L'impression submergé de cellules sur une surface modifiée à l'aide d'un flux continu Microspotter

L’objectif global de cette procédure est d’imprimer trois fibroblastes T trois sur une surface recouverte de sérum. Ceci est accompli par le premier sérum pré-adsorbé sur une surface de culture tissulaire. La deuxième étape consiste à imprimer une suspension de fibroblastes sur la surface à l’aide d’un micro-observateur à flux continu, suivie d’une incubation des cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, des cellules imprimées ainsi que des cellules ensemencées par culture cellulaire standard sont colorées à l’iodure de propidium et visualisées au microscope inversé à des fins de comparaison. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour évaluer la viabilité, la densité et la morphologie des cellules à des moments pertinents. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’impression par épingle est que la tête d’impression forme un joint sur la surface, ce qui permet d’imprimer des cellules immergées dans des supports cellulaires.

Alors que l’impression submergée de cellules est utile pour tester l’innocuité et l’efficacité de nouveaux candidats médicaments, l’impression submergée en général est également utile pour d’autres applications. Par exemple, nous pouvons analyser de nouveaux candidats médicaments par rapport à des tranches de tissus, ou nous pouvons les utiliser comme modèle pour des systèmes d’organes. Par exemple, un modèle de profusion hépatique.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à le faire, car lors de l’amorçage de l’imprimante et de l’impression cellulaire, l’air ne peut pas pénétrer dans les lignes ou peut provoquer la mort cellulaire. Pour commencer, décongelez trois cellules NIH T trois pendant deux à trois minutes dans un bain d’eau agitée à 37 degrés Celsius. Remettre les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu complet et centrifuger à 1500 G pendant trois minutes.

Retirez le surnageant cellulaire sans perturber la pastille cellulaire. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de fluide et transférez 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un microtube à centrifuger de 0,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de triam blue dans la suspension cellulaire et mélangez avec la pointe de la pipette 10 microlitres des cellules colorées dans une chambre d’hémocytomètre.

Avant de compter les cellules à un grossissement de 10 x, comptez les cellules vivantes qui ressemblent à de petites boules blanches pour quatre des neuf grands carrés. Ne comptez que les cellules vivantes qui n’apparaissent pas en bleu foncé à cause de la coloration bleu trippen. Calculez le nombre moyen de cellules par grand carré, ce qui donne le nombre de cellules multiplié par 10 000 cellules par millilitre dans la suspension de cellules d’origine.

Ensuite, ensemencez des cellules à une densité de 100 000 cellules par millilitre avec un total de cinq millilitres dans chaque fiole T 25. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une aisance comprise entre 70 et 80 % avant de commencer les expériences. Pour préparer la surface d’impression, utilisez un marqueur pour marquer un rectangle de la taille de la tête d’impression au bas d’un polystyrène 12 traité pour culture tissulaire.

Pipette à plaque de 50 microlitres de sérum de veau fœtal dans la zone rectangulaire et étalez-la sur toute la région. Avec l’embout, laissez la plaque de puits dans une cagoule de biosécurité stérile pendant la nuit pour permettre à la tache sérique de sécher complètement. Pour commencer l’impression immergée, rincez la tête d’impression à l’eau distillée.

Remplissez ensuite une boîte de Pétri de 60 millimètres avec de l’eau distillée et fixez la tête d’impression sur l’eau distillée à flux de surface à travers chacune des lignes pendant deux minutes à 150 microlitres par minute à l’aide d’une pompe pneumatique. Ensuite, jetez l’eau de la boîte de Pétri et remplissez-la d’eau propre. Ensuite, déplacez la tête d’impression de haut en bas dans l’eau trois fois.

Ancrez le centre de la tête d’impression sur l’endroit enduit de sérum dans la plaque à 12 puits pré-préparée. Ensuite, amorcez la tête d’impression avec Prewarm. Média complet à 300 microlitres par canal.

Si vous effectuez plusieurs impressions, ajoutez un rinçage à l’eau de Javel en plus du rinçage à l’eau entre les impressions. Procédez à l’impression des cellules suspendues à une concentration de 50 000 cellules par millilitre sur la surface et à 60 microlitres par minute. 100 microlitres par canal.

Après l’impression cellulaire, placez la tête d’impression laissée contre la surface et le collecteur dans un incubateur de culture cellulaire. Réglez à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après les deux heures d’incubation, retirez la tête d’impression et placez le couvercle sur la boîte de culture.

Le moment où la tête d’impression est retirée est considéré comme le point zéro heure. À titre de comparaison, une culture cellulaire standard est également effectuée. Ajoutez un millilitre de milieu préchauffé à l’une des plaques à 12 puits de sérum, puis prenez un millilitre de la suspension cellulaire restante et pipetez-la dans un seul puits de la plaque à 12 puits.

Cela produira une culture contenant 50 000 cellules dans la boîte. Placez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation de deux heures, commencer à chronométrer pour assurer l’uniformité entre les échantillons imprimés et les échantillons d’ensemencement.

Ceci est considéré comme le point de temps de l’heure zéro. Après 0, 2, 24 et 48 heures, préparez les cellules de chacune des deux méthodes pour l’imagerie par coloration à l’iodure de propidium, qui n’est incorporé que dans le noyau des cellules mortes. Tout d’abord, rincez doucement les cellules trois fois avec un millilitre de solution saline soufflée de phosphate avec du calcium et du magnésium pour éliminer tous les débris.

Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de culture préchauffé dans chaque récipient de culture, puis un microlitre d’iodure de propidium. Incuber les cellules colorées à l’iodure de propidium à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avant d’imager les cellules à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 10 x et 40 x. Enfin, jetez les cellules dans un récipient approprié pour les matières biologiques.

La lignée cellulaire de fibroblastes, NIH trois T, trois cellules ont été imprimées ou ensemencées sur une surface immergée. Après l’impression et l’ensemencement, les cellules ont été visualisées pour évaluer la densité et la morphologie à des moments pertinents. Les images ont montré que les cellules possèdent des phénotypes presque identiques à chaque point temporel et à chaque grossissement.

Sur la base de ces chiffres, il a été déterminé que l’impression effective était minimale. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’un colorant à l’iodure de propidium et a révélé que la viabilité des cellules imprimées n’était pas significativement différente de celle des cellules assises pour chaque point temporel. La principale différence entre les deux méthodes de fixation des cellules à la surface est la densité des cellules.

La densité des cellules imprimées diminue de plus de 50 % au bout de deux heures, tant dans les cellules assises qu’imprimées. D’autres études sont nécessaires pour déterminer la cause de cette diminution. Cependant, les rapports de densité globaux imprimés par rapport aux semis restent nettement plus élevés.

La densité des cellules imprimées dans la cellule d’écoulement était environ 10 fois plus dense à chaque point temporel que les cellules ensemencées, étant donné que les cellules ont été imprimées à la même densité que l’ensemencement, mais dans une zone plus petite. Au dernier moment, les cellules ont la même densité, ce qui est probablement dû à la motilité cellulaire et aux limitations de consommation de ressources. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la découverte de médicaments pour étudier les effets de la toxicité et de l’efficacité des médicaments sur les cellules et le cancer, le sida, les maladies cardiaques et d’autres domaines à forte demande.

En utilisant l’impression cellulaire submergée en conjonction avec d’autres technologies telles que l’adhésion, l’adhésion cellulaire programmable, nous pouvons étendre la portée de la technique aux cellules en suspension pour la découverte de médicaments élargis et le criblage du développement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une solide compréhension de la façon d’imprimer des cellules à l’aide de notre technique d’impression submergée.