Évaluation phagocytaire Liquidation de la mort cellulaire dans des maladies expérimentale par ligaturables fluorescentes sondes

L'objectif général de cette procédure est de marquer de manière sélective les cellules phagocytaires actives, qui éliminent les débris cellulaires après un accident vasculaire cérébral. Cela est réalisé en préparant d'abord les composants de la réaction d'amplification du signal basée sur Tite. La deuxième étape consiste à préparer les sections.

Ensuite, la réaction de marquage est réalisée à l’aide de l’enzyme vaccinia, de la topoisomérase et de sondes fluorescentes réactives. La dernière étape consiste en une amplification du signal fluorescent basée sur l’IDE. Enfin, la microscopie de fluorescence est utilisée pour évaluer l’élimination phagocytaire des cellules mortes dans des sections tissulaires d’ischémie cérébrale focale.

L'élimination des cellules mortes par les phagocytes joue un rôle important dans la récupération cérébrale après une ischémie. La méthode présentée détermine l'efficacité de ce processus en marquant uniquement les tailles de pégos qui éliminent activement les cellules mortes. Bien que cette méthode fournisse des informations sur le cerveau ischémique, elle peut également être utilisée pour étudier les lésions ischémiques dans d'autres organes et tissus.

Là où la clairance acide des cellules mortes par les acides gras est importante. Bien que l'amplification du signal IDE ou l'étape TSA ait lieu à la phase finale de l'étiquetage, la préparation de cette réaction peut prendre plus d'une heure. Il est donc plus pratique de préparer d'abord les réactifs TSA.

La première étape consiste à préparer la solution mère fluoro quatre TYROM en ajoutant 300 microlitres de DMSO aux fichiers de réactif tyrom inclus dans le kit de marquage TSA. Ensuite, préparez le tampon de lavage TNT afin de dissoudre complètement le réactif de blocage. Lors de la préparation du tampon de blocage TNB, ajoutez-le lentement par petites quantités tout en agitant, puis chauffez progressivement la solution jusqu'à 55 degrés Celsius.

Avec agitation continue, la solution apparaîtra laiteuse et doit être portée à température ambiante avant d'être utilisée. Prélever des aliquotes et conserver à moins vingt degrés Celsius pour une utilisation à long terme. Pour cette procédure, les lames sont préparées à l'avance en montant des sections de cinq micromètres d'épaisseur, découpées à partir de tissu fixé au formol. Tout d'abord, traiter les sections avec du xylène pendant 15 minutes, puis réhydrater les sections par une série de lavages à l'éthanol, suivis de deux lavages à l'eau.

Ensuite, préparez la solution working de protéinase K en diluant une solution mère à 50 microgrammes par millilitre dans du PBS. La partie la plus délicate de cette expérience consiste à déterminer la durée idéale de digestion par la protéinase K ; des contrôles avec des temps de digestion plus courts et plus longs peuvent être nécessaires pour assurer la réussite, selon la taille et le type de tissu. Ajoutez le volume approprié de solution working de protéinase K sur les sections et incubez pendant 15 minutes à 23 degrés Celsius.

Après l'incubation, laver les sections deux fois dans de l'eau distillée pendant cinq minutes chacune. Pendant que les sections sont en trempage, préparer le mélange de marquage contenant la sonde active. Pour préparer la solution de sonde active, mélanger les oligonucléotides avec de l'eau, un molaire de Triss, HCl et la topoisomérase vaccinia fournie dans le kit, en mélangeant doucement à l’aide d’une pipette, puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes afin de permettre l’activation de la sonde.

Après la deuxième période de lavage, retirez les sections du bocal et aspirez l'eau résiduelle. Lorsque prêt, appliquez la solution de sonde active préparée précédemment pour recouvrir. Immergez délicatement les sections et incubez-les pendant 15 minutes à 23 degrés Celsius.

Après l'incubation, plonger délicatement les lames dans l'eau pour retirer les lamelles. Laver les lames à l'eau trois fois pendant cinq minutes chacune. Après le dernier lavage, recouvrir les sections tissulaires avec le tampon de blocage TNB et incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes à température ambiante.

Pendant ce temps, préparez une dilution de un à cent des conjugués de streptavidine et de peroxydase de raifort. Dans le tampon de blocage TNB, récupérez les lames et aspirez le tampon de blocage TNB. Avant d'appliquer la solution de S-A-H-R-P, utilisez une quantité suffisante de réactif pour recouvrir entièrement la section tissulaire.

Une fois recouvertes, incuber les lames pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'incubation, laver les lames trois fois, cinq minutes chacune, dans la solution de rinçage TNT à température ambiante. Préparer juste avant utilisation une dilution au 1/50 du stock de fluoro four TY IDE dans un diluant d'amplification 1 x. Déposer la solution sur les lames en recouvrant complètement la section tissulaire à l’aide d’une pipette.

Étant donné que la solution ne peut pas être réutilisée, jetez toute portion inutilisée restante. Incubez les lames à température ambiante pendant trois à dix minutes. Surveillez la fluorescence.

Augmentez le grossissement au microscope jusqu'à ce que les premiers indices de structures deviennent visibles à ce stade. Passez rapidement à l'étape de lavage. Lavez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune.

Dans le tampon TNT avec agitation à température ambiante. Après le lavage, ajouter la solution anti-fading contenant le DPI et une lame de couverture. Observer les résultats au microscope à fluorescence.

Ces images montrent deux exemples de l'élimination acide de PHA. La coloration nucléaire dappy apparaît en fluorescence bleue et la sonde topo vac liable en fluorescence verte. Les diagrammes des événements présentés dans ces images montrent les noyaux de phagocytes ainsi que des noyaux étrangers englobés en cours de digestion à divers stades. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois heures si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous saurez comment utiliser des sondes fluorescentes spécifiques sur des sections de tissu. Vous serez également en mesure d'étiqueter sélectivement les microglies actives qui éliminent les cellules mortes dans le cerveau ischémique.