Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l'IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

L’objectif général des expériences suivantes est d’observer l’activité de l’inflammasome dans des cellules dendritiques humaines in vitro à l’aide de simples tests de lecture IL un bêta. Ajoutez d’abord R 8 48 aux cellules pour induire l’expression intracellulaire de pro IL one bêta. Ajoutez ensuite nige pour activer la formation de trois inflammasomes NLRP.

Cela déclenche à son tour le clivage de pro IL un bêta en IL mature un bêta avant la sécrétion. Ensuite, collectez les échantillons et mesurez les résultats intracellulaires pro IL one bêta et extracellulaires matures IL one bêta obtenus en mesurant la sécrétion d’IL 1 bêta à partir de cellules amorcées et activées par immunofluorescence, western blot et eli. Une détection a démontré que l’amorçage de la DCS humaine entraîne la production intracellulaire de pro IL one bêta dans les cellules amorcées R 8 48 et la sécrétion d’IL un bêta à partir de cellules à la fois amorcées et activées avec le juris nigérian.

Cette méthode peut donner un aperçu du rôle de l’inflammasome NLRP three dans la réponse des cellules dendritiques humaines aux ligands synthétiques. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes conçus pour tester des déclencheurs physiologiques tels que les bactéries, les virus et les maladies auto-inflammatoires. Aliquote 200 microlitres de cellules dendritiques dérivées de monocytes fraîchement isolées dans leur état de repos dans une plaque inférieure ronde de 96 biens.

Commencez par les quatre conditions standard du contrôle négatif non stimulé, de l’amorçage uniquement, de l’activation uniquement et de l’amorçage suivi de l’activation. Ensuite, selon la conception expérimentale, inclure des contrôles de diluant pour R 8 48 et nissin pour les tests de coloration des cytokines intracellulaires en aval inclure des duplicatas pour les contrôles d’isotype pour amorcer l’inflammasome. AJOUTER R 8 48, ajouter une concentration finale de 10 micromolaires aux puits appropriés.

Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 18 heures. Ensuite, pour activer l’inflammasome NLRP trois, ajoutez du nige à une concentration finale de 20 micromolaires. Remettez les cultures dans l’incubateur pendant six heures supplémentaires pour récolter les échantillons, centrifugez la plaque de culture à 974 fois G pendant trois minutes sans déranger les granules cellulaires.

Transférez chaque surnageant sur une plaque inférieure ronde distincte afin de mesurer la sécrétion de cytokines par EISA. Maintenant, lavez les pastilles cellulaires trois fois avec 200 microlitres d’un XPBS pour éliminer tout IL 1 bêta extracellulaire des échantillons cellulaires pour une analyse plus approfondie par une variété de techniques pour la détection par transfert Western de Pro IL un bêta lyce les cellules directement dans 10 microlitres de tampon de lyse dénaturant. Après avoir transféré les lysats dans des tubes einor de 1,5 millilitre, chauffez les échantillons pendant 10 minutes à 100 degrés Celsius pour une détection fluorescente par cytométrie en flux de IL un bêta.

Ajoutez 100 microlitres de milieu PHS à 5 % aux échantillons cellulaires et un microlitre d’anticorps marqués par fluorescence aux marqueurs de phénotype ou au contrôle des isotypes incubez pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après trois lavages PBS, fixez les cellules avec 100 microlitres de PFA à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon perméable pendant 30 minutes, suivis de 62 nanogrammes d’anticorps anti-IL, d’un anticorps bêta FSE ou d’échantillons de contrôle d’isotype pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de tampon perméable et remettez-les en suspension dans un XPBS. Enveloppez les échantillons dans du papier d’aluminium et conservez-les à quatre degrés Celsius. Si vous détectez IL un bêta par microscopie, colorez les cellules avec dappy, ajoutez une montagne et placez doucement une lamelle sur une lame de verre.

Laissez la montagne durcir pendant la nuit avant de capturer des images de microscopie pour une détection fluorescente par cytométrie en flux. Acquérez des données un échantillon à la fois. Placez les portes diffusées vers l’avant et latéralement sur les cellules actives Porte suivante sur le CD 11 C positif CD 14 cellules négatives.

Enfin, analysez la population MODC sur la base de la coloration pro IL one bêta dans l’acquisition de données de microscopie. Réglez le temps d’exposition avec la coloration positive R 8 48 échantillon traité. Déterminez ensuite le pourcentage de pro IL one bêta exprimant MO dcs ease pour la détection par western blot.

Chargez le volume total de l’échantillon sur le gel de polyacrylamide. Fonctionne à 140 volts jusqu’à ce que la face de la matrice s’échappe du gel. Transférez la protéine du gel de poly acrylamide sur A-P-V-D-F immo sur la membrane FL.

Bloquez la membrane avec 5 % de BSA dans du TBST pendant une heure. Incuber avec l’anticorps primaire tout en agitant à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après trois lavages TBST de cinq minutes, incuber avec l’anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure, après trois autres lavages TBST, imager la membrane lors de la mesure des cytokines sécrétées par ELI SA équilibrer les échantillons à température ambiante.

Tournez les échantillons pour consolider la condensation surnageante et suivez les instructions du fabricant pour la mesure de l’IL un bêta Coloration des cytokines intracellulaires pour pro IL un bêta permet la microscopie et la lecture des faits à partir de cellules dendritiques dérivées de monocytes CD 11 C positifs et négatifs CD. Les deux techniques peuvent être quantifiées par rapport à un contrôle de cellule non prime ou au repos ainsi qu’à un contrôle d’isotype. Le pourcentage de cellules de coloration bêta pro IL one est multiplié par la médiane géométrique de cette population pour fournir l’intensité fluorescente médiane.

L’IMF est comparable à la quantité de pro IL one bêta présente dans les cellules de coloration positives. Ici. Des techniques d’immuno-transfert sont utilisées pour mesurer le pro IL one bêta des lysats cellulaires. Les données quantitatives sont exprimées par rapport à un contrôle cellulaire interne tel que la bêta-tubuline, comme prévu.

L’immuno-transfert pour pro IL one bêta dans les cellules traitées NI Nigerian révèle une diminution de pro IL one bêta. À cela s’ajoute une augmentation concomitante de l’IL un bêta chez les surnageants, mesurée par E ELI a seulement un R 8 48, suivie des conditions NI nigérianes. La mesure simultanée d’autres cytokines inflammatoires telles que T NF alpha IL 10 et IL six garantit que le Niger est spécifique dans la cause de la sécrétion de IL un bêta.

Le niveau d’amorçage dépend du temps et de la dose. D’autres expérimentations, telles que la mesure de la concentration en protéines extracellulaires ex, la détection de la chimiluminescence à partir d’une génération bêta mature I ou le blocage de l’inflammasome, aideraient à déterminer si IO 1 bêta extracellulaire est la forme clivée mature et si la sécrétion bêta IO 1 est nlrp. Trois activités inflammatoires dépendantes.