Name: Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le Drosophila Antenne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Découvrez l'immunomarquage de montage total des antennes de Drosophila pour visualiser les neurones récepteurs olfactifs. Cette technique révèle les mécanismes moléculaires de la diversification des NRO.

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Cette étude a été financée par le Programme MEXT-prise en charge de la Fondation pour la recherche stratégique dans les universités privées et JSPS Young Scientist B subvention pour HT Nous tenons à remercier Ohtake Norihito pour éditer les clips vidéo.

1. Préparer la plaque de pomme <ol><li> Mélanger 12,5 g de gélose, 125 ml 100% disponible dans le commerce du jus de pomme, 12,5 g de glucose et 375 ml de H 2 O. Micro-ondes le mélange pendant 1 à 2 minutes et verser dans le plat de la culture 3 cm de cellule. Stocker à 4 ° C. </li></ol> 2. Transversale Genetic <ol><li> Utilisez le croisement génétique représentant suivant: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / CYO x w 1118 3. Dissection et coloration protocole <ol><li> Anesthésier la volée, puis couper la tête à la mouche à la verticale en le tenant à l&#39;aide d&#39;une pince. </li><li> Placez délicatement la partie antennes contenant sur une plaque de pomme. </li><li> Couper le troisième segment de l&#39;antenne à l&#39;aide des ciseaux fins de dissection. </li><li> Placer 90 ul de la solution de fixation (4% de paraformaldehyde dans 0,1% de PBST (PBS avec 0,1% de Triton X-100)) au milieu d&#39;une boîte de culture à fond en verre. </li><li> Transférer délicatement le Antenn disséquéae avec une aiguille directement dans la solution de fixation. Si nécessaire, plonger physiquement les antennes dans la solution en utilisant l&#39;aiguille. </li><li> Incuber pendant 40 minutes à la température ambiante (RT). Laver les antennes à 0,4% du PBST (PBS avec 0,4% de Triton X-100), 3 x 10 minutes dans chaque, en les maintenant dans le même plat. Utilisez pointes jaunes à enlever et ajouter la solution PBST. Utiliser 90 pl de la solution de lavage à chaque fois. REMARQUE: Ne pas placer le plat dans un shaker pendant immunohistochimie. Avant de retirer ou d&#39;ajouter la solution dans le récipient métallique, faire toutes les antennes dans le centre de la boîte à l&#39;aide de l&#39;aiguille et avec précaution d&#39;ajouter ou de supprimer la solution à partir du bord de la cuvette. </li><li> Bloquer les antennes avec 90 ul de 5% de sérum de cheval normal dans du PBST à 0,1% pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Après avoir retiré la solution de blocage, incuber les antennes avec 90 pi d&#39;anticorps primaires dans du PBST à 0,1% contenant 5% de sérum de cheval pendant 48 h à 4 ° C dans un récipient tel que décrit précédemment humidifié <sjusqu&#39;à&gt; 8. </li><li> Laver les antennes 6x 10 minutes dans 0,4% PBST. </li><li> Incuber les antennes avec 90 ul d&#39;anticorps secondaire dans du PBST à 0,1% contenant 5% de sérum de cheval pendant 48 heures à 4 ° C. Laver 6x 10 minutes en utilisant 0,4% PBST. </li><li> Pour monter les antennes, retirez PBST de la boîte de culture autant que possible et d&#39;introduire progressivement deux concentrations différentes de glycérol à l&#39;antenne. Ajouter d&#39;abord 40% de glycerol à l&#39;antenne pendant 1 à 2 minutes; puis supprimer ce et ajouter 80% de glycérol. </li><li> Retirez délicatement les antennes (dont 80% de glycérol) de la boîte de culture en utilisant la pointe jaune et placez-les sur une lame. Placez délicatement une lamelle sur le dessus et sceller les bords de lamelle avec du vernis à ongles. Les antennes sont maintenant prêtes à être imagée par microscopie à fluorescence. </li></ol>

<ol><li>Christensen, T. A., White, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristensen%2C+TA+%22Representation+of+olfactory+information+in+the+brain+In+The+Neurobiology+of+Taste+and+Smell%22">Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell</a>. , New York. 201-232 (2000).</li>
<li>Ache, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+common+strategy+for+transducing+olfactory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a common strategy for transducing olfactory information.</a> Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction.</a> C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).</li>
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<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117, 965-979 (2004).</li>
<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

La dissection de l&#39;antenne Drosophila nous décrivons est simple et facile à réaliser dans un environnement de laboratoire. Pour assurer une dissection de succès, il est essentiel d&#39;utiliser des ciseaux bien tranchants. Alors que la coloration immunologique antenne disséqué, il est important de les incuber dans un récipient rempli d&#39;humidité pour éviter l&#39;évaporation de la solution d&#39;anticorps. L&#39;antenne disséqué a tendance à flotter dans la solution. Utilisation de 0,1% de Triton dans du...

Le système olfactif est utilisé pour faire la distinction entre une immense variété de molécules odorantes et ensuite envoyer les informations résultant des centres supérieurs du cerveau. Cette entrée est utilisée pour contrôler avec précision les comportements animaux fondamentales, telles que l&#39;alimentation et l&#39;accouplement 1-6. Comme chaque type de neurone olfactif est associée à un ensemble spécifique d&#39;odeurs, la diversification des neurones récepteurs olfactifs (ORN) s est essentiel pour le fonctionnement du système olfactif bon 7. Génétique de la Drosophile nous permet d&#39;effectuer des investigations au niveau de la cellule unique impliquant des mécanismes moléculaires associés au développement de ORN et la fonction physiologique 8-16. Tout le immunomarquage montage de la drosophile antennes nous a permis de comprendre plus en détail les mécanismes moléculaires impliqués dans la diversification des neurones récepteurs olfactifs (ORN) s 7. Ici, nous fournissons une description détaillée d&#39;une méthode simple pour acHieve cela.

<table><tbody><tr><td>Microscope de dissection Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture à fond de verre&nbsp ;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Études de développement anti-ELAV pour rats</td><td>Banque d’hybridomes</td><td>7E8A10</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP de souris</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Dilution 1:400</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Âne Anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Dilution 1:200</td></tr></tbody></table>

tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; drosophila</em&gt; antenne

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Molécules odorantes se lient à leurs récepteurs cibles d&#39;une manière précise et coordonnée. Chaque récepteur reconnaît un signal spécifique et transmet cette information au cerveau. En tant que tel, de déterminer comment l&#39;information olfactive est transféré vers le cerveau, modifiant à la fois la perception et le comportement, l&#39;enquête de fond. Fait intéressant, il est évident que des facteurs de transduction cellulaire et la transcription sont impliqués dans la diversification de neurone récepteur olfactif. Ici, nous fournissons un support de l&#39;ensemble robuste méthode de marquage immunologique pour doser olfactif organisation in vivo des neurones récepteurs. En utilisant cette méthode, nous avons identifié tous les neurones récepteurs olfactifs avec l&#39;anticorps anti-ELAV, un marqueur pan-neuronal connu et Or49a-mCD8 :: GFP, un neurone récepteur olfactif spécifiquement exprimée dans Nba neurone en utilisant un anticorps anti-GFP.

Veiller à ce que les deux la dissection et la fixation sont effectuées rapidement est un facteur clé dans la réussite de ce protocole. Avec des ciseaux et des pinces fines est également cruciale. Après immunomarquage, marqués par fluorescence antennes ont été examinées sous un microscope confocal. Nous prenons normalement sections de 1 um en utilisant une lentille 20x. Nous avons étiqueté Nba 7 ORNs utilisant la GFP de Or49a-mCD8 et compté le nombre de Nba ORNs antenne de type sauvage. Le reporter mCD8-GFP es...

Nous décrivons ici le processus d’immunocoloration de l’ensemble du mont des antennes de la drosophile, ce qui nous permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la diversification des neurones récepteurs olfactifs (ORN).

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser les neurones récepteurs olfactifs à l'aide d'une coloration de préparations entières des antennes. Anesthésiez d'abord la mouche pour couper sa tête verticalement. Ensuite, placez la tête de la mouche disséquée sur une plaque de pomme.Ensuite, coupez le troisième segment de l'antenne et placez-le dans la boîte de culture à fond en verre afin de réaliser une immunohistochimie. Après avoir monté les antennes sur une lame de microscope, nous pouvons visualiser les différents types de neurones récepteurs olfactifs par microscopie confocale. Nous travaillons sur le système olfactif.Le système olfactif est utilisé pour distinguer une grande variété d'autres molécules. L'ample gamme de neurones olfactifs distincts présents dans ce système permet une transmission précise et coordonnée de l'information depuis les récepteurs cibles jusqu'aux neurones du cerveau. Aujourd'hui, nous décrirons la coloration en montage entier de l'antenne afin de détecter la diversification de ces neurones récepteurs olfactifs.Pour garantir une coloration réussie de la préparation en montage entier et de l'antenne, il est essentiel de préparer un bain de fixateur frais juste avant de commencer le protocole. Anesthésiez la mouche, puis coupez la tête de la mouche verticalement en tenant son corps avec une pince. Placez ensuite délicatement l'antenne disséquée sur une plaque de pomme.Coupez le troisième segment de l'antenne à l'aide de ciseaux de dissection fins. Placez 90 microlitres de solution fixative au centre de la boîte. À l’aide d’une aiguille fine, transférez délicatement l’antenne disséquée directement dans la solution fixative.Laissez maintenant la fixation se poursuivre sans perturbation pendant 40 minutes à température ambiante pour terminer la fixation. Lavez les antennes trois fois avec du PBST pendant 10 minutes par lavage lors de l'élimination de la solution de lavage. Commencez par regrouper toutes les antennes au centre de la boîte à l’aide d’une aiguille.Ensuite, retirez la solution du côté de la boîte. L'agitation pendant l'incubation n'est pas nécessaire. Pour préparer la coloration, retirez le dernier lavage de PBST et bloquez les antennes fixées en remplissant la chambre avec 90 microlitres de sérum de cheval à 5 % dans du PBST 0,1 %, puis remplacez la solution de blocage par les anticorps primaires dilués dans un mélange contenant 5 % de sérum de cheval.Dans le PBST, les anticorps primaires utilisés sont l'anticorps de souris anti-GFP à une dilution de un sur 400 et l'anticorps de rat anti-eof, dilué à une concentration de un sur 200 afin d'éviter que les échantillons d'antennes ne s'assèchent. Placer un morceau de papier absorbant humide dans le couvercle de la boîte de culture et l'envelopper avec du parafilm. Puis placer la boîte de culture dans un récipient en plastique contenant des morceaux de papier absorbant humides.Incuber les antennes dans les anticorps primaires pendant 48 heures à quatre degrés Celsius après 48 heures. Éliminer les anticorps primaires non liés par six lavages dans du PBST pendant 10 minutes par lavage. Procéder de manière similaire à la méthode décrite précédemment pour l'élimination du fixateur.Après une heure de lavages en PBST, ajoutez la solution d'anticorps secondaire diluée dans un mélange de 5 % de sérum de cheval dans du PBST. Dans cet exemple, les anticorps sont SI deux anti-IgG de lapin et SI trois anti-IgG de rat. Couvrez le récipient avec du papier d'aluminium à partir de ce moment afin d'éviter la photodégradation du fluorochrome. Incubez ensuite les antennes dans l'anticorps secondaire pendant 48 heures à quatre degrés Celsius.À ce stade, l'antenne est désormais prête à être montée. Éliminez autant que possible le PBST de la boîte de culture, puis commencez progressivement à introduire du glycérol autour des antennes. Ajoutez ensuite du glycérol à 40 % dans la boîte pendant une à deux minutes, puis retirez-le et ajoutez du glycérol à 80 %, en laissant agir pendant cinq minutes.La coloration fluorescente a révélé des neurones positifs pour Elof et les neurones olfactifs ciblés. En combinant cette procédure à d'autres méthodes similaires, notamment la génération de mosaïques génétiques de neurones olfactifs, nous espérons amorcer l'étude des mécanismes contrôlant la dédifférenciation des neurones olfactifs et répondre à d'autres questions scientifiques importantes.

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