Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les mitochondries associées aux ARNm en cours de traduction. Cela est réalisé en premier lieu en récoltant des cellules de levure cultivées dans des conditions favorisant l'enrichissement mitochondrial. La deuxième étape consiste à lyser délicatement les cellules en présence de cycloheximide.

Ensuite, les mitochondries sont séparées des composants solubles par centrifugation différentielle. La dernière étape consiste en l'extraction de l'ARN à partir des mitochondries et des échantillons témoins. Enfin, une analyse northern est utilisée pour évaluer la pureté et la qualité de l'ARN associé aux mitochondries.

Le principal avantage de cette technique est que de nombreux types d'ARN peuvent être isolés lors d'une seule préparation. Une analyse comparative peut donc être réalisée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que le ciblage intracellulaire et la fonction des organites.

Dans cette procédure, les mitochondries seront purifiées à partir de 100 à 150 millilitres de cellules de levure cultivées jusqu'à une DO 600 comprise entre 1 et 1,5 à 30 degrés Celsius dans un milieu de croissance non fermentescible. Centrifuger les cellules à 3000 × g pendant cinq minutes à température ambiante, éliminer le surnageant et laver le culot avec de l'eau doublement distillée, puis centrifuger à nouveau.

Après avoir éliminé le surnageant, peser le culot cellulaire. Généralement, environ 0,6 gramme est obtenu à partir de 100 millilitres de cellules. Resuspendre le culot dans un millilitre de tampon DTT par 0,5 gramme de cellules.

Il est important de traiter les cellules avec un agent réducteur afin de rompre les liaisons disulfure au sein de la paroi cellulaire, améliorant ainsi l'hydrolyse ; incubez les cellules pendant 10 minutes à 30 degrés Celsius avec agitation douce. Ensuite, centrifugez les cellules à 3000 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et resuspendez le culot.

Dans un millilitre de tampon xmal liase par 0,15 gramme de cellules, ne pas vortexer. Mesurer la DO 600 d’un aliquot de 10 microlitres de cellules dans 990 microlitres d’eau et noter cette valeur. Ajouter de la xmal liase fraîchement préparée aux cellules afin d’hydrolyser les polymères de glucose au niveau des liaisons β-1,3-glucane et de générer des sphéroplastes.

À partir de ce point, les Sphero plast doivent être conservés dans une solution isotonique afin d'éviter la lyse ; incuber les cellules pendant 15 minutes à 30 degrés Celsius avec un léger agitation. Pour vérifier l'hydrolyse de la paroi cellulaire et la formation des sphéroplastes, mélanger 10 microlitres des cellules avec 990 microlitres d'eau et mesurer l'OD 600. Les sphéroplastes devraient lyser en raison de la différence osmotique, et l'OD 600 devrait être au moins dix fois inférieur à la valeur déterminée avant l'ajout de la xmal liase. Dans le cas contraire, poursuivre l'incubation avec la xmal liase pendant encore 15 minutes.

Ré-suspendre le PHE de Plast avec 100 millilitres de milieu de récupération et transférer la sphère de plast dans un flacon d’Helen Meyer. Incuber pendant une heure à 30 degrés Celsius sous agitation. Cette étape de récupération est nécessaire car la traduction est arrêtée et la localisation des ARNm est perturbée pendant le traitement XYs.

Après une heure, ajouter 0,1 milligramme par millilitre de cycloheximide et transférer les sphéroplastes dans des tubes coniques de 50 millilitres prérefroidis. L'ajout de cycloheximide est essentiel pour figer l'association des ribosomes avec les ARNm. Ainsi, l'association des ARNm aux mitochondries, dépendante des ribosomes, est préservée.

Centrifuger la sphère de plass à 3000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et laver deux fois avec du mannitol froid. Réutiliser le tampon.

Suspendez la sphère de plass dans quatre millilitres de tampon au mannitol froid et transférez la suspension dans un homogénéisateur à piston d'une capacité de 15 millilitres, équipé d'un pilon bien ajusté. Cassez délicatement la sphère de plass en effectuant 15 mouvements et transférez le lysat dans un tube de 13 millilitres. Centrifugez le lysat à 1 500 ×g pendant six minutes à quatre degrés Celsius.

Pour former un culot contenant les noyaux et les cellules intactes. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube. Mettez de côté un millilitre ou 25 % de l'échantillon comme échantillon non fractionné ou total.

Transférez 50 microlitres de cet échantillon dans un nouveau tube et ajoutez 15 microlitres de quatre XLSB. Pour l'analyse sanguine western, l'ARN sera précipité à partir du reste de l'échantillon total pour les analyses northern et par microarray. Faites centrifuger le surnageant à 10 000 ×g.

Centrifuger pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour former un culot de mitochondries, transférer le surnageant dans un nouveau tube et le garder sur glace. Cette fraction est la fraction cytosolique.

Transférez 50 microlitres de cet échantillon dans un nouveau tube et ajoutez 15 microlitres de quatre XLSB. Pour l'analyse par immunotransfert, l'ARN sera précipité à partir du reste de l'échantillon cytosolique destiné aux analyses par northern et par puces à ADN. Lavez le culot avec trois millilitres de tampon au mannitol et centrifugez à nouveau à 10 000 ×g.

Centrifuger pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Resuspendre le culot avec trois millilitres de tampon au mannitol. Cet échantillon contient les mitochondries et est appelé fraction mitochondriale.

Transférez 50 microlitres de cet échantillon dans un nouveau tube et ajoutez 15 microlitres de quatre XLSB pour l'analyse par immunotransfert. Pour commencer cette procédure, ajoutez à chaque échantillon un volume de huit molaire de guanidium, HCEL et deux volumes d'éthanol à 100 %, vortexez et incubez pendant au moins deux heures à moins 20 degrés Celsius. Centrifugez les échantillons à 10 000 fois la gravité pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Soyez prudent car le culot pourrait être instable. Après avoir lavé le culot avec de l'éthanol à 70 %, resuspendez le culot dans 400 microlitres d'eau exempte d'ARN et transférez l'échantillon dans un nouveau tube Eppendorf.

Précipitez à nouveau l'ARN en ajoutant 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et deux volumes d'éthanol à 100 %, vortexez et incubez au moins deux heures à moins 20 degrés Celsius. Centrifugez les échantillons à 20 000 × g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et lavez avec de l'éthanol à 70 %. Séchez le culot à l'air et resuspendez-le dans de l'eau exempte de RNAses. Conservez les échantillons d'ARN à moins 80 degrés Celsius.

Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour des analyses northern ou par puces à ADN. Pour préparer l'ARN en vue d'une analyse par puces à ADN, commencez par resuspendre chaque culot d'ARNm obtenu par précipitation à l'aide de guanidine HCl et d'éthanol dans 650 microlitres d'eau exempte de RNAses, puis transférez dans un tube à visser de type eend orph. Ajoutez ensuite 650 microlitres de phénol acide-chloroforme et vortexez vigoureusement avant de centrifuger à vitesse maximale pendant deux minutes.

Transférez 500 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Évitez de prélever la phase intermédiaire, car elle contient de l'ADN. Soyez également prudent pour ne pas prélever de phénol, qui peut inhiber la réaction de transcription inverse.

Éliminer l'héparine de l'échantillon d'ARN par précipitation au chlorure de lithium. Ajouter du chlorure de lithium jusqu'à une concentration finale de deux molaire et incuber les échantillons toute la nuit à moins 20 degrés Celsius le jour suivant. Décongeler les échantillons à quatre degrés Celsius et centrifuger à 20 000 fois.

Centrifuger pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter soigneusement le surnageant et laver le culot avec de l'éthanol à 80 %, puis centrifuger. Jeter à nouveau le surnageant, laisser sécher à l'air, puis redisperser le culot dans 150 microlitres d'eau exempte d'ARN afin d'éliminer tout précipité résiduel de chlorure de lithium. Précipiter à nouveau avec un volume égal à 0,1 volume d'acétate de sodium trois molaire à pH 5,3 et trois volumes d'éthanol à 100 %, puis incuber à moins 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures.

Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Laver soigneusement le culot transparent avec de l'éthanol à 80 % et sécher à l'air. Enfin, resuspendre le culot dans 25 microlitres d'eau exempte d'ARN et conserver les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Le succès de ce protocole dans la séparation d'une fraction contenant des mitochondries des composants cytosoliques est mieux évalué en réalisant une analyse northern et une analyse western sur des échantillons provenant des différentes étapes d'isolement. Dans cet exemple, les échantillons provenaient d'avant la fractionnation ou de la fraction totale, de la fraction cytosolique et de la fraction mitochondriale. Une analyse northern a été réalisée pour les ARNm suivants, COB un ARN.

Ce dernier est transcrit à l'intérieur des mitochondries, un ARNm CO1 qui code une protéine importée dans les mitochondries, un ARNm CT1 qui code la protéine d'actine cytosolique, et un ARNm SEC61 qui code une protéine résidente du réticulum endoplasmique. Le panneau inférieur montre une coloration au bleu de méthylène de la membrane du northern, où deux bandes marquées d'ARN, 25 S et 18 S, sont détectées.

Étant donné que COB est transcrit à l'intérieur des mitochondries, son signal devrait être exclusivement mitochondrial, comme observé dans cette étude. La présence de COB dans la fraction cytosolique indiquerait une lyse des mitochondries pendant la préparation.

ACO1 code une protéine qui est importée dans les mitochondries et apparaît principalement dans la fraction mitochondriale. CT1 code une protéine cytosolique et se retrouve donc surtout dans la fraction cytosolique. La présence de SEC61 dans la fraction mitochondriale indique la présence de composants du réticulum endoplasmique dans cette fraction.

Les signaux des ARN apparaissent dans les deux fractions, indiquant la présence de ribosomes. Une analyse western a été réalisée pour les protéines suivantes : POR1A mitochondriale, la protéine de membrane externe HXK1A, la protéine cytosolique CUE1 et la protéine du réticulum endoplasmique RPL39. Comme prévu, le signal de la protéine ribosomale POR1A n’a été détecté que dans la fraction mitochondriale.

Si un signal de POR était détecté dans la fraction cytosolique, cela suggérerait une dissociation de composants mitochondriaux au cours de la préparation. De plus, comme prévu, hx K un a été détecté uniquement dans la fraction cytosolique. Le signal intense de CUE un dans la fraction mitochondriale indique que des quantités importantes de matériel lié au réticulum endoplasmique sont co-isolées dans la fraction mitochondriale.

Cela pourrait être le résultat des contacts physiques connus entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries. Le signal de RPL 39 apparaît dans les deux fractions, confirmant à nouveau la présence de ribosomes dans les deux fractions. L'exclusion de l'étape de récupération dans le protocole entraîne la disparition des ribosomes de la fraction M, ce qui affectera l'association des ARNm avec les mitochondries. En plus de vérifier la qualité de la séparation entre les composants mitochondriaux et cytosoliques, il est important de confirmer que les ARN ou protéines présents dans les échantillons sont intacts et qu'il n'y a pas de pertes importantes d'ARN ou de protéines durant la préparation des échantillons.

Les ARN et protéines intacts doivent être détectés sous forme de bandes distinctes lors des analyses, comme illustré ici. Pour l'ARNm de CCP, qui code une protéine importée dans les mitochondries, l'apparition de bandes supplémentaires plus courtes ou de traînées indiquera une dégradation. Des pertes importantes entraîneraient une différence significative entre la quantité totale et la quantité relative du signal, ce qui n'a pas été observé globalement.

Ces résultats valident ce protocole comme une méthode efficace pour l'isolement des ARNm, des ribosomes et des protéines en une seule procédure. Après cette procédure, des méthodes à l'échelle du génome telles que le RNA-Seq ou l'analyse protéomique peuvent être réalisées afin d'identifier les caractéristiques clés et uniques des fonctions organellaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler l'ARN associé aux mitochondries.