséquée sur une assiette de pomme.

Coupez le troisième segment de l’antenne à l’aide de ciseaux de dissection fins. Placez la solution fixatrice de 90 Microlitres au centre du plat. À l’aide d’une aiguille pointue, transférez doucement l’antenne disséquée directement dans la solution fixatrice.

Laissez maintenant la fixation se dérouler sans être dérangée pendant 40 minutes à température ambiante pour terminer la fixation. Lavez les antennes trois fois avec du PBST pendant 10 minutes par lavage lors du retrait de la solution de lavage. Tout d’abord, amenez toutes les antennes au centre de la parabole à l’aide d’une aiguille.

Retirez ensuite la solution sur le côté du plat. L’agitation pendant l’incubation n’est pas nécessaire. Pour vous préparer à la coloration, retirez le dernier lavage de PBST et bloquez les antennes fixes en remplissant la chambre avec 90 microlitres de sérum de cheval à 5 % dans 0,1 % de PBST remplacez la solution de blocage par des anticorps primaires dilués dans un mélange de sérum de cheval à 5 %.

Dans le PBST, les principaux anticorps utilisés sont l’anti-GFP de souris un sur 400 et l’anti eof de rat, dilués à une concentration d’un sur 200 pour éviter le dessèchement des échantillons d’antennes. Placez un mouchoir humide dans le couvercle de la boîte de culture et enveloppez-le avec le paraforme. Placez ensuite la boîte de culture dans un récipient en plastique contenant des tissus humides.

Incuber les antennes dans les anticorps primaires pendant 48 heures à quatre degrés Celsius après 48 heures. Éliminez les anticorps primaires non liés en effectuant six lavages dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Similaire à la procédure de retrait du fixateur décrite précédemment.

Après une heure de lavages de PBST, ajoutez une solution d’anticorps secondaires diluée dans un mélange de sérum de cheval à 5 %. Dans cet exemple, les anticorps sont des IgG anti-lapin SI deux et des IgG anti-rat trois. Couvrez le récipient avec du papier d’aluminium à partir de ce moment pour éviter le fluor quatre. Le photoblanchiment consiste ensuite à incuber l’antenne dans l’anticorps secondaire pendant 48 heures à quatre degrés Celsius.

À ce stade, l’antenne est maintenant prête à être montée pour monter l’antenne. Retirez autant de PBST que possible de la boîte de culture et commencez progressivement à introduire du glycérol dans les antennes. Ensuite, ajoutez 40 % de glycérol dans le plat pendant une à deux minutes, puis retirez-le et ajoutez 80 % de glycérol et laissez-le pendant cinq minutes.

La coloration fluorescente a révélé les neurones Elof positifs et les neurones olfactifs ciblés. En combinant cette procédure avec d’autres méthodes similaires, y compris la génération de mosaïques génétiques de neurones olfactifs, nous espérons initier le contrôle mécanique de la diversification des neurones olfactifs et répondre à d’autres questions scientifiques importantes.