Name: Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Découvrez l'analyse rapide d'images de microscopie à fluorescence avec la plateforme PhenoRipper. Cette méthode automatise l'identification des profils phénotypiques et réduit significativement le temps d'analyse par rapport aux techniques traditionnelles.

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Nous remercions Adam Coster et tous les autres membres des laboratoires Altschuler et Wu pour commentaires et discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par l&#39;Institut national de la santé accorde R01 GM085442 et CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), et la Fondation Welch I-1619 (SJA) et I-1644 (LFW).

Une. Préparation des échantillons et d&#39;imagerie <ol><li> La culture cellulaire <ol><li> Diviser les cultures régulièrement et maintenir à 20-70% de confluence. Un jour avant l&#39;expérience, la croissance des cellules HeLa dans du DMEM (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, voir le tableau des matériaux) et supplémenté avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal) et 1x pénicilline / streptomycine. </li><li> Au jour de l&#39;expérience, les cellules en croissance par division en culture (environ 50% de confluence). </li><li> Laver les cellules avec du PBS (Phosphate Buffered Saline), exposer à environ 2 ml de trypsine / EDTA (acide éthylène diamine) pendant quelques secondes. Aspirer excès de trypsine / EDTA et maintenir les cellules baignant dans un film mince de trypsine / EDTA dans la hotte à température ambiante pendant environ 3 min. </li><li> Agiter mécaniquement flacons à deux reprises et détacher les cellules avec les médias de sérum complété. Compter les cellules et diluer à 5000 cellules/50 ul de milieu et immédiatement la plaque 50 pl / puits sur une plaque de fond de verre de 384 puits en utilisant une manipulation du liquide robot automatisé (seulement 30 biens de la plaque sont utilisés ici). </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 min afin de minimiser les effets de bord dans les puits 5. Après RT incubation, placer les plaques dans une ° C / 5% de CO 2 incubateur à 37 pendant la nuit. </li><li> Chaque médicament sera testé en double. Ajouter 25 ul de médicament dans les puits correspondants de la plaque support contenant déjà. </li><li> Fixer la plaque avec une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS à 24 heures après un traitement médicamenteux. </li></ol></li><li> Coloration Les anticorps spécifiques des anticorps primaires, secondaires marqués par fluorescence et d&#39;autres colorants fluorescents qui ont été utilisées ici sont énumérés dans le tableau de matériaux. <ol><li> Cellules perméabilisent fixe avec 0,2% de Triton X-100 solution dans du TBS (solution saline tamponnée au Tris) pendant 3 min, et laver avec TBST (solution saline tamponnée au Tris + Tween 20) 3x. Ajouter 5% de BSA (Bovine Serum Albumine) en solution TBST pour bloquer. </li><li> Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 heures, puis laver avec du TBST 3x. </li><li> Faire DILUT anticorps primaireions dans 5% de BSA dans TBST (voir le tableau des matériaux) et ajouter 10 ul / puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 heures, puis laver 3x avec TBST. </li><li> Faire dilutionin anticorps secondaire 5% de BSA dans TBST (voir le tableau des matériaux) et ajouter 10 ul / puits. </li><li> Incuber la plaque dans l&#39;obscurité à la température ambiante pendant 2 heures puis laver deux fois avec TBST. </li><li> Préparer des dilutions pour Hoechst et phalloidin (voir le tableau des matériaux) dans du PBS et ajouter 10 ul / puits. </li><li> Incuber la plaque à l&#39;obscurité pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Après 2 lavages de TBST, plaques de recouvrement en aluminium et conserver à 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imagerie Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;un microscope à épifluorescence en utilisant un objectif 20x avec caméra 1x1 binning. Acquérir seize images pour chaque bien, pour un total de 480 images (canaux x3). </li></ol> 2. Analyser Images Téléchargez et installez PhenoRipper de phenoripper.org, et lancer PhenoRipper pour commencer l&#39;analyse des images. PhenoRipper prend actuellement en charge TIFF, PNG et JPEG et tous les autres formats pris en charge par MATLAB (logiciel de microscope prennent généralement en charge l&#39;exportation au format TIFF). 2.1 Chargement des données <ol><li> Il n&#39;existe pas de convention de nommage / organisation standard pour les images de microscopie, ce qui peut rendre le chargement des images et des métadonnées à associer (c. annotation expérimentale tels que le type de traitement, bien nombre et ainsi de suite) la partie la plus difficile du flux de travail. Choisissez l&#39;une des méthodes présentées (décrit ci-dessous). <ol><li> PhenoLoader: Choisissez cette option pour semi-charger automatiquement les données lorsque le nom de fichier et / ou de la structure de répertoire contiennent suffisamment d&#39;informations pour des images de groupe comme vous le souhaitez (par exemple B16 HeLa_Drug5-DAPI.png pourrait indiquer que l&#39;image est de bien B16, les cellules sont traitées avec le médicament dont l&#39;ID est 5, et l&#39;image capture la tache de DAPI nucléaire - avec cette convention de nommage, toutes les images du puits A1 ou traités avec des médicaments 5 pourraient facilement être regroupées). L&#39;assistantguider l&#39;utilisateur étape par étape d&#39;associer des métadonnées avec des groupes d&#39;images et de définir les marqueurs de la manière suivante: <ol><li> Cliquez sur &quot;Structure de fichiers&quot; pour accéder à la fenêtre PhenoLoader. </li><li> Cliquez sur &quot;Définir le répertoire racine&quot; pour sélectionner le répertoire contenant l&#39;image ensemble de données. Puis filtrer les fichiers qui ne sont pas utilisés (fichiers inutilisés) pour l&#39;analyse (en option, peut être laissé vide). </li><li> Cliquez sur &quot;Définir&quot; marqueurs pour indiquer les biomarqueurs utilisés dans l&#39;expérience et les associer aux images. En particulier, cliquez sur un fichier image, puis sélectionnez une partie du nom de fichier qui identifie les biomarqueurs. Enfin, entrez un nom pour chaque biomarqueur. </li><li> Cliquez sur &quot;Définir métadonnées&quot; pour associer des informations à chaque image. En particulier, cliquez sur un fichier image, puis sélectionnez une partie du nom du fichier des informations d&#39;identification de l&#39;image (par exemple &quot;B16&quot; pour le nom de bien). Une fenêtre demandant un nom de groupe (par exemple, «Nousll &quot;) apparaîtra, entrez un nom. membres du groupe extrait du fichier sera affiché sur le tableau de groupe (par exemple, la liste complète des noms et). Pour ajouter des informations supplémentaires non présentes dans le nom de fichier, cliquez sur le&quot; (facultatif) Suivant &quot;. Cliquez sur&quot; Ajouter des métadonnées Groupe &quot;, entrez le nom du groupe supplémentaire (par exemple&quot; des médicaments &quot;) et pour chaque valeur du groupe prédéfini (par exemple:« Eh bien »), entrez la valeur (par exemple,« Taxol ») . Il n&#39;y a pas de limite au nombre de groupes supplémentaires qui peuvent être ajoutés. </li><li> Enfin, cliquez sur &quot;Créer MetadataFile&quot; pour générer le fichier de métadonnées et de poursuivre l&#39;analyse. Si un fichier de métadonnées a été généré précédemment, les étapes ci-dessus peuvent être évités en chargeant directement le fichier en utilisant l&#39;option &quot;Fichier de métadonnées&quot; (décrit dans 3 ci-dessous). </li></ol></li><li> Modèles Expression régulière base: Les expressions régulières sont une approche standard pour les modèles correspondantdans le texte. Choisissez cette option lorsque le nom de fichier et / ou de la structure de répertoire contiennent suffisamment d&#39;informations pour des images de groupe et la convention de dénomination correspond à un des modèles pré-existants. Les modèles personnalisés basés sur les expressions régulières peuvent également être définis et réutilisés manuellement. Cette option avancée est recommandé uniquement pour les utilisateurs familiers avec les expressions régulières. </li><li> Métadonnées Fichier: Choisissez cette option pour personnalisation ultime. Définir et charger un séparées par des virgules valeurs (CSV) contenant les noms de fichiers et les métadonnées associées à chaque image. Un exemple de format de fichier est disponible sur la partie téléchargement du site web (phenoripper.org). Il suffit de charger le fichier via l&#39;interface pour afficher les informations qu&#39;il contient. </li></ol></li><li> Sélectionnez le champ de métadonnées qui définit répétitions dans l&#39;expérience d&#39;éviter l&#39;échantillonnage redondant. Pour les jeux de données qui contiennent des répétitions (par exemple toutes les images dans un puits devraient être similaires), les regrouper (par exemple en bien) peut améliorperformances ove. Dans la plupart des cas, il est raisonnable de choisir l&#39;option par défaut &quot;au hasard (je ne sais pas)&quot;, qui sélectionne un sous-ensemble aléatoire. </li></ol> 2.2 Réglage Paramètres d&#39;analyse Cliquez sur &quot;Définir les paramètres&quot; pour définir les paramètres nécessaires pour traiter l&#39;ensemble de données. Les paramètres à définir sont sur le panneau de gauche. Le panneau de droite affiche un échantillon fusionné de l&#39;ensemble de données. Cliquez sur les flèches gauche / droite pour basculer entre les différentes images. <ol><li> Seuil Intensité: Choisissez une valeur de seuil approprié pour identifier plus ou moins les parties cellulaires (plutôt que le fond, les régions non cellulaires) d&#39;images. Un seuil est précalculée par PhenoRipper, mais peut être ajusté pour améliorer la mise en évidence des régions cellulaires en utilisant la barre de défilement sur le dessus de l&#39;image. Si un seuil choisi ne fonctionne pas sur toutes les images, abaisser le seuil de façon à inclure des régions non cellulaires plutôt que de laisser tomber les régions cellulaires. </li><li> Bloquer Siser: Choisissez une taille de bloc appropriée (en pixels) de la grille de l&#39;image. Blocs de taille spécifiée seront superposés sur l&#39;image. Ajuster la taille du bloc pour obtenir une moyenne de 20-30 blocs / cellule. Pour superposer la grille sur l&#39;image, cliquez sur la case en face du champ &quot;Block Size&quot;. </li><li> Paramètres optionnels: Si les images auto-échelle ne présentent des marqueurs avec des intensités relatives souhaitées (par exemple, une couleur est saturée) ou si les marqueurs doivent être larguées à partir de l&#39;analyse, utilisez l&#39;option &quot;Ajuster l&#39;intensité du canal». Pour identifier les régions cellulaires sur un sous-ensemble de marqueurs utiliser les &quot;canaux utilisés pour Threshold&quot; option. Les choix par défaut des autres paramètres sont généralement suffisant, mais si nécessaire, les régler en utilisant les &quot;Options d&#39;analyse avancée&quot;. </li><li> Exécutez l&#39;analyse en appuyant sur &quot;PhenoRip&quot; sur le panneau principal de l&#39;application. PhenoRipper identifie automatiquement les types de blocs récurrents dans les images. Profils phénotypiques seront générés pourchaque image en fonction des fractions de différents types de blocs à l&#39;intérieur. </li></ol> 3. Résultats Explorer <ol><li> Explorer les relations entre les profils phénotypiques des images en utilisant le PhenoBrowser (Figure 1). L&#39;interface PhenoBrowser se compose de quatre panneaux: le panneau en haut à gauche est une représentation graphique (nuage de points) de la relative similitude entre les différentes images / conditions, les deux panneaux sur les bons exemples d&#39;images d&#39;affichage de certaines conditions, et le panneau final (graphique à barres ) compare leurs profils phénotypiques. </li><li> &quot;Jeter Cadres vides&quot; en utilisant le menu &quot;Traitement des données&quot;. </li><li> Supprimer les images de mauvaise qualité: Tout d&#39;abord, pour étudier des images individuelles s&#39;éteignent groupe dans le menu &quot;Traitement des données&quot;. Ensuite, cliquez sur les points de aberrantes dans le nuage de points et jetez les images de faible qualité (par exemple, de se concentrer, artefact coloration). </li><li> Explorez les données: Décidez qui définit les métadonnées sur le terrainune unité de base de comparaison (par exemple, pour comparer les médicaments, les images ayant la même valeur du champ de métadonnées «drogue» doivent être regroupées). Réduire toutes les images avec la même valeur de ce champ de métadonnées dans un seul point de données avec &quot;Groupe par&quot;. Par exemple, le regroupement par médicament moyenne des images au sein de chaque médicament pour obtenir un point par médicament. Le secteur abrite (ou éloignés) dans le nuage de points reflètent les conditions qui suscitent des phénotypes cellulaires similaires (ou différents). Couleur ou étiquettes des points (menu d&#39;affichage de données) sur la base de métadonnées disponibles pour aider l&#39;intelligibilité. L&#39;intrigue est rotatif 3D en cliquant sur la case à cocher &quot;tourner&quot; et en cliquant sur le bouton gauche et en faisant glisser la souris dessus. </li><li> Sélectionnez deux points différents pour les comparer directement. Les panneaux d&#39;image affiche des images échantillons pour chaque point, et le panneau graphique à barres affichent les types de blocs dont les fréquences occurrence sont les plus différents entre les deux points. </li><li> Lancer la clustergram dans le menu &quot;Clustergram&quot; pour fournir une vue plus globale de la relation entre les types de blocs et des conditions expérimentales. En regroupant les deux types et conditions bloc, cette représentation met en évidence les phénotypes cellulaires qui distinguent le mieux les groupes de conditions (figure 5). </li></ol>

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<li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li>
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<li>Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le flux de travail décrit ici permet de caractériser rapide et facile et la comparaison des images de microscopie. Nous avons d&#39;abord montré comment ce flux de travail peut aider à l&#39;optimisation de l&#39;expérience, par exemple en effectuant rapidement le contrôle de la qualité sur les images de microscopie. Ensuite, nous avons démontré son potentiel pour l&#39;analyse des données de criblage à haut débit: nous étions en mesure de médicaments du groupe en fonction de leur mécanisme d&#39;action. Le regroupement...

Au cours de la dernière décennie, les progrès rapides de la technologie d&#39;imagerie ont donné de nombreux laboratoires la possibilité d&#39;effectuer la microscopie à haut débit. Le défi est maintenant passé de l&#39;une des images à une analyse. Comment pouvons-nous caractériser, comparer, et d&#39;explorer le torrent de phénotypes subtils complexes générées par un écran d&#39;imagerie à haut débit typique? Un certain nombre d&#39;images d&#39;analyse et de plateformes informatiques ont donné utilisateurs boîtes à outils sophistiqués 1-3 pour extraire des informations biologiques provenant de grandes collections d&#39;images. Pourtant, de nombreux obstacles restent importants dans l&#39;analyse des données de écrans à base d&#39;images à haut débit. Difficultés à choisir caractérisations appropriées des images et un réglage fin des paramètres algorithmiques (le système d&#39;intérêt) entraînent souvent des délais d&#39;établissement, en particulier pour les utilisateurs sans compétences d&#39;analyse d&#39;image. En particulier, la segmentation cellulaire, le processus d&#39;identification de cellules individuelles dans unn l&#39;image, est un obstacle majeur à cet égard. La segmentation peut être très sensible à des paramètres expérimentaux tels que le type de cellules, la densité cellulaire et des bio-marqueurs, et nécessite souvent l&#39;ajustement répété pour un grand ensemble de données. Pour ces raisons, l&#39;analyse d&#39;image est souvent une étape terminale indépendante réalisée par des spécialistes plutôt que de faire partie intégrante du flux de travail expérimental. Cela empêche le cycle de rétroaction rapide entre l&#39;analyse et l&#39;expérimentation, un élément essentiel du développement de dosage. Nous décrivons ici un autre flux de travail qui est optimisé pour haut débit de microscopie par fluorescence et évite bon nombre des difficultés mentionnées ci-dessus. À cette fin, nous faisons usage de PhenoRipper 4, une plate-forme logicielle open-source pour l&#39;exploration et l&#39;analyse des images de microscopie rapide. De manière significative, PhenoRipper évite beaucoup de défis liés à la segmentation des cellules en n&#39;essayant pas d&#39;identifier des cellules individuelles. Au lieu de cela, PhenoRipper divise les images en pixelsblocs de taille subcellulaire et caractérise images en termes de blocs qu&#39;ils contiennent. Plus précisément, PhenoRipper profils blocs en termes de base-colocalisation-marqueurs caractéristiques et identifie automatiquement 4 types de blocs les plus représentatifs dans les images d&#39;apprentissage. PhenoRipper attribue alors à chaque bloc de type de bloc représentant le plus similaire, et finalement caractérise des images basées sur les types des blocs qu&#39;elles contiennent. Comparé à-cellulaires simples approches plus traditionnelles, cette approche nécessite un réglage amende minimale et l&#39;expertise. Ainsi, les utilisateurs ne doivent régler deux paramètres: la taille de bloc et une intensité de seuil (à jeter parties non cellulaires d&#39;une image), qui sont tous deux mis à la rétroaction graphique. Surtout, le flux de travail décrit ici a été démontré à l&#39;échelle 4 facilement à beaucoup de plus grands ensembles de données, où la vitesse et le réglage amende minimale fournit grand temps et des gains de fiabilité. Dans la pratique, nous constatons que cette applicationgardon réduit le temps nécessaire à la fois pour l&#39;installation et l&#39;exécution de plusieurs ordres de grandeur 4. La sortie principale du PhenoRipper est une représentation visuelle de l&#39;image de similitude, ce qui permet à l&#39;utilisateur d&#39;identifier des groupes de conditions expérimentales qui causent des cellules à afficher des phénotypes similaires. Les groupements PhenoRipper trouve généralement ont &quot;intelligibilité biologique&quot; comparables à ceux générés par d&#39;autres méthodes, à base de cellules fastidieuses 4. Dans la pratique, cela signifie que, souvent, dans une demi-heure de l&#39;exécution d&#39;une expérience typique de 96 puits microscopie de fluorescence, un expérimentateur sans expérience d&#39;analyse d&#39;image avant peut obtenir une lecture fiable de la performance de son expérience. L&#39;expérimentateur peut alors commencer à explorer les relations entre les différentes conditions expérimentales et concernant ces relations à des phénotypes d&#39;image. Nous démontrons ce flux de travail ici en analysant les effetsdes médicaments dans les classes mécanistiques distinctes sur les cellules HeLa colorées pour les marqueurs d&#39;ADN et du cytosquelette. Images de cellules traitées avec la même classe de médicaments ont été regroupés, et des images de mauvaise qualité (artefacts de coloration, sur des cellules de réflexion et ainsi de suite) sont apparus comme des valeurs aberrantes, ce qui les rend faciles à identifier et potentiellement jeter. Bien que ce flux de travail est utile pour un grand nombre d&#39;essais basés sur l&#39;image, il ya clairement de nombreuses situations où une approche différente pourrait être plus informatif. Par exemple, la sortie de PhenoRipper est essentiellement une comparaison relative des motifs de fluorescence dans des conditions expérimentales. Si une caractérisation absolue d&#39;une caractéristique spécifique d&#39;une cellule unique est nécessaire à la place (par exemple le nombre de mouchetures dans une cellule), une seule analyse à base de cellules serait nécessaire. Néanmoins, même dans ce type de situation, PhenoRipper est susceptible de détecter des changements dans ces phénotypes unicellulaires et donc être un outil utile pour le dosage optisation.

<table><tbody><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>Teneur élevée en glucose, L-glutamine</td></tr><tr><td>Marqueur Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>Coloration de l’ADN, dilution 1:2 000 de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Marqueur phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Phallotoxine conjuguée, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps primaire &alpha ;-tubuline</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Anticorps primaire de souris monoclonal, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Antivody secondaire anti-souris TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Anticorps secondaires conjugués, 0,5 mg dans 1 ml de PBS + 1 ml de glycérol</td></tr><tr>Concentration<td>d’aldostérone</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,2 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration d’apicidine</td><td></td><td></td><td>utilisée : 20 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration de colchicine</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,16 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration de cortisol</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,2 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration de dexaméthasone</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,2 &mu ; Concentration</td></tr> de <tr><td>M docétaxel</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,2 &mu ; Concentration M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>utilisée : 20 &mu ; M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>concentration utilisée : 5 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration de nocodazole</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,3 &mu ; Concentration</td></tr><tr><td>de prednisolone</td><td></td><td></td><td>M utilisée : 0,2 &mu ; Concentration M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,2 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration Scriptaid</td><td></td><td></td><td>utilisée : 70 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration de Taxol</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,3 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration de trichostatine A</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,2 &mu ; M</td></tr><tr><td>Concentration de vinorelbine</td><td></td><td></td><td>utilisée : 0,3 &mu ; L</td></tr></tbody></table>

analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence images

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Malgré les progrès rapides de la microscopie à haut débit, les tests basés sur l&#39;image quantitatives posent encore des défis importants. Bien qu&#39;une variété d&#39;outils spécialisés d&#39;analyse d&#39;images sont disponibles, la plupart des workflows traditionnels à base de d&#39;analyse d&#39;image ont des courbes d&#39;apprentissage (pour un réglage fin des paramètres d&#39;analyse) et conduisent à longs délais d&#39;exécution entre l&#39;imagerie et l&#39;analyse. En particulier, la segmentation de la cellule, le processus d&#39;identification des cellules individuelles dans une image, est un obstacle majeur à cet égard. Nous présentons ici un suppléant, sans segmentation des cellules workflow basé sur PhenoRipper, une plate-forme logicielle open-source conçu pour l&#39;analyse et l&#39;exploration des images de microscopie rapide. Le pipeline présentée ici est optimisé pour des images de microscopie par immunofluorescence de cultures de cellules et nécessite une intervention minimale de l&#39;utilisateur. En une demi-heure, PhenoRipper peut analyser des données à partir d&#39;une expérience typique de 96 puits et de générer des profils d&#39;image. Les utilisateurs peuventalors explorer visuellement leurs données, effectuer un contrôle de la qualité de leur expérience, assurer une réponse aux perturbations et vérifier la reproductibilité de répétitions. Ceci facilite un cycle de rétroaction rapide entre l&#39;analyse et l&#39;expérience, ce qui est essentiel au cours de l&#39;optimisation du dosage. Ce protocole est utile non seulement comme une première analyse de la transmission du contrôle de qualité, mais également peut être utilisée comme une solution de bout en bout, en particulier pour le criblage. Le flux de travail décrit ici échelles de grands ensembles de données tels que ceux générés par des écrans à haut débit, et a été montré à la catégorie des conditions expérimentales par phénotype précision sur une large gamme de systèmes biologiques. L&#39;interface PhenoBrowser fournit un cadre intuitive pour explorer l&#39;espace phénotypique et d&#39;associer les propriétés d&#39;image pour annotations biologiques. Dans l&#39;ensemble, le protocole décrit ici permettra de réduire les obstacles à l&#39;adoption analyse quantitative des écrans d&#39;image en fonction.

Ici, nous avons testé la capacité de ce flux de travail à des médicaments du groupe en fonction de leur mécanisme d&#39;action. Des cellules HeLa ont été ensemencées dans 30 puits d&#39;une plaque à 384 puits et on les colore pour l&#39;ADN / actine / α-tubuline. Les anticorps spécifiques des anticorps primaires, secondaires marqués par fluorescence, et d&#39;autres colorants fluorescents qui ont été utilisés sont listés dans le tableau de matériaux. Les puits ont été traités avec des 15 médicaments appartenant à trois ...

Nous décrivons ici un flux de travail pour analyser rapidement et collections d&#39;images de microscopie de fluorescence à l&#39;aide PhenoRipper, une plate-forme d&#39;analyse d&#39;image récemment développé explorer.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une plateforme d'analyse d'images pour analyser rapidement et explorer des images de microscopie fluorescente. Cela est réalisé en semant d'abord des cellules dans une plaque, en ajoutant des perturbations à chaque puits et en incubant la plaque. Des images sont ensuite acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence automatisé, puis chargées de manière semi-automatique sur la plateforme d'analyse d'images pheno ripper à l'aide de l'outil pheno loader.Après avoir défini les paramètres d'analyse, Pheno Ripper identifie automatiquement les types de blocs récurrents dans les images et génère des profils phénotypiques pour chaque image, que l'on peut explorer à l'aide du Pheno Browser. En fin de compte, le dendrogramme final illustre les relations entre différentes conditions et caractéristiques d'image, permettant ainsi de comparer des phénotypes complexes mais subtils obtenus par l'écran d'imagerie à haut débit. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui nécessitent l'identification automatisée de cellules individuelles, est qu'elle est beaucoup plus rapide et plus facile à utiliser.Cette mét

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Nous avons développé une plate-forme logicielle qui utilise Imaris Neuroscience, ImarisXT et MATLAB pour mesurer les changements dans la morphologie d'une forme indéfinie pris trois dimensions fluorescence confocale de cellules individuelles. Cette nouvelle approche peut être utilisée pour quantifier les changements dans la forme des cellules qui suivent l'activation du récepteur et représente donc un outil possible supplémentaire pour la découverte de médicaments.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Nous présentons un protocole simple d'obtenir des films de microscopie par fluorescence de cellules de levure en croissance, et un logiciel GUI basée à extraire des données de séries chronologiques unicellulaires. L'analyse comprend lignée automatisé et l'affectation du temps de division intégrée à l'inspection visuelle et la conservation manuelle de données à chenilles.

L&#39;acquisition de fluorescence Time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes

Présenté informatique est un workflow flexible permettant multiplexé analyse basée sur l'image de cellules marquées par fluorescence. Le workflow quantifie marqueurs nucléaires et cytoplasmiques et calcule marqueur translocation entre ces compartiments. Des procédures sont prévues pour perturbation de cellules en utilisant siRNA et la méthodologie fiable pour la détection du marqueur par immunofluorescence indirecte dans des formats de 96 puits.

Workflow pour haut-contenu, cellule individuelle quantification des marqueurs fluorescents de Data Universal Microscope, pris en charge par Open Source Software

La quantification précise des événements de trafic vésiculaire fournit souvent des informations clés sur les rôles de protéines spécifiques et les effets des mutations. Cet article présente des méthodes d’utilisation de la supécliptique pHluorin, une variante de la GFP sensible au pH, comme outil de quantification des événements endocytaires dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence quantitative et de la cytométrie en flux.

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Nous présentons une open source haute analyse de contenu (HCA) en utilisant l'instrument automatisé d'imagerie de fluorescence à vie (FLIM) pour analyser les interactions entre protéines en utilisant Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) Affichages sur la base. L' acquisition de données pour cet instrument openFLIM-HCA est contrôlé par un logiciel écrit en μManager et l' analyse des données est effectuée en FLIMfit.

Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Nous décrivons ici un protocole pour la segmentation automatique des tissus fluorescent étiquetés sur les diapositives à l’aide d’un système d’analyse de haute teneur widefield (WHCAS). Ce protocole a de nombreuses applications dans n’importe quel domaine qui implique la quantification de marqueurs fluorescents dans les tissus biologiques, y compris les sciences biologiques, ingénierie médicale et sciences de la santé.

Balayage automatique pour lames et Segmentation en tissus fluorescent marqué à l’aide d’un système d’analyse Widefield haute teneur

L'imagerie spectrale est devenue une solution fiable pour l'identification et la séparation des signaux de fluorescence multiples dans un seul échantillon et peut facilement distinguer les signaux d'intérêt du fond ou de l'autofluorescence. L'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation améliore cette technique en diminuant le temps d'acquisition d'image nécessaire tout en augmentant simultanément le rapport signal-bruit.

Microscopie d'imagerie hyperspectrale à balayage d'excitation pour discriminer efficacement les signaux de fluorescence

Nous présentons un flux de travail librement disponible construit pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans des compartiments cellulaires spécifiques dans des images de microscopie de fluorescence. Ce flux de travail convivial est conçu sur le logiciel open-source Icy et utilise également les fonctionnalités ImageJ. Le pipeline est abordable sans connaissance dans l’analyse d’image.

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

Ici, un protocole est présenté pour extraire optiquement et cataloguer les signatures de fluorescence cellulaire innée (c’est-à-dire l’autofluorescence cellulaire) de chaque cellule vivante individuelle distribuée dans un espace tridimensionnel. Cette méthode convient à l’étude de la signature de fluorescence innée de divers systèmes biologiques à une résolution unicellulaire, y compris les cellules de bactéries, de champignons, de levures, de plantes et d’animaux.

Reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires par microscopie confocale

Un flux de travail microfluidique accessible et open-source est présenté pour l’analyse parallélisée de la rétention plasmidique chez les bactéries. En utilisant la microscopie à fluorescence pour quantifier la présence de plasmides dans des microcolonies unicellulaires au sein de microgouttelettes de gel, cette méthode offre une alternative précise, accessible et évolutive au comptage traditionnel sur plaque.

Analyse de la stabilité des plasmides avec la microfluidique de gouttelettes open source

Découvrez l'analyse rapide d'images de microscopie à fluorescence avec la plateforme PhenoRipper. Cette méthode automatise l'identification des profils phénotypiques et réduit significativement le temps d'analyse par rapport aux techniques traditionnelles.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

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