L'impression submergé de cellules sur une surface modifiée à l'aide d'un flux continu Microspotter

L'objectif général de cette procédure est d'imprimer des fibroblastes T3 sur une surface revêtue de sérum. Cette opération s'effectue en pré-adsorbant d'abord du sérum sur une surface de culture tissulaire. La deuxième étape consiste à imprimer une suspension de fibroblastes sur la surface à l'aide d'un micro-dispenseur à flux continu, suivie d'une incubation des cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, les cellules imprimées ainsi que les cellules semées par culture cellulaire standard sont colorées avec de l'iodure de propidium et observées au microscope inversé pour comparaison. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour évaluer la viabilité, la densité et la morphologie cellulaire à des points temporels pertinents. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'impression par broche est que la tête d'impression forme un joint étanche sur la surface, permettant ainsi d'imprimer les cellules tout en les maintenant immergées dans le milieu cellulaire.

Bien que l'impression immergée de cellules soit utile pour tester la sécurité et l'efficacité de nouveaux candidats médicaments, cette technique est également applicable à d'autres usages. Par exemple, nous pouvons analyser de nouveaux candidats médicaments sur des tranches de tissus, ou l'utiliser comme modèle de systèmes organiques. Par exemple, un modèle de perfusion hépatique.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car lors du préparation de l'imprimante et de l'impression cellulaire, l'air ne doit pas pénétrer dans les conduits, au risque d'entraîner la mort cellulaire. Commencez par décongeler les cellules NIH trois T trois pendant deux à trois minutes dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius. Remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu complet et centrifugez à 1500 Gs pendant trois minutes.

Retirez le surnageant cellulaire sans perturber le culot cellulaire. Ensuite, resuspendez les cellules dans cinq millilitres de milieu et transférez 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre. Ajoutez ensuite 10 microlitres de bleu de trypan à la suspension cellulaire et mélangez à l’aide de la pointe de la pipette ; pipetez 10 microlitres des cellules colorées dans une chambre de cytomètre sanguin.

Avant de compter les cellules à un grossissement de 10 x, comptez les cellules vivantes, qui ressemblent à de petites boules blanches, dans quatre des neuf grands carrés. Ne comptez que les cellules vivantes qui n'apparaissent pas bleu foncé en raison de la coloration au bleu de tripan. Calculez le nombre moyen de cellules par grand carré, ce qui donne le nombre de cellules multiplié par 10 000 cellules par millilitre dans la suspension cellulaire initiale.

Ensuite, ensemencez les cellules à une densité de 100 000 cellules par millilitre, pour un volume total de cinq millilitres dans chaque flacon T25. Incubez les cellules jusqu'à atteindre une confluence comprise entre 70 et 80 % avant de commencer les expériences. Pour préparer la surface d'impression, utilisez un marqueur pour délimiter un rectangle de la taille de la tête d'impression sur le fond d'une plaque en polystyrène traité pour culture tissulaire 12.

À l’aide d’une pipette, déposer 50 microlitres de sérum de veau fœtal dans la zone rectangulaire et l’étaler sur toute la région. À l’aide de la pointe, laisser la plaque de culture dans une hotte de sécurité biologique stérile toute la nuit pour permettre au dépôt de sérum de sécher complètement. Pour commencer l’impression en immersion, rincer la tête d’impression avec de l’eau distillée.

Ensuite, remplir une boîte de Pétri de 60 millimètres avec de l'eau distillée et amarrer la buse d'impression à la surface, puis faire circuler de l'eau distillée à travers chacune des lignes pendant deux minutes à 150 microlitres par minute à l'aide d'une pompe pneumatique. Puis, jeter l'eau de la boîte de Pétri et la remplir avec de l'eau propre. Ensuite, déplacer la buse d'impression vers le haut et vers le bas dans l'eau trois fois.

Positionnez le centre de la tête d'impression au-dessus du point recouvert de sérum dans la plaque de 12 puits préparée. Ensuite, amorcez la tête d'impression avec 300 microlitres par canal de milieu complet préchauffé.

Si plusieurs impressions sont effectuées, ajouter un rinçage à l'eau de Javel en plus du rinçage à l'eau entre chaque impression. Procéder à l'impression des cellules en suspension à une concentration de 50 000 cellules par millilitre sur la surface, à raison de 60 microlitres par minute et de 100 microlitres par canal.

Après l'impression cellulaire, placez la tête d'impression à gauche, arrimée contre la surface, et le collecteur dans une étuve à culture cellulaire. Réglez à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après cette incubation de deux heures, retirez la tête d'impression et placez le couvercle sur la boîte de culture.

Le moment où on retire la tête d'impression est considéré comme le point temporel zéro. À titre de comparaison, une culture cellulaire standard est également réalisée. Ajoutez un millilitre de milieu préchauffé dans l'un des puits de la plaque 12 puits ayant des taches de sérum, puis prélèvez un millilitre de la suspension cellulaire restante et pipetez-le dans un seul puits de la plaque 12 puits.

Cela permettra d'obtenir une culture contenant 50 000 cellules dans la boîte. Placer la plaque de culture cellulaire dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l'incubation de deux heures, commencer le chronométrage afin d'assurer la cohérence entre les échantillons imprimés et ensemencés.

Ce moment est considéré comme le point zéro de l'heure. Après 0, 2, 24 et 48 heures, préparez les cellules provenant de chacune des deux méthodes pour l'imagerie en les colorant avec de l'iodure de propidium, qui n'est incorporé que dans le noyau des cellules mortes. Tout d'abord, rincez délicatement les cellules trois fois avec un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate contenant du calcium et du magnésium afin d'éliminer tous les débris.

Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de culture préchauffé dans chaque récipient de culture, puis un microlitre d'iodure de propidium. Incubez la solution stock des cellules marquées à l'iodure de propidium à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avant d'observer les cellules au microscope inversé avec des grossissements de 10 x et 40 x. Enfin, éliminez les cellules dans un contenant approprié pour déchets biologiques.

La lignée cellulaire de fibroblastes, les cellules NIH trois T trois, a été imprimée ou ensemencée sur une surface immergée. Après l’impression et l’ensemencement, les cellules ont été visualisées afin d’évaluer leur densité et leur morphologie aux points temporels pertinents. Les images ont montré que les cellules présentent des phénotypes presque identiques à chaque point temporel et à chaque grossissement.

Sur la base de ces données, l'impression effective s'est révélée minimale. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'une coloration par l'iodure de propidium, qui a montré que la viabilité des cellules imprimées n'était pas significativement différente de celle des cellules ensemencées à chaque point temporel. La principale différence entre les deux méthodes d'attachement des cellules à la surface réside dans la densité des cellules.

La densité des cellules imprimées diminue de plus de 50 % au point temporel de deux heures, tant pour les cellules ensemencées que pour les cellules imprimées. Une étude plus approfondie est nécessaire pour déterminer la cause de cette diminution. Toutefois, les rapports globaux de densité imprimée restent significativement plus élevés par rapport à ceux des cellules ensemencées.

La densité cellulaire imprimée dans la chambre d'écoulement était environ 10 fois plus élevée à chaque point temporel que celle des cellules semées, étant donné que les cellules étaient imprimées à la même densité que lors du semis, mais dans une zone plus petite. Au dernier point temporel, les cellules présentent une densité identique, ce qui est probablement dû à la mobilité cellulaire et aux limitations liées à la consommation de ressources. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans des domaines tels que la découverte de médicaments, leur permettant d'étudier les effets de la toxicité et de l'efficacité des médicaments sur les cellules, ainsi que dans les domaines à forte demande comme le cancer, les maladies cardiaques et d'autres pathologies.

En utilisant l'impression de cellules immergées en combinaison avec d'autres technologies telles que l'adhérence cellulaire programmable, nous pouvons étendre la portée de cette technique aux cellules en suspension, afin de permettre des criblages élargis dans la découverte et le développement de médicaments. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension solide de la manière d'imprimer des cellules à l'aide de notre technique d'impression sous eau.