Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les mitochondries associées à la traduction des ARNm. Ceci est accompli en récoltant d’abord des cellules de levure cultivées dans des conditions d’enrichissement des mitochondries. La deuxième étape consiste à licencier doucement les cellules en présence de cyclo-heide.

Ensuite, les mitochondries sont séparées des composants solubles par centrifugation différentielle. La dernière étape est l’extraction de l’ARN à partir de mitochondries et d’échantillons de contrôle. En fin de compte, l’analyse nordique est utilisée pour montrer la pureté et la qualité de l’ARN associé aux mitochondries.

Le principal avantage de cette technique est que de nombreux types d’ARN peuvent être isolés dans une seule préparation. Par conséquent, une analyse comparative peut être faite. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire telles que le ciblage intracellulaire et la fonction organique.

Dans cette procédure, les mitochondries seront purifiées de 100 à 150. Millilitres de cellules de levure cultivées à une OD 600 de un à 1,5 à 30 degrés Celsius sur une croissance non fermentescible. Douleur moyenne. Centrifugez les cellules à 3000 fois la gravité pendant cinq minutes à température ambiante, jetez le surnageant et lavez à nouveau la pastille avec une centrifugeuse à eau double distillée.

Après avoir jeté le surnageant, pesez la pastille cellulaire. En règle générale, environ 0,6 gramme est obtenu à partir de 100 millilitres de cellules. Resus suspend le granulé dans un millilitre de tampon DTT pour 0,5 gramme de cellules.

Il est important de traiter les cellules avec un agent réducteur afin de briser les liaisons disulfures à l’intérieur de la paroi cellulaire, améliorant ainsi l’incubation des cellules pendant 10 minutes à 30 degrés Celsius avec une légère agitation. Ensuite, des cellules de centrifugeuse à 3000 fois la gravité pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension.

Dans un millilitre de tampon de liase xmal pour 0,15 gramme de cellules ne vortex pas. Mesurez la DO 600 d’une aliquote de 10 microlitres des cellules dans 990 microlitres d’eau et notez cette valeur. Ajoutez de la lise xmal fraîchement préparée aux cellules pour hydrolyser les polymères de glucose au niveau des liaisons bêta-un trois glucanes et générer Sphero plast.

À partir de là, Sphero plast doit être conservé dans une solution isotonique afin d’éviter la lyse, incuber les cellules pendant 15 minutes à 30 degrés Celsius en secouant doucement. Pour vérifier l’hydrolyse de la paroi cellulaire et de la sphère de génération de plaste, mélangez 10 microlitres de cellules avec 990 microlitres d’eau et mesurez la DO 600 Les plaques de Sphero sont censées poux en raison de la différence osmotique et la DO 600 doit être au moins dix fois inférieure à la valeur déterminée avant l’ajout de la liase xmal. Sinon, poursuivez l’incubation avec xmal liase pendant encore 15 minutes.

Suspendez à nouveau le PHE de Plast avec 100 millilitres de milieu de récupération et transférez la sphère de plast dans une fiole Helen Meyer. Incuber pendant une heure à 30 degrés Celsius en secouant. Cette étape de récupération est nécessaire car la traduction est arrêtée et la localisation de l’ARNm est perturbée pendant le traitement par XYs.

Après une heure, ajoutez 0,1 milligramme par millilitre, et transférez le Sphero plast dans des tubes coniques pré-refroidis de 50 millilitres. L’édition Cyclo Heide est importante pour geler l’association des ribosomes avec les ARNm. Ainsi, l’association de l’ARNm dépendante des ribosomes avec les mitochondries est maintenue.

Centrifugeuse, la sphère de plass à 3000 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et lavez-le deux fois avec du mannitol froid. Tampon reus.

Suspendez la sphère de plass avec quatre millilitres de tampon de manitol froid et transférez la suspension dans un homogénéisateur à duvet d’une capacité de 15 millilitres équipé d’un pilon bien ajusté. Cassez doucement la sphère de plass en 15 coups et transférez le lysat dans un tube de 13 millilitres. Centrifugez le lysat à 1 500 fois la gravité pendant six minutes à quatre degrés Celsius.

Pour granuler les noyaux et les cellules ininterrompues. Transférez soigneusement le super natin dans un nouveau tube. Réservez un millilitre ou 25 % de l’échantillon en tant qu’échantillon non fractionné ou total.

Transférez 50 microlitres de cet échantillon dans un nouveau tube et ajoutez 15 microlitres de quatre XLSB. Pour les analyses de sang dans l’Ouest, l’ARN sera précipité à partir du reste de l’échantillon total pour les analyses dans le Nord et les analyses sur puces. Centrifugez le super natin à 10 000 fois.

Gravité pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour granuler les mitochondries, transférez le super natin dans un nouveau tube et gardez-le sur de la glace. Il s’agit de la fraction cytosolique.

Transférez 50 microlitres de cet échantillon dans un nouveau tube et ajoutez 15 microlitres de quatre XLSB. Pour l’analyse par transfert Western, l’ARN sera précipité à partir du reste de l’échantillon cytosolique pour les analyses Northern et les analyses par microréseau. Lavez la pastille avec trois millilitres de mannitol, tamponnez et centrifugez à nouveau 10 000 fois.

Gravité pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Reus suspend le granulé avec trois millilitres de tampon à mannitol. Cet échantillon contient les mitochondries et est appelé fraction mitochondriale.

Transférez 50 microlitres de cet échantillon dans un nouveau tube et ajoutez 15 microlitres de quatre XLSB pour l’analyse par Western blot. Pour commencer cette procédure, ajoutez à chaque échantillon un volume de guadium à huit molaires, de HCEL et deux volumes de vortex d’éthanol à 100 % et incubez pendant au moins deux heures à moins 20 degrés Celsius. Centrifugez les échantillons à 10 000 fois la gravité pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Soyez prudent car la pastille peut être instable. Après avoir lavé le granulé avec 70 % d’éthanol, suspendez le granulé avec 400 microlitres d’eau libre d’ARN et transférez l’échantillon dans un nouveau tube einor.

Précipitez à nouveau l’ARN en ajoutant 0,1 volume de trois molaires d’acétate de sodium pH 5,2 et deux volumes de vortex d’éthanol à 100 % et incubez pendant au moins deux heures à moins 20 degrés Celsius. Centrifuger les échantillons à 20 000 fois. Gravité pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et lavez-le avec de l’éthanol à 70 %. Faites sécher la pastille à l’air libre et suspendez-la avec des ARN, de l’eau libre pour stocker l’ARN. Échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Les échantillons peuvent par la suite être utilisés pour des analyses nordiques ou des analyses de microréseaux. Pour préparer l’ARN à l’analyse sur microréseau, mettez d’abord en suspension chaque pastille d’ARNm obtenue à partir d’une précipitation de chlorhydrate de guin et d’éthanol avec 650 microlitres d’eau libre d’ARN et transférée dans un tube à bouchon à vis. Ajoutez ensuite 650 microlitres de phénol chloroforme acide et centrifugez vigoureusement à vitesse maximale pendant deux minutes.

Transférez 500 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Évitez de prendre l’interphase car elle contient de l’ADN. Attention également à ne pas prendre de phénol, qui peut inhiber la réaction de transcription inverse.

Éliminer l’héparine de l’échantillon d’ARN par précipitation de chlorure de lithium. Ajoutez du chlorure de lithium à une concentration finale de deux molaires et incubez les échantillons pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius le lendemain. Décongelez les échantillons à quatre degrés Celsius et centrifugez-les à 20 000 fois.

Gravité pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnageant et lavez la pastille avec une centrifugeuse à 80 % d’éthanol. Encore une fois, jetez le surnageant à l’air libre et remettez en suspension la pastille Dans 150 microlitres d’eau libre d’ARN pour éliminer tout chlorure de lithium résiduel précipitez à nouveau avec 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires pH 5,3 et trois volumes d’éthanol à 100 % incuber à moins 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures.

Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez soigneusement le granulé transparent avec de l’éthanol à 80 % et séchez-le à l’air. Enfin, remettez en suspension la pastille avec 25 microlitres d’eau libre d’ARN et maintenez les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Le succès de ce protocole dans la séparation d’une fraction contenant des mitochondries des composants cytosoliques est mieux testé en effectuant une analyse nord et une analyse occidentale sur des échantillons provenant des différentes étapes d’isolement. Dans cet exemple, les échantillons provenaient d’avant le fractionnement ou de la fraction totale, de la fraction cytosolique et de la fraction mitochondriale. Une analyse nordique a été effectuée pour les ARNm suivants, COB et ARN.

Celle-ci est transcrite à l’intérieur des mitochondries, A CO et ARNm qui code pour une protéine importée dans les mitochondries. Un CT, un Mr.Nna qui code pour la protéine d’actine cytosolique et SEC 61, un M nna qui code pour une protéine résidente du RE. Le panneau inférieur est une coloration au bleu de méthylène de la membrane nord où deux bandes proéminentes d’ARN 25 s et 18 s sont détectées.

Étant donné que COB est transcrit à l’intérieur des mitochondries, son signal devrait être exclusivement dans les mitochondries. Comme nous l’avons observé dans cette étude. L’apparition de COB dans la fraction cytosolique indiquera une lyse des mitochondries pendant la préparation.

ACO one code une protéine qui est importée dans les mitochondries et apparaît principalement dans la fraction mitochondriale. Un CT code pour une protéine cytosolique et apparaît donc principalement dans la fraction cytosolique. La présence de SEC 61 dans la fraction mitochondriale indique la présence de composants ER dans cette fraction.

Les signaux des ARN apparaissent dans les deux fractions, indiquant la présence de ribosomes. Une analyse Western a été effectuée pour les protéines suivantes : les mitochondries POR un, la protéine de membrane externe hx, la protéine K un A, la protéine cytosolique CUE one, la protéine ER et la protéine RPL 39. Une protéine ribosomique comme signal POR un attendu n’a été détectée que dans la fraction mitochondriale.

Si un signal POR était détecté dans la fraction cytosolique, cela suggérerait une dissociation des composants mitochondriaux pendant la préparation. De plus, comme prévu, hx K one n’a été détecté que dans la fraction cytosolique. Le signal fort CUE one dans la fraction mitochondriale indique que des quantités significatives de matériel lié au RE sont co-isolées dans la fraction mitochondriale.

Cela peut être le résultat des contacts physiques connus entre le RE et les mitochondries. Le signal RPL 39 apparaît dans les deux fractions, encore une fois, confirmant la présence de ribosomes dans les deux fractions, l’exclusion de l’étape de récupération de la procédure entraîne la disparition des ribosomes de la fraction M, ce qui affectera l’association de l’ARNm avec les mitochondries. En plus de vérifier la qualité de la séparation entre les composants mitochondriaux et cytosoliques, il est important de confirmer que l’ARN ou les protéines des échantillons sont intacts et qu’il n’y a pas de pertes importantes d’ARN ou de protéines lors de la préparation de l’échantillon.

L’ARN et les protéines intacts doivent être détectés comme des bandes distinctes dans les analyses, comme indiqué ici. Pour c CCP un ARNm, qui code pour une protéine importée dans les mitochondries, l’apparition de bandes plus courtes ou de frottis supplémentaires indiquera une dégradation. Des pertes importantes se traduiront par une différence significative entre la quantité totale et la quantité relative de signal, qui n’a pas été observée, prises ensemble.

Ces résultats valident ce protocole comme une méthode efficace pour l’isolement des ARNm, des ribosomes et des protéines en une seule procédure. À la suite de cette procédure, des méthodes à l’échelle du génome telles que le RNA-Seq ou l’analyse protéomique peuvent être effectuées afin d’identifier les caractéristiques clés et uniques des fonctions organiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’ARN associé aux mitochondries.