Évaluation phagocytaire Liquidation de la mort cellulaire dans des maladies expérimentale par ligaturables fluorescentes sondes

L’objectif global de cette procédure est de marquer sélectivement les cellules phagocytaires actives, qui éliminent les cadavres cellulaires lors d’un AVC. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les composants pour la réaction d’amplification du signal basée sur Tite. La deuxième étape consiste à préparer les sections.

Ensuite, la réaction de marquage est effectuée à l’aide de l’enzyme vaccine, de la topoisomérase et de sondes fluorescentes sensibles. La dernière étape est l’amélioration du signal fluorescent basée sur IDE. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour évaluer la clairance phagocytaire des cellules mortes dans les coupes tissulaires de l’ischémie cérébrale focale.

L’élimination des cellules mortes par les phagocytes joue un rôle important dans la récupération du cerveau après une ischémie. La méthode présentée détermine l’efficacité de ce processus en étiquetant uniquement les tailles de pego qui éliminent activement les cellules mortes. Bien que cette méthode donne un aperçu du cerveau ischémique, elle peut également être utilisée pour étudier les lésions ischémiques dans d’autres organes et tissus.

Où l’élimination acide des cellules mortes est importante. Bien que l’étape d’amplification du signal IDE ou TSA se produise lors de l’étape finale du marquage, la préparation de cette réaction peut prendre plus d’une heure. Il est donc plus pratique de fabriquer les réactifs TSA en premier.

La première étape consiste à préparer la solution mère de fluoro quatre TYROM à 300 microlitres de DMSO dans les fichiers de réactifs tyrom inclus dans le kit d’étiquetage TSA. Ensuite, préparez le tampon de lavage TNT pour dissoudre complètement le réactif de blocage. Lors de la fabrication du tampon de blocage TNB, ajoutez-le lentement par petits incréments tout en agissant, chauffez la solution progressivement à 55 degrés Celsius.

Avec une agitation continue, la solution apparaîtra laiteuse et doit être portée à température ambiante avant d’utiliser l’aliquote et stockée à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation à long terme Pour cette procédure, les lames sont préparées à l’avance en montant des sections de cinq micromètres d’épaisseur. Coupé dans du tissu fixé au formol. Tout d’abord, traitez les sections avec du xylène pendant 15 minutes, réhydratez les sections par une série de lavages à l’éthanol, suivis de deux lavages à l’eau.

Ensuite, préparez la solution de travail de la protéinase K en diluant une solution mère à 50 microgrammes par millilitre dans du PBS. La partie la plus difficile de cette expérience est de déterminer la durée idéale pour les contrôles de digestion de la protéinase K, avec des temps de digestion plus courts et plus longs qui pourraient être nécessaires pour assurer le succès en fonction de la taille et du type de tissu. Ajoutez le volume approprié de solution de travail de protéine ACE K dans les sections et incubez pendant 15 minutes à 23 degrés Celsius.

Après l’incubation, lavez les sections à l’eau distillée deux fois pendant cinq minutes chacune. Pendant que les sections trempent, préparez le mélange d’étiquetage contenant la sonde active. Pour préparer la solution de sonde active, combinez les oligonucléotides avec de l’eau, une molaire, du triss, du HCL et la vaccine topoisomérase fournie dans le kit, mélangés doucement par pipetage et incubez à température ambiante pendant 15 minutes pour permettre l’activation de la sonde.

Après la deuxième période de lavage, retirez les sections du bocal et aspirez l’eau restante. Lorsque vous êtes prêt, appliquez la solution de sonde active préparée précédemment. Glissez les sections et incubez-les pendant 15 minutes à 23 degrés Celsius.

Après l’incubation, trempez les lames dans l’eau pour retirer délicatement les lamelles. Lavez les lames à l’eau trois fois pendant cinq minutes chacune. Après le dernier lavage, recouvrez les sections de tissu avec un tampon bloquant TNB et incubez les lames dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes à température ambiante.

Pendant ce temps, préparez une dilution de un à 100 de conjugués de peroxydase de raifort et de raifort. S-A-H-R-P dans la mémoire tampon de blocage TNB, récupère les diapositives et aspire la mémoire tampon de blocage TNB. Avant d’appliquer la solution S-A-H-R-P, utilisez suffisamment de réactif pour couvrir toute la section du tissu.

Une fois couvertes, incubez les lames pendant 30 minutes à température ambiante Après l’incubation, lavez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune. Dans un tampon de lavage TNT à température ambiante, préparer une dilution de un à 50 de la crosse fluoro quatre TY IDE dans un diluant d’amplification x immédiatement avant l’utilisation. Pipetez la solution sur les lames en recouvrant complètement la section de tissu.

Comme la solution ne peut pas être réutilisée, jetez toute portion inutilisée restante. Incuber les lames à température ambiante pendant trois à 10 minutes. Surveillez la fluorescence.

Augmentez au microscope jusqu’à ce que les premiers indices de structures soient visibles à ce moment-là. Passez rapidement à l’étape de lavage. Lavez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune.

Dans TNT Laver le tampon à température ambiante avec agitation. Après le lavage, ajoutez la solution anti-décoloration avec DPI et lamelle. Observez les résultats au microscope à fluorescence.

Ces images montrent deux exemples de clairance acide du PHA. La tache nucléaire dappy est représentée en fluorescence bleue et la sonde topo vac sensible est représentée en vert. Les diagrammes des événements présentés dans ces images montrent des noyaux de phagocytes et des noyaux supplémentaires engloutis à divers stades de la digestion. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures environ si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous saurez comment utiliser des sondes fluorescentes sensibles dans des coupes de tissus. Vous serez également en mesure de marquer sélectivement les ides actives éliminant les cellules mortes dans le cerveau ischémique.