Name: Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de lIL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Apprenez à activer et évaluer l'inflammasome NLRP3 dans les cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes en mesurant la sécrétion d'IL-1β. Cette méthode utilise R848 et la nigéricine pour étudier les mécanismes immunitaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., et Meagan O&#39;Brien, MD pour leur soutien et vos commentaires. Cette recherche a été financée par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses et a terminé avec un financement du NIH accorde Ruth L. Kirschstein Distinctions pour services de recherche nationaux pour les bourses Predoctoral individuels (F31) pour la promotion de la diversité dans la recherche liés à la santé (AI089030) et RO1 (AI081848 ).

Déclaration d&#39;éthique: les échantillons de recherche sont obtenus et stockés pour la recherche avec le consentement des donateurs. Tous les échantillons doivent être codées ou rendues anonymes avant de les utiliser. Ce protocole suit les lignes directrices de notre comité d&#39;examen institutionnel. 1. Différenciation des droits de périphériques monocytes sanguins dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes. Remarque: couches leucocytaires humaines servent comme source de cellules du sang périphérique (CMSP) humaines et ont été obtenues à partir du Centre de New York Blood (New York, NY). Les donneurs de sang sont des volontaires sains. La procédure de 5 jours commence par le dépôt de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) sur des fioles de culture tissulaire 35,36. Différences notables des protocoles publiés sont les suivants: <ol><li> Utiliser 225 cm 2 non pyrogènes des flacons de culture tissulaire en polystyrène avec un couvercle de filtre à adhérer un total de 2x10 8 PBMC par flacon de 10 cm au lieu de polystyrène plaque de culture tissulaires (58 cm 2) (étape 1). </li><li> Préparer des milieux avec 5% de sérum humain mis en commun (PHS, 30 ml) dans 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamine, 5 ml de tampon HEPES 1 M, et 1,4 ml de 50 mg / ml de gentamicine (5% PHS médias) suivie d&#39;une filtration à travers un filtre de 20 uM. Ajouter un total de 50 ml 5% PHS médias par 225 cm 2 flacon de culture tissulaire. </li><li> Laver les cellules adhèrent à trois reprises avec 25 ml frais RPMI-1640. Agiter vigoureusement pendant 5 secondes lors de chaque lavage et aspirer les cellules non adhérentes (étape 4). </li><li> Ajouter 190 ul de 400 UI / pl d&#39;IL-4 et de 380 ul de 100 UI / pl de GM-CSF par flacon (étape 3) au jour 0, 2, et 4. Jour 0 est défini comme les PBMC de jour sont d&#39;abord déposées dans l&#39;étape 1 (étape 8). </li><li> jour de récolte 5 moDCs à une concentration de 1x10 6 cellules / ml (étape 15). </li><li> Utilisez moDCs immédiatement dans leur état de repos. Étapes 17-22 sont jamais réalisées. Note: Les échantillons doivent être traités dès que possible après la collecte pour de meilleurs résultats. </li><li> moDCs aliquotes à une concentrationtion de 2x10 5 cellules / puits (200 pl / puits de la 1x10 6 cellules / ml) dans une plaque à 96 puits à fond rond (western blot, ELISA, FACS) ou sur un chamberslide poly-L-lysine traitée (microscopie) pour l&#39;expérimentation . Remarque: Il ya au moins quatre conditions: Complètement non stimulées (contrôle négatif), d&#39;apprêt, activation uniquement, et l&#39;amorçage suivie de l&#39;activation. Les conditions peuvent être élargis pour inclure des contrôles de diluant pour R848 et nigéricine si désiré. Si le dosage en aval est ICS, les doublons sont nécessaires pour contrôles isotypiques. </li></ol> . 2 Amorçage de la Inflammasome - Signal 1 <ol><li> Reconstituer R848 lyophilisé dans du DMSO, selon les instructions du fabricant. Diluer le stock de travail à température ambiante avec du RPMI-1640. </li><li> Ajouter R848 à une concentration finale de 10 uM dans les puits pour 18 h. Placer les cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3 Activation du NLRP3 Inflammasome -. Signal2 <ol><li> Reconstituer nigéricine lyophilisé dans de l&#39;éthanol, conformément aux instructions du fabricant. Diluer le stock de travail à température ambiante avec du RPMI-1640 avant d&#39;ajouter des conditions appropriées. </li><li> Ajouter la nigéricine à la concentration finale de 20 uM et revenir à l&#39;étuve à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 6 heures. Aucune des étapes de lavage ont lieu entre l&#39;amorçage et lors de l&#39;activation. Remarque: La sécrétion d&#39;IL-1β est augmentée par la présence des ionophores calciques, la bréfeldine A, la monensine, le dinitrophénol ou le cyanure de carbonyle chlorophenylhydrazone 37, 38. Par conséquent, l&#39;addition de ces inhibiteurs de sécrétion ne sont pas recommandés lors de l&#39;analyse d&#39;amorçage ou d&#39;une activité inflammasome car il va modifier la sécrétion de l&#39;IL-1β. </li></ol> 4. L&#39;IL-1ß prélèvement des échantillons <ol><li> Centrifuger la plaque avec des cellules et des surnageants à 974 g pendant 3 min. </li><li> Sans perturber le culot cellulaire, aspirer le surnageant et transférer souseparate fond rond plaque afin de mesurer la sécrétion de cytokines à partir des surnageants. Remarque: Les surnageants peuvent être stockés temporairement à -20 ° C ou -80 ° C pour stockage à long terme. </li><li> Laver les culots cellulaires à trois reprises avec 200 ul de 1 x PBS à 974 x g pendant 3 min pour enlever toute l&#39;IL-1β extracellulaire à partir des échantillons cellulaires. Remarque: Lors du lavage des culots cellulaires à partir d&#39;une plaque de 96 puits, enlever le lavage par inversion rapide plaque dans un bac de collecte afin de ne pas perturber l&#39;échantillon. </li></ol> 5. Mesure IL-1ß De cellulaires et de surnageant échantillons <ol><li> Intracellulaire de cytokines coloration (ICS): Le protocole ICS est décrit ci-dessous 39, 40. Remarque: ne pas suspendre les cellules si le dosage en aval est la microscopie. Tous les lavages et les aspirations doivent être effectués sans perturber la couche de cellules / granulés (en fonction du dosage en aval). <ol><li> Ajouter 100 pi de 5% PHS médias dans les puits appropriés. Ajoutervolume approprié (environ 1 μl/2x10 5 de cellules, ou une pl / puits) de marquage fluorescent α-CD11c et α-CD14 (marqueurs phénotypiques; clone B-LY6 et MφP9, respectivement) ou de contrôle d&#39;isotype à des cellules pendant 10 min à RT dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver trois fois avec PBS 1x à 974 g pendant 3 min. </li><li> Fixer les cellules par addition de 100 pl de 4% de PFA pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Pause Point: Laver avec 100 pi de PBS 1x à 974 g pendant 3 min et conserver à 4 ° CO / N en 1x PBS. </li><li> Ajouter 100 ul de tampon de perméabilisation de cellules pendant 30 min. Note: Le tampon de perméabilisation est composé de 1 x PBS avec 0,3% de Triton X-100, et de 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) pour la perméabilisation. Ne pas déranger les cellules adhérentes lorsqu&#39;un dosage en aval est la microscopie. </li><li> Ajouter le volume approprié (environ 62 ng antibody/2x10 5 cellules, environ 2,5 ou pl / puits) de α-IL-1β-FITC (clone 8516) ou isotype contrôle pour2 h dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 200 ul de tampon de perméabilisation à 974 x g pendant 3 min dans le noir. </li><li> Facultatif: Teinture au DAPI, ajoutez milieu de montage, et placer délicatement la lamelle sur une lame de verre. Autoriser milieu de montage pour guérir O / N avant de capturer des images de microscopie. </li><li> Acquérir les données par FACS ou microscopie. Remarque: Comparer l&#39;isotype pour chaque condition de la coloration appropriée lors de l&#39;analyse par FACS ou microscopie. <ol><li> CAA: Acquérir un échantillon à la fois. Réglez le / porte SSC FSC sur les cellules vivantes, suivies par le fenêtrage CD11c + CD14 - cellules avant l&#39;analyse de la population MODC pro-IL-1β coloration. </li><li> Microscopie: Réglez le temps d&#39;exposition en utilisant l&#39;échantillon de coloration positive - R848 traité. Utilisez DAPI + pro-IL-1β et + DAPI + pro-IL-1β - pour déterminer le pourcentage de pro-IL-1β + moDCs exprimant. </li></ol></li></ol></li><li> Dakota du SudS-Page: Immunoblotting est effectué pour détecter pro-IL-1β. Remarque: La technique décrite ci-dessous combine technique standard d&#39;immuno-empreinte, le gel de polyacrylamide à gradient de 4-20%, et la détection de fluorescence ou de chimioluminescence 41, 42. <ol><li> Lyse des cellules directement dans 10 ul de tampon de lyse dénaturant (5 pi β-mercaptoethanol/950 de tampon d&#39;échantillon de Laemmli ul On dilue à 1:1 avec du tampon de lyse cellulaire). Transférer le lysat à 1,5 ml des tubes Eppendorf. </li><li> lysat de chaleur sur une plaque sèche pendant 10 min à 100 ° C. </li><li> Spin lysat à 20 800 xg sur une minicentrifuge pendant 1 min à concentrer le volume de liquide. Pause points: les échantillons peuvent être congelés à -20 ° C pour le stockage à court terme. </li><li> Charger le volume total sur le gel de polyacrylamide. Run 140 V à travers la zone de gel pendant environ 1 heure, ou jusqu&#39;à ce que le front de colorant de glisser sur le fond du gel. </li><li> Transférer la protéine dans le gel de polyacrylamide sur un membr PVDF Immobilon-FLane pendant 90 min à 100 V. Bloquer la membrane avec 5% de BSA dans de la solution saline tamponnée au Tris / 0,1% Tween-20 (TBS-T) pendant 1 heure. Remarque: PVDF Immobilon-FL est meilleur pour une utilisation avec détection par fluorescence. Une membrane avec une composition différente est recommandée pour les autres techniques de détection pour augmenter le rapport signal sur fond. </li><li> Diluer les anticorps primaires et secondaires dans 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Effectuer les incubations d&#39;anticorps primaires à 4 ° CO / N tout en agitant et anticorps secondaire à la température ambiante pendant 1 heure en agitant. </li><li> Laver la membrane trois fois avec du TBS-T pendant 5 min, tout en agitant entre les incubations d&#39;anticorps primaires et secondaires et de nouveau entre les incubations secondaires et d&#39;imagerie. Note: Les bandes peuvent être détectés en utilisant fluorescent ou la détection de chimioluminescence. Suivez les instructions du fabricant pour la détection. </li></ol></li><li> ELISA: Les échantillons sont congelés pour le stockage doivent s&#39;équilibrer à la température ambiante avant l&#39;analyse. Isoler des échantillons dans une centrifugeuse pour consolider condenseur surnageantation. Suivez les instructions du fabricant pour la mesure de l&#39;IL-1β. Remarque: Dans ce protocole d&#39;IL-1β est spécifiquement mesurée; Toutefois, la mesure simultanée de TNFa, IL-6, et l&#39;immunomodulateur cytokine IL-10 assurer des conditions appropriées ont été amorcées. </li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Cytokines inflammatoires font partie intégrante de pilotage de la réponse immunitaire innée et adaptative pour combattre l&#39;infection virale. IL-1β sécrétée a été démontré que l&#39;augmentation lors de l&#39;infection d&#39;influenza 3, 43, 44. Les mécanismes précis par lequel ces cytokines sont traitées en réponse à la reconnaissance du virus dans les cellules dendritiques humaines sont pas entièrement comprises. Kits d&#39;isolement DC myéloïdes sont coûteux et fastidieux. kits d&#39;isolement et FAC tr...

Activation du système immunitaire inné est nécessaire pour orienter les réponses immunitaires adaptatives cours de l&#39;infection, la maladie et la vaccination 7. Les cellules dendritiques sont le plus puissant antigène présentant des cellules du système immunitaire inné; ils sont spécialisés pour l&#39;absorption des antigènes, la migration vers les ganglions lymphatiques, et l&#39;activation des naïfs CD4 + et CD8 + cytolytiques des cellules T 8-10. Pour activer la détection rapide des agents pathogènes du système immunitaire inné utilise de nombreuses lignées germinales codé reconnaissance de formes récepteurs (PRR) qui reconnaissent pathogènes conservé motifs dérivés ou des marqueurs d&#39;accueil dérivé de stress cellulaire et les dommages. Toll récepteurs (TLR) sont liés à la membrane reconnaissance de formes récepteurs qui reconnaissent certains pathogène phagocyté extracellulaire des motifs associés moléculaires (PAMP) et danger motifs moléculaires associés (atténue). En revanche clin d&#39;œil comme récepteurs (NLR) sont cytosolique et de répondre à un large éventail de PAMP et Damps. Nod comme récepteurs représenter une deuxième ligne de défense contre les agents pathogènes qui échappent surface de la cellule et PRR d&#39;endocytose. L&#39;interaction de l&#39;agent pathogène dérivé, ou «danger» associée, facteurs avec TLR et NLR ligands conduit à un état ​​de maturation des DC entraînant une augmentation de l&#39;interaction DC avec d&#39;autres cellules immunitaires et la promotion des cellules T et l&#39;activation naturelle des cellules tueuses 11. L&#39;interleukine-1β est un élément essentiel de la défense de l&#39;hôte contre l&#39;infection. Dès la reconnaissance d&#39;un micro-organisme, la cytokine hautement pro-inflammatoire, l&#39;IL-1β, est sécrétée et fonctionne comme un appât de chimio et activateur des cellules immunitaires innées et adaptatives. In vivo d&#39;IL-1β est en grande partie responsable de la réponse de phase aiguë, y compris la fièvre et de cytokines inflammatoires synthèse 12. La plupart des NLR contiennent un domaine de répétition riche en C terminal de la leucine qui est pensé à fonctionner dans le ligand de détection, un domaine de liaison de nucleotide central (NACHT) qui est important pour NLRP3 oligomérisation, et un domaine effecteur borne N (PYD dans NLRP3) qui médie la transduction du signal de cibles en aval à travers des interactions de protéines de protéines. La protéine NLRP3 définit complexe inflammasome le plus intensément étudié. Cette protéine est un membre de la famille NLR et a la capacité de former un complexe moléculaire de la protéine composée de plusieurs NLRP3, PYCARD la protéine adaptatrice (également connu sous le nom ASC) et ICE. Lors de l&#39;activation inflammasome PYCARD lie à NLRP3 domaines N terminaux et recrute ICE via l&#39;activation des caspases et le domaine de recrutement (carte) domaines. L&#39;interleukine-1 &#39;enzyme de conversion est d&#39;abord généré en tant que zymogène contenant un motif CARD à son extrémité N-terminale. Les résultats de la formation inflammasome dans la mise deux molécules ICE suffisamment proche pour induire leur activation autocatalytique. Le complexe de l&#39;inflammasome est nécessaire pour activer ICE lui permettant ainsi de convertir la pro-IL-1β cytoplasmique de mûrir cytokine. Le succès de la sécrétion d&#39;IL-1β dans les PED nécessite la détection de deux signaux de danger différentes et indépendantes. Tout d&#39;abord, la détection de TLR PAMP, amortit, ou la signalisation des cytokines (TNFa ou l&#39;IL-1β) provoque une régulation positive de l&#39;expression de protéines pro-IL-1β cytoplasmique. Un second souvent différente, signal, est nécessaire pour la formation du complexe inflammasome amont de la CIE maturation. Un peu inflammasome stimulant signaux comprennent des toxines bactériennes des pores de la membrane formant (comme nigéricine), lysosomales perturber cristaux (tels que des cristaux d&#39;urate monosodique, MSU), et l&#39;ATP extracellulaire. Le mécanisme en amont menant à NLRP3 activation inflammasome par ces divers activateurs n&#39;est pas claire. Les études portant sur ​​la signalisation en amont de la formation inflammasome propose que les événements intracellulaires, comme l&#39;induction d&#39;une hypokaliémie ou d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) activent indirectement l&#39;inflammasome 13-28. Parmi les différents activateurs viraux de l&#39;inflammasome NLRP3 est la grippe, qui fournit des bOTH le signal primaire et secondaire nécessaire pour la sécrétion d&#39;IL-1β 3, 29-33. En utilisant des modèles NLRP3 huitièmes de finale de la souris, il a été constaté que l&#39;IL-1β la sécrétion dans les PED est NLRP3 dépendante 32. En outre, les souris knock-out NLRP3 attiré moins de leucocytes vers le site de l&#39;infection et ont connu une mortalité plus élevée 2, 5. Deux articles récents suggèrent un mécanisme pour l&#39;activation de l&#39;inflammasome NLRP3 cours de l&#39;infection par le virus de la grippe; en premier lieu, par la reconnaissance d&#39;amorce d&#39;ARN viral par TLR7 ou TLR8 (en fonction de l&#39;expression de TLR de la cellule de répondre) ou par détection de bactéries commensales par d&#39;autres TLR pour induire l&#39;expression pro-IL-1β cytoplasmique, suivi d&#39;un second signal, l&#39;activation de NLRP3 formation inflammasome par la protéine virale de canal ionique M2 sur le réseau trans de Golgi 33, 34. Dans la dernière étape, le déclenchement de l&#39;inflammasome NLRP3 est accompli par les perturbations de l&#39;ionique intracellulaire &lt;em&gt; milieu conduisant à la production de ROS, qui est, tout simplement, détectée par NLPR3 comme un signal pour former l&#39;inflammasome. Cependant, le mécanisme précis de l&#39;inflammasome amont de l&#39;activation de l&#39;activité ICE lors de l&#39;infection grippale demeure encore incertain. Ce travail décrit une technique précieuse pour l&#39;étude de l&#39;inflammasome NLRP3 dans moDCs humaines qui peut être utilisé comme une base pour une enquête plus approfondie de la voie sous-jacent DC sur la base d&#39;IL-1β sécrétion en réponse à TLR8 ligature avec R848 suivie de l&#39;activation de l&#39;inflammasome par un puits activateur connu de NLRP3, nigéricine. Des variantes de ce procédé peuvent être utilisés avec d&#39;autres types de cellules, y compris, mais sans s&#39;y limiter: les monocytes, les macrophages, les autres sous-ensembles à courant continu, et les cellules épithéliales.

<table><tbody><tr><td>IL-4</td><td>R& D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Genzyme</td><td>NDC 58468-0180-2</td><td>Nous acquérons cet article par l’intermédiaire de notre pharmacie locale avec une ordonnance</td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cellules mononucléées du sang périphérique</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td>Les PBMC ont été isolés du sang de donneurs sains</td></tr><tr><td>12 plaques de culture tissulaire bien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 plaques de culture tissulaire à fond rond</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-IL-1&beta ;-FITC</td><td>R& D</td><td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>FITC contrôle isotype</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-&beta ;-Tubulin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-IL-1&beta ;</td><td>R& D</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF Immobilon-FL</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>gradient 4-12 % gel de polycrylamide</td><td>Bio Rad</td><td>161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon Laemmli</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio Inc</td><td></td><td>30 % solution stérile/filtrée</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>16 % solution</td></tr><tr><td>Kit de réseau de cytokines inflammatoires humaines</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>3M Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>Réserve sur place</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100mL</td><td></td></tr><tr><td><a>Nunc EasYFlask 225 cm2, Bouchon de filtre, volume de travail de 70 ml, 30/Cs</a></td><td>Thermo 159933</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>20 &mu ; M Unités de filtration stériles jetables</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre &alpha ;-souris IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>Âne &alpha ;-lapin IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>Spectra multicolore large gamme échelle protéique</td><td>Thermo Scientific</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS 10x</td><td>Bio Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine 10x</td><td>Bio Rad</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol - 4 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>Récipient en polystyrène à 8 chambres Lame de verre traitée pour culture tissulaire</td><td>BD Falcon 354108</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

activation et évaluation de nlrp3 inflammasome activité de l&#39;il-1β utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Les processus inflammatoires résultant de la sécrétion de l&#39;interleukine (IL) -1 cytokines de la famille par les cellules immunitaires conduisent à l&#39;inflammation locale ou systémique, le remodelage et la réparation tissulaire, et le contrôle virologique 1, 2. L&#39;interleukine-1β est un élément essentiel de la réponse immunitaire innée et contribue à éliminer les pathogènes envahisseurs, tout en empêchant l&#39;établissement d&#39;une infection persistante 5.1. Inflammasomes sont la plate-forme de signalisation clé pour l&#39;activation de l&#39;enzyme de conversion de l&#39;interleukine 1 (ICE ou la caspase-1). L&#39;inflammasome NLRP3 nécessite au moins deux signaux dans les PED pour provoquer l&#39;IL-1β sécrétion 6. Pro-IL-1β expression de la protéine est limitée dans les cellules au repos; par conséquent, un signal d&#39;amorçage est nécessaire pour l&#39;IL-1β transcription et l&#39;expression de la protéine. Un second signal détecté par les résultats NLRP3 dans la formation de la protéine multi-NLRP3 inflammasome. La capacité des cellules dendritiques à responsabilitéd pour les signaux nécessaires pour l&#39;IL-1β sécrétion peut être testée en utilisant une purine synthétique, R848, qui est détecté par TLR8 dans monocyte humain dérivé des cellules dendritiques (moDCs) aux cellules de premier, suivie de l&#39;activation de l&#39;inflammasome NLRP3 avec la toxine bactérienne et ionophore de potassium, la nigéricine. Monocytes PED dérivés sont facilement produites dans la culture et fournissent beaucoup plus de cellules que des DC myéloïdes humaines purifiées. La méthode présentée ici se distingue d&#39;autres dosages de inflammasome en ce qu &#39;il utilise en humaine in vitro, à la place de la souris dérivée, DCs permettant ainsi l&#39;étude de l&#39;inflammasome dans la maladie humaine et l&#39;infection.

Ces techniques mesurent TLR8 amorçage avec R848. Coloration des cytokines intracellulaires pour la pro-IL-1β permet de microscopie et AAAF lectures du CD14 - CD11c + moDCs. Les deux techniques peuvent être quantifiés par rapport à une non apprêté, ou de repos, de contrôle de cellules ainsi que d&#39;un contrôle isotypique (figures 1 et 2). Pour cent des cellules pro-IL-1β + coloration est multiplié par la moyenne géométrique de cette population de fournir l&#39;intensité...

Les cellules dendritiques (DCs) sécrètent de l&#39;IL-1β en réponse à la reconnaissance de la purine TLR8 synthétique, R848, suivie de l&#39;activation de l&#39;inflammasome NLRP3 avec nigéricine, par conséquent, l&#39;IL-1β peut être utilisé pour mesurer l&#39;activité de inflammasome NLRP3. Coloration des cytokines intracellulaires, immuno, et ELISA sont utilisés pour mesurer avec précision NLRP3 inflammasome amorçage et l&#39;activation par l&#39;IL-1β expression.

Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l&#39;IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

L'objectif général des expériences suivantes est d'observer l'activité de l'inflammasome dans des cellules dendritiques humaines in vitro à l'aide de tests simples de détection de l'IL-1β. Ajoutez d'abord le R 8 48 aux cellules pour induire l'expression intracellulaire du pro-IL-1β. Ensuite, ajoutez du nige pour activer la formation de l'inflammasome NLRP3.Cela déclenche à son tour le clivage de la pro-IL-1β en IL-1β mature avant sa sécrétion. Ensuite, collectez les échantillons et mesurez la pro-IL-1β intracellulaire et l'IL-1β mature extracellulaire. Les résultats, obtenus en mesurant la sécrétion d'IL-1β à partir de cellules préparées et activées par immunofluorescence, immunobuvardage (western blot) et ELISA, démontrent que la stimulation préalable des DCS humaines induit la production intracellulaire de pro-IL-1β dans les cellules préparées avec R848, ainsi que la sécrétion d'IL-1β par les cellules à la fois préparées et activées avec Nigericine et LPS.Cette méthode peut fournir des informations sur le rôle de l'inflammasome NLRP3 dans la réponse des cellules dendritiques humaines à des ligands synthétiques. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes conçus pour tester des activateurs physiologiques tels que les bactéries, les virus et les maladies auto-inflammatoires. Prélevez une aliquote de 200 microlitres de cellules dendritiques dérivées de monocytes fraîchement isolées à l’état de repos dans une plaque de 96 puits à fond rond.Commencez par les quatre conditions standard : contrôle négatif non stimulé, préparation uniquement, activation uniquement, et préparation suivie d'activation. Ensuite, selon le plan expérimental, incluez des contrôles de diluant pour R 8 48 et la nissine ; pour les dosages intracellulaires de cytokines en aval, prévoyez des doublons pour les contrôles d'isotype afin de préparer l'inflammasome. AJOUTEZ R 8 48, ajoutez une concentration finale de 10 micromolaire dans les puits appropriés.Placer les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant 18 heures. Ensuite, pour activer l'inflammasome NLRP3, ajouter du nige à une concentration finale de 20 micromolaire. Remettre les cultures dans l'incubateur pendant six heures supplémentaires, puis récolter les échantillons en centrifugeant la plaque de culture à 974 ×g pendant trois minutes sans perturber les culots cellulaires.Transférez chaque surnageant dans une plaque distincte à fond rond afin de mesurer la sécrétion de cytokines par EISA. Lavez ensuite les culots cellulaires trois fois avec 200 microlitres de 1 XPBS pour éliminer toute IL-1β extracellulaire des échantillons cellulaires destinés à une analyse ultérieure par diverses techniques. Pour la détection par immunobuvardage de la pro-IL-1β, lysez directement les cellules dans 10 microlitres de tampon de lyse dénaturant. Après avoir transféré les lysats dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre, chauffez les échantillons 10 minutes à 100 degrés Celsius pour la détection fluorescente par cytométrie en flux de l'IL-1β.Ajouter 100 microlitres de milieu PHS à 5 % aux échantillons cellulaires et un microlitre d'anticorps marqués par fluorescence aux marqueurs phénotypiques ou au témoin d'isotype, puis incuber pendant 10 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Après trois lavages au PBS, fixer les cellules avec 100 microlitres de PFA à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Ensuite, ajouter 100 microlitres de tampon perméabilisant pendant 30 minutes, suivi de 62 nanogrammes d'anticorps anti IL-1β marqué au FSE ou au témoin d'isotype, puis incuber les échantillons pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de tampon perméabilisant et resuspendez-les dans un XPBS. Enveloppez les échantillons dans du papier d’aluminium et conservez-les à quatre degrés Celsius. Si vous détectez l’IL-1β par coloration microscopique, coloriez les cellules avec du DAPI, ajoutez une goutte de monture et placez délicatement une lamelle par-dessus une lame en verre.Laisser le prélèvement durcir toute la nuit avant de capturer les images de microscopie pour la détection fluorescente par cytométrie en flux. Acquérir les données un échantillon à la fois. Régler les fenêtres de diffusion avant et latérale sur les cellules vivantes, puis placer la fenêtre suivante sur les cellules CD11c positives et CD14 négatives.Enfin, analyser la population MODC en se basant sur la coloration de la pro-IL-1β dans les données d'acquisition microscopique. Régler le temps d'exposition à l'aide de l'échantillon traité par R 8 48 présentant une coloration positive. Puis déterminer le pourcentage de MODC exprimant la pro-IL-1β, facilitant la détection par immunobuvardage.Chargez le volume total de l'échantillon sur le gel de polyacrylamide. Faites migrer à 140 volts jusqu'à ce que le front coloré sorte du gel. Transférez les protéines du gel de polyacrylamide vers la membrane FL A-P-V-D-F immo.Obturer la membrane avec du BSA à 5 % dans du TBST pendant une heure. Incuber avec l'anticorps primaire en agitant à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après trois lavages de cinq minutes dans du TBST, incuber avec l'anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure ; après trois nouveaux lavages dans du TBST, imager la membrane lors de la mesure des cytokines sécrétées par ELISA : équilibrer les échantillons à température ambiante.Faire centrifuger les échantillons afin de regrouper la condensation du surnageant et suivre les instructions du fabricant pour la mesure de la coloration intracellulaire de l'IL-1β. La coloration de la pro-IL-1β permet des lectures en microscopie et par cytométrie en flux à partir de cellules dendritiques dérivées de monocytes CD11c positif et CD14 négatif. Les deux techniques peuvent être quantifiées par rapport à un contrôle de cellules non activées ou au repos, ainsi qu’à un contrôle d’isotype. Le pourcentage de cellules colorées pour la pro-IL-1β est multiplié par la médiane géométrique de cette population afin d’obtenir l’intensité médiane de fluorescence.L'IMF est comparable à la quantité de pro-IL-1β présente dans les cellules positivement marquées. Ici, des techniques de transfert immuno-bloquant sont utilisées pour mesurer la pro-IL-1β à partir des lysats cellulaires. Les données quantitatives sont exprimées relativement à un contrôle cellulaire interne tel que la bêta-tubuline, comme attendu.Le transfert immunologique pour la pro-IL-1β dans les cellules traitées à la ni-gérienne révèle une diminution de la pro-IL-1β. Ceci est complété par une augmentation concomitante de l'IL-1β dans les surnageants, mesurée par ELISA uniquement sur les conditions R 8 48, suivant le traitement à la ni-gérienne. La mesure simultanée d'autres cytokines inflammatoires telles que le TNF-α, l'IL-10 et l'IL-6 confirme que la ni-gérienne est spécifique dans l'induction de la sécrétion d'IL-1β.Le niveau d'initiation dépend du temps et de la dose. D'autres expériences, telles que la mesure de la concentration protéique extracellulaire, la détection par chimiluminescence de la génération de la forme mature de IO-1β ou le blocage de l'inflammasome, permettraient de déterminer si la IO-1β extracellulaire est la forme clivée mature et si la sécrétion de IO-1β dépend de l'activité de l'inflammasome NLRP3.

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