Name: Limpression submergé de cellules sur une surface modifiée à laide dun flux continu Microspotter (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Apprenez l'impression submergée de fibroblastes NIH 3T3 sur surface enduite de sérum à l'aide d'un microspotter à flux continu. Cette technique améliore le criblage de médicaments et l'évaluation de la cytotoxicité.

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Les auteurs tiennent à remercier Chris Morrow pour l&#39;assistance technique. Le financement a été fourni par le NIH SBIR (R43) accordent 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

1. Culture cellulaire Préparation <ol><li> Stocker les stocks de cellules NIH/3T3 dans l&#39;azote liquide jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer un milieu complet pour cellules NIH/3T3 à l&#39;aide du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 10 mM de tampon HEPES, 50 unités / ml de pénicilline, et 50 pg / ml de streptomycine. </li><li> Décongeler les cellules pour 2-3 min dans un bain d&#39;eau sous agitation à 37 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu complet et centrifuger à 1500 g pendant 3 min. </li><li> Retirer le surnageant de cellule, sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu et compter les cellules en utilisant un hématimètre. <ol><li> Retirer 10 pi de la suspension cellulaire et le placer dans un tube à centrifuger de 0,5 ml. </li><li> Ajouter 10 ul de bleu trypan à la suspension de cellules et les mélanger avec le bout de la pipette. </li><li> Introduire à la pipette 10 ul de cellules colorées dans une chambre d&#39;hémocytomètre. </li><li> Compter les cellules en hématimètre à 10xgrossissement. <ol><li> Compter les cellules vivantes (petites boules blanches) pour 4 des 9 grands carrés. Compter que les cellules vivantes qui ne semblent pas bleu foncé de la tache bleu Trypan. </li><li> Calculer le nombre moyen de cellules par grande place, résultant du nombre de cellules x 10 4 cellules / ml dans la suspension de cellules d&#39;origine. </li><li> cellules de semences à une densité de 1 x 10 5 cellules / ml avec un total de 5 ml dans chaque flacon T25. </li></ol></li><li> Culture de cellules à entre 70% et 80% de confluence avant commençant expériences. Actualiser les médias tous les 2-3 jours ou au besoin. </li></ol></li></ol> 2. Impression Préparation de la surface <ol><li> Marquer un rectangle avec le marqueur sur le fond d&#39;une culture traitée du tissu polystyrène (TCTPS) 12 de la plaque ainsi la taille de la tête d&#39;impression (7 mm x 19 mm). </li><li> Ajouter 50 ul de sérum de veau foetal dans la zone rectangulaire et l&#39;étaler sur toute la région de la pointe. </li><li> Laissez la boîte de Pétridans un stérile biosécurité capot O / N pour permettre au lieu de sérum sécher complètement. Ces plaques doivent être préparés à pas plus de 2 jours avant l&#39;utilisation. </li></ol> 3. Impression immergé <ol><li> Rincer la tête d&#39;impression avec de l&#39;eau distillée. <ol><li> Remplissez une boîte de Pétri de 60 mm avec de l&#39;eau distillée et ancrer la tête d&#39;impression sur la surface. </li><li> Couler de l&#39;eau distillée à travers chacune des lignes pendant 2 minutes à 150 pl / min en utilisant une pompe pneumatique. </li><li> Jeter l&#39;eau de la boîte de Pétri et le remplir avec de l&#39;eau propre. </li><li> Déplacez la tête d&#39;impression de haut en bas dans l&#39;eau 3 fois. </li></ol></li><li> Ancrer le centre de la tête d&#39;impression sur la place de sérum revêtue de la plaque 12 et pré-établi. </li><li> Amorcer le tête d&#39;impression avec les médias complets pré-chauffées, 300 pl par canal. </li><li> Imprimer des cellules en suspension à une concentration de 50 000 cellules / ml sur la surface et 60 ul / min, 100 ul par canal. </li><li> Placez la tête d&#39;impression, à gauche amarré contre lasurface, et le collecteur dans un incubateur de culture cellulaire défini à 5% de CO 2 et 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Après l&#39;incubation de 2 heures, retirer la tête d&#39;impression et placez le couvercle sur la boîte de culture. Le moment où la tête d&#39;impression retirée est considéré comme le point de temps 0 h. </li></ol> 4. Portable standard Culture <ol><li> Ajouter 1 ml de milieu préchauffées à une de la plaque TCTPS 12 puits de sérum repéré préparé à l&#39;étape 2. </li><li> Prélever 1 ml de la suspension cellulaire restant de l&#39;étape 2 à la pipette dans un seul puits d&#39;une 12 bien TCTPS plaque. Ceci va produire une culture contenant 50 000 cellules dans le plat. </li><li> Placer la plaque de culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Après l&#39;incubation de 2 h commencer le chronométrage; la cohérence entre les échantillons imprimés et semis, cela est considéré comme le point de temps 0 h. </li></ol> 5. Culture Visualisation <ol><li> Après 0, 2, 24, et 48 h cellules de prendre de chacune des deux méthodes described ci-dessus et de l&#39;image en utilisant un microscope inversé standard. <ol><li> Colorer les cellules en utilisant l&#39;iodure de propidium, un colorant fluorescent rouge qui est seulement incorporée dans le noyau des cellules mortes. <ol><li> Rincer délicatement les cellules 3 fois avec 1 ml de tampon phosphate salin avec le calcium et le magnésium (PBS + +) pour enlever les débris. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS + + préchauffée à chaque récipient de culture. </li><li> Ajouter 1 ul d&#39;une solution d&#39;iodure de propidium stock (1 mg / ml) pour chaque récipient de culture. </li><li> Incuber les cellules colorées avec de l&#39;iodure de propidium à 37 ° C pendant 10 min. </li></ol></li><li> L&#39;image des cellules en utilisant un microscope inversé à 10x et 40x. </li></ol></li><li> Jeter les cellules dans un container prévu appropriée. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs sont des employés et actionnaires de Wasatch microfluidique qui produit des réactifs et / ou des instruments utilisés dans ce manuscrit.

La technologie d&#39;impression 3D microfluidique décrit ici est le seul à pouvoir impression microfluidically réseaux de cellules dans un liquide bien remplie, c&#39;est à dire une surface immergée. En imprimant sur ​​les surfaces immergées, puces à cellules peuvent être produites qui maintiennent le phénotype cellulaire physiologiquement pertinente de cellules ainsi que la possibilité de multiplexer les cellules dans le fond d&#39;un puits unique figure 4. Les résultats de cette étude montren...

Les progrès récents dans l&#39;industrie pharmaceutique ont conduit à un intérêt accru pour l&#39;aide puces cellulaires dans le processus de découverte de médicaments pour le dépistage des drogues et de l&#39;analyse cytotoxicological 1,2,3. Le développement de tests in vitro à haut débit et les méthodes de dépistage à l&#39;aide de puces à cellules devrait faciliter le développement rapide et rentable de candidats-médicaments ainsi que l&#39;avance la compréhension fondamentale de la cellule 1,4. L&#39;approche traditionnelle de dépistage avec des cellules utilise des plates-formes et de plaques conventionnelles; Cependant cette approche est limitée en raison du coût élevé, le débit limité, et la capacité limitée d&#39;informations quantitatives sur la fonction des cellules 1,5. En raison de ces limitations, la recherche dans les technologies de puces à ADN cellulaire est en plein essor pour la caractérisation moléculaire biologique, l&#39;ingénierie tissulaire, et le dépistage de drogue 1,6. Les avantages de puces cellulaires comprennent l&#39;utilisation réduite de l&#39;échantillon, des effets minimes dephénotype cellulaire hétérogénéité masquage des informations, et surtout la possibilité d&#39;automatiser des tests pour d&#39;autres applications à haut débit 1,7,8. L&#39;industrie pharmaceutique utilise actuellement à haut débit des essais de criblage à base de cellules avec 2D cultures monocouches de cellules pour le criblage de médicaments dans des plaques de microtitration 9. Cellules de multiplexage dans les puits de plaques de microtitration offre la possibilité pour un débit plus élevé avec des options d&#39;expérimentation uniques. En outre, les technologies actuelles de microarrays cellulaires permettent de sécher les cellules, qui pourrait modifier radicalement le phénotype des cellules in vivo à partir de 10,11. Afin de surmonter ces problèmes, le MFCA a été conçu et est représenté sur la figure 1. La conception de la fluidique MFCA 3D permet à la pointe de la tête d&#39;impression sur la figure 1 pour être descendu dans un bain et comprimé contre une surface pour former un joint. La pointe en silicone souple de la tête d&#39;impression se comporte comme unjoint d&#39;étanchéité et forme un joint réversible. La technologie MFCA est particulièrement bien adapté pour l&#39;interface avec les surfaces immergées, qui est nécessaire à la fois pour les cultures de cellules et des systèmes de découpe du tissu, et il est difficile, voire impossible, avec la plupart des autres approches. Pins ou l&#39;impression à jet d&#39;encre ne fonctionnera pas, et des dispositifs microfluidiques 2D ne sont pas adaptés pour le dépôt ou l&#39;interfaçage avec les grands réseaux de points discrets. En outre, par la miniaturisation et la localisation de l&#39;expérience - la puce à ADN cellulaire - la MFCA surmonte les problèmes majeurs associés à haut débit avec des essais de criblage à base de cellules. Le CFM utilise des réseaux de canaux 3D à vélo de petits échantillons de fluide de volume sur les emplacements ponctuels microscopiques sur une surface 12,13. En imprimant avec écoulement, des biomolécules, des cellules, et d&#39;autres réactifs sont maintenus dans un milieu liquide pendant tout le processus d&#39;impression, ce qui permet l&#39;impression des biomolécules et des cellules sensibles sans exposition à l&#39;air, ce qui empêche les techniques d&#39;impression actuelles de la cellule. Il est également possible d&#39;imprimer directement à partir d&#39;un matériau brut comme hybridome ou surnageants fournis il ya un mécanisme de capture sur la surface du tableau. L&#39;objectif de ce manuscrit est d&#39;expliquer en détail l&#39;impression submergé de deux types de cellules sur une surface.

<table><tbody><tr><td>Microspotter à flux continu</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Dubbleco’s Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Milieu de base pour cellules</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Additif de milieu cellulaire (contrôle du pH)</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>Additif pour milieux cellulaires</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Additif de milieu cellulaire</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Cellule de coloration pour le comptage</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Chambre cellulaire pour le comptage des cellules</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>Nikon</td><td></td><td>Utilisé pour le contrôle des cellules</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>Utilisé pour la collecte d’images</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (avec du calcium et du magnésium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>Rincer les cellules avant le passage et avant la coloration avec PI</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>Utilisé pour retirer les cellules de la surface</td></tr></tbody></table>

l&#39;impression submergé de cellules sur une surface modifiée à l&#39;aide d&#39;un flux continu microspotter

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

L’impression de cellules pour des applications de puces à ADN présente des défis importants, notamment le problème de maintenir un phénotype cellulaire physiologiquement pertinent après l’impression, une mauvaise organisation et distribution des cellules souhaitées et l’incapacité à délivrer des médicaments et/ou des nutriments dans des zones ciblées de la puce. Notre technologie d’impression microfluidique 3D est capable de sceller et d’imprimer des réseaux de cellules sur des surfaces immergées de manière automatisée et multiplexée. La conception de la fluidique 3D du réseau de cellules microfluidiques (MFCA) permet d’abaisser la pointe de la tête d’impression dans un puits ou un plat rempli de liquide et de la compresser contre une surface pour former un joint. L’embout en silicone souple de la tête d’impression se comporte comme un joint d’étanchéité et est capable de former un joint réversible en appliquant une pression ou en reculant. D’autres technologies d’impression de cellules, telles que les imprimantes à broche ou à jet d’encre, ne peuvent pas imprimer dans des applications immergées. L’impression de surface submergée est essentielle pour maintenir les phénotypes des cellules et pour surveiller ces cellules sur une surface sans perturber les caractéristiques de surface du matériau. En imprimant sur des surfaces immergées, des microréseaux cellulaires sont produits qui permettent le dépistage de médicaments et l’évaluation de la cytotoxicité dans une multitude de domaines, notamment le cancer, le diabète, l’inflammation, les infections et les maladies cardiovasculaires.

Les cellules NIH/3T3 de lignées cellulaires de fibroblastes ont été imprimées ou ensemencées sur une surface immergée. Les cellules ont été cultivées à une densité de 5 x 10 4 cellules par ml. Les cellules ont été ensemencées en utilisant des techniques de culture cellulaire classiques. Les cellules ont été imprimées à l&#39;aide d&#39;un grand format, douze flux de tête d&#39;impression de la cellule où les canaux sont plus grands (~ 500 um) de la CFM utilisé pour des protéines et d&#39;autres biomolécules. ...

Cette technologie d’impression microfluidique 3D imprime des réseaux de cellules sur des surfaces immergées. Nous décrivons comment des réseaux de cellules sont délivrés de manière microfluidique dans des cellules d’écoulement 3D sur des surfaces immergées. En imprimant sur des surfaces immergées, des microréseaux cellulaires ont été produits qui permettent le dépistage de médicaments et l’évaluation de la cytotoxicité dans une multitude de domaines.

L&#39;impression submergé de cellules sur une surface modifiée à l&#39;aide d&#39;un flux continu Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

L'objectif général de cette procédure est d'imprimer des fibroblastes T3 sur une surface revêtue de sérum. Cette opération s'effectue en pré-adsorbant d'abord du sérum sur une surface de culture tissulaire. La deuxième étape consiste à imprimer une suspension de fibroblastes sur la surface à l'aide d'un micro-dispenseur à flux continu, suivie d'une incubation des cellules à 37 degrés Celsius pendant deux heures.Ensuite, les cellules imprimées ainsi que les cellules semées par culture cellulaire standard sont colorées avec de l'iodure de propidium et observées au microscope inversé pour comparaison. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour évaluer la viabilité, la densité et la morphologie cellulaire à des points temporels pertinents. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'impression par broche est que la tête d'impression forme un joint étanche sur la surface, permettant ainsi d'imprimer les cellules tout en les maintenant immergées dans le milieu cellulaire.Bien que l'impression immergée de cellules soit utile pour tester la sécurité et l'efficacité de nouveaux candidats médicaments, cette technique est également applicable à d'autres usages. Par exemple, nous pouvons analyser de nouveaux candidats médicaments sur des tranches de tissus, ou l'utiliser comme modèle de systèmes organiques. Par exemple, un modèle de perfusion hépatique.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car lors du préparation de l'imprimante et de l'impression cellulaire, l'air ne doit pas pénétrer dans les conduits, au risque d'entraîner la mort cellulaire. Commencez par décongeler les cellules NIH trois T trois pendant deux à trois minutes dans un bain-marie agité à 37 degrés Celsius. Remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu complet et centrifugez à 1500 Gs pendant trois minutes.Retirez le surnageant cellulaire sans perturber le culot cellulaire. Ensuite, resuspendez les cellules dans cinq millilitres de milieu et transférez 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre. Ajoutez ensuite 10 microlitres de bleu de trypan à la suspension cellulaire et mélangez à l’aide de la pointe de la pipette ; pipetez 10 microlitres des cellules colorées dans une chambre de cytomètre sanguin.Avant de compter les cellules à un grossissement de 10 x, comptez les cellules vivantes, qui ressemblent à de petites boules blanches, dans quatre des neuf grands carrés. Ne comptez que les cellules vivantes qui n'apparaissent pas bleu foncé en raison de la coloration au bleu de tripan. Calculez le nombre moyen de cellules par grand carré, ce qui donne le nombre de cellules multiplié par 10 000 cellules par millilitre dans la suspension cellulaire initiale.Ensuite, ensemencez les cellules à une densité de 100 000 cellules par millilitre, pour un volume total de cinq millilitres dans chaque flacon T25. Incubez les cellules jusqu'à atteindre une confluence comprise entre 70 et 80 % avant de commencer les expériences. Pour préparer la surface d'impression, utilisez un marqueur pour délimiter un rectangle de la taille de la tête d'impression sur le fond d'une plaque en polystyrène traité pour culture tissulaire 12.À l’aide d’une pipette, déposer 50 microlitres de sérum de veau fœtal dans la zone rectangulaire et l’étaler sur toute la région. À l’aide de la pointe, laisser la plaque de culture dans une hotte de sécurité biologique stérile toute la nuit pour permettre au dépôt de sérum de sécher complètement. Pour commencer l’impression en immersion, rincer la tête d’impression avec de l’eau distillée.Ensuite, remplir une boîte de Pétri de 60 millimètres avec de l'eau distillée et amarrer la buse d'impression à la surface, puis faire circuler de l'eau distillée à travers chacune des lignes pendant deux minutes à 150 microlitres par minute à l'aide d'une pompe pneumatique. Puis, jeter l'eau de la boîte de Pétri et la remplir avec de l'eau propre. Ensuite, déplacer la buse d'impression vers le haut et vers le bas dans l'eau trois fois.Positionnez le centre de la tête d'impression au-dessus du point recouvert de sérum dans la plaque de 12 puits préparée. Ensuite, amorcez la tête d'impression avec 300 microlitres par canal de milieu complet préchauffé.Si plusieurs impressions sont effectuées, ajouter un rinçage à l'eau de Javel en plus du rinçage à l'eau entre chaque impression. Procéder à l'impression des cellules en suspension à une concentration de 50 000 cellules par millilitre sur la surface, à raison de 60 microlitres par minute et de 100 microlitres par canal.Après l'impression cellulaire, placez la tête d'impression à gauche, arrimée contre la surface, et le collecteur dans une étuve à culture cellulaire. Réglez à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après cette incubation de deux heures, retirez la tête d'impression et placez le couvercle sur la boîte de culture.Le moment où on retire la tête d'impression est considéré comme le point temporel zéro. À titre de comparaison, une culture cellulaire standard est également réalisée. Ajoutez un millilitre de milieu préchauffé dans l'un des puits de la plaque 12 puits ayant des taches de sérum, puis prélèvez un millilitre de la suspension cellulaire restante et pipetez-le dans un seul puits de la plaque 12 puits.Cela permettra d'obtenir une culture contenant 50 000 cellules dans la boîte. Placer la plaque de culture cellulaire dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l'incubation de deux heures, commencer le chronométrage afin d'assurer la cohérence entre les échantillons imprimés et ensemencés.Ce moment est considéré comme le point zéro de l'heure. Après 0, 2, 24 et 48 heures, préparez les cellules provenant de chacune des deux méthodes pour l'imagerie en les colorant avec de l'iodure de propidium, qui n'est incorporé que dans le noyau des cellules mortes. Tout d'abord, rincez délicatement les cellules trois fois avec un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate contenant du calcium et du magnésium afin d'éliminer tous les débris.Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de culture préchauffé dans chaque récipient de culture, puis un microlitre d'iodure de propidium. Incubez la solution stock des cellules marquées à l'iodure de propidium à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avant d'observer les cellules au microscope inversé avec des grossissements de 10 x et 40 x. Enfin, éliminez les cellules dans un contenant approprié pour déchets biologiques. La lignée cellulaire de fibroblastes, les cellules NIH trois T trois, a été imprimée ou ensemencée sur une surface immergée. Après l’impression et l’ensemencement, les cellules ont été visualisées afin d’évaluer leur densité et leur morphologie aux points temporels pertinents. Les images ont montré que les cellules présentent des phénotypes presque identiques à chaque point temporel et à chaque grossissement. Sur la base de ces données, l'impression effective s'est révélée minimale. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'une coloration par l'iodure de propidium, qui a montré que la viabilité des cellules imprimées n'était pas significativement différente de celle des cellules ensemencées à chaque point temporel. La principale différence entre les deux méthodes d'attachement des cellules à la surface réside dans la densité des cellules.La densité des cellules imprimées diminue de plus de 50 % au point temporel de deux heures, tant pour les cellules ensemencées que pour les cellules imprimées. Une étude plus approfondie est nécessaire pour déterminer la cause de cette diminution. Toutefois, les rapports globaux de densité imprimée restent significativement plus élevés par rapport à ceux des cellules ensemencées.La densité cellulaire imprimée dans la chambre d'écoulement était environ 10 fois plus élevée à chaque point temporel que celle des cellules semées, étant donné que les cellules étaient imprimées à la même densité que lors du semis, mais dans une zone plus petite. Au dernier point temporel, les cellules présentent une densité identique, ce qui est probablement dû à la mobilité cellulaire et aux limitations liées à la consommation de ressources. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans des domaines tels que la découverte de médicaments, leur permettant d'étudier les effets de la toxicité et de l'efficacité des médicaments sur les cellules, ainsi que dans les domaines à forte demande comme le cancer, les maladies cardiaques et d'autres pathologies.En utilisant l'impression de cellules immergées en combinaison avec d'autres technologies telles que l'adhérence cellulaire programmable, nous pouvons étendre la portée de cette technique aux cellules en suspension, afin de permettre des criblages élargis dans la découverte et le développement de médicaments. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension solide de la manière d'imprimer des cellules à l'aide de notre technique d'impression sous eau.

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