L'utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter la modulation des récepteurs couplés aux protéines G par les canaux potassiques, en utilisant des biocapteurs optiques sans marquage basés sur le classement de la longueur d'onde de résonance afin d'atteindre cet objectif. Des cellules HEK 293 non transfectées et des cellules HEK 293 exprimant de manière stable le canal potassique activé par le sodium de rat Slack B sont placées dans une plaque de biocapteur optique à 384 puits et incubées toute une nuit. Ensuite, une mesure de référence de la masse au voisinage de la membrane plasmique est effectuée, puis des agonistes des récepteurs couplés aux protéines G endogènes, ou RCPG, sont ajoutés. Dans la dernière étape, la variation du signal résultant de l'activation des RCPG est mesurée et la modulation de cette réponse par le canal potassique est calculée.

En fin de compte, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des neurosciences et de la signalisation cellulaire en mesurant quantitativement les mécanismes de signalisation entre les récepteurs couplés aux protéines G et les canaux potassiques. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes pour étudier les interactions entre canaux et protéines, par exemple les dosages par co-précipitation, sont qu'elle peut être réalisée à l'aide de cellules vivantes et qu'elle ne nécessite pas l'utilisation d'étiquettes exogènes, qui pourraient modifier la structure de la protéine interagissante.

Et enfin, au sein des cellules vivantes, vous pouvez effectivement suivre les interactions en temps réel. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la signalisation entre les récepteurs couplés aux protéines G et les canaux potassiques, elle peut également être utilisée pour étudier les réponses cellulaires résultant de modifications induites par un ligand dans l’adhésion cellulaire, l’expansion, la toxicité, la prolifération, la migration, ainsi que toute variation de la proximité de la membrane plasmique par rapport au biocapteur optique.

La technique possède également le potentiel d'être utilisée dans la découverte de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies provoquées par des anomalies des canaux ioniques ou des récepteurs, telles que de nombreuses channelopathies, car elle peut être employée comme méthode à haut débit pour tester les effets d'agents pharmacologiques sur les protéines canal. Interactions protéiques. Nous avons eu pour la première fois l'idée d'utiliser cette méthode lorsque nous avons réalisé qu'il était nécessaire de développer un test permettant d'examiner les interactions entre protéines canal dans des cellules vivantes.

Commencez le revêtement de la plaque de biosenseur optique 384 puits en hydratant une plaque de dioxyde de titane avec 20 microlitres par puits d'eau stérile pour culture tissulaire pendant 15 minutes. Ensuite, utilisez une pipette multicanal à 16 canaux pour laver la plaque une fois avec 50 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS par puits.

Ensuite, ajouter 20 microlitres d'une solution travail de fibronectine préparée dans chaque puits avant d'incuber pendant deux heures à température ambiante afin de former la matrice extracellulaire ou ECM après l'incubation. Laver la plaque une fois avec 50 microlitres de PBS par puits, puis ajouter 40 microlitres d'une solution travail d'ovalbumine préparée dans chaque puits.

Incuber la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius pour bloquer la plaque après la liaison de l'ovalbumine. Laver la plaque trois fois avec 50 microlitres de PBS par puits. Les plaques revêtues de matrice extracellulaire peuvent être conservées à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à quatre huit heures.

Retirer le milieu de croissance des cellules HEK 293 non réséquées et des cellules HEK 293 exprimant de manière stable Slack B, cultivées comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, ajouter de la trypsine pour détacher les cellules de la plaque. Rassembler les cellules par centrifugation à 1000 × g pendant une minute.

Éliminer le milieu de tripsine et resuspendre les cellules dans du milieu de croissance. À l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé, déterminer la concentration des cellules afin de minimiser les effets de l’évaporation pendant l’incubation, puis diluer les cellules pour obtenir le nombre souhaité de cellules par puits. Pour ces expériences, utiliser un volume de 50 microlitres de milieu de croissance contenant 1000 cellules par puits.

ont été ensemencées sur le biocapteur après avoir pipeté 50 microlitres des cellules diluées dans chaque puits ; les cellules adhérées ont ensuite été incubées toute la nuit dans du milieu de croissance à 37 degrés Celsius, 5 % CO2, afin de préparer le dosage par biocapteur optique à gradation de longueur d'onde de résonance (RWG). Après l'incubation, retirez le milieu de croissance des cellules.

Lavez les cellules une fois avec une solution saline équilibrée de Hank, puis ajoutez 25 microlitres de la solution à chacune. Placez la plaque de biosenseur sur le lecteur de liaison et laissez les cellules s'équilibrer à température ambiante pendant une à deux heures. Pendant ce temps, préparez une plaque de composés distincte à partir de laquelle les ligands d'intérêt seront ajoutés à la plaque de biosenseur durant le dosage.

Pour ces essais, 25 microlitres de solution contenant le composé ont été ajoutés dans chaque puits de la plaque de biosenseur, pour un volume total de 50 microlitres. Pour réaliser l'essai de biosenseur optique RWG, effectuez une mesure de ligne de base à l’aide du système de numérisation pour les puits allant de A1 à P12, qui représentent la moitié de la plaque 384 puits. Utilisez une résolution maximale de 3,75 micromètres par pixel pour les 1,5 millimètres centraux de chaque puits, à l’aide du logiciel d’analyse « bind scan ». Cette numérisation de référence prendra environ 30 minutes.

Ensuite, ajoutez 25 microlitres des solutions du composé dans chaque puits des puits A1 à P12. Ensuite, effectuez une mesure de référence des puits A13 à P24. Après avoir effectué la mesure de référence de ces puits, ajoutez 25 microlitres des solutions du composé dans chacun des puits A13 à P24.

Comme étape finale, effectuez une mesure post édition du composé pour les puits de A1 à P12, puis répétez pour les puits de A13 à P24. Pour analyser les données du test, ouvrez les données du test de liaison correspondant à la mesure de référence dans Windows, puis cliquez sur le bouton de l’éditeur de grille afin d’activer la sélection des cellules. Le logiciel calculera les paramètres d’intérêt définis par l’utilisateur ; ouvrez les greffons, qui incluent le chercheur de cellules, puis définissez les paramètres de la fonction de référence dans le chercheur de cellules de manière à ce que les cellules soient distinguables du fond du biocapteur.

Exporter le fichier de carte cellulaire, qui contient les données du détecteur de cellules pour la mesure de référence. Répéter ces étapes pour les données après l'ajout du composé. Ensuite, ouvrir la référence ou le module complémentaire et importer la carte cellulaire à partir de la mesure de référence.

Le logiciel calculera le décalage de la valeur de la longueur d'onde maximale ou PWV entre les données d'arrière-plan et celles obtenues après l'ajout du composé. Sélectionnez « delta cell mean » pour obtenir la moyenne des décalages de PWV pour les cellules. Les données peuvent ensuite être exportées vers Microsoft Excel pour une analyse complémentaire.

Slack b transfecté de façon stable, HEK 293. Les cellules et les cellules HEK 293 témoins non transfectées ont été ensemencées à 1000 cellules par puits dans des plaques biosenseurs RWG à 384 puits revêtues de matrice extracellulaire. Des cartes de gradient de densité de masse ont été générées avant et 30 minutes après l'ajout du composé à l'aide du scan de liaison.

Les zones logicielles indiquées en rouge représentent les pixels identifiés comme appartenant aux cellules, tandis que les lignes jaunes délimitent les cellules par rapport au fond gris de la plaque. Le logiciel bind view a été utilisé pour déterminer le décalage de la valeur de longueur d'onde de pointe (PWV) après l'ajout d'un agoniste de récepteur couplé aux protéines G (GPCR), en soustrayant la PWV après l'ajout du composé de la PWV de base. Ce phénomène est illustré par un dégradé de couleurs où le rouge indique un décalage positif de la valeur de longueur d'onde de pointe et le bleu absence de changement.

Le récepteur muscarinique endogène de type M1 face à la carbamylcholine a été appliqué à la fois à des cellules HEK 293 non résectées servant de témoin et à des cellules HEK 293 exprimant de manière stable la sous-unité Slack B, entraînant une augmentation positive de la valeur de la longueur d'onde maximale par rapport aux cellules témoins. Les cellules transfectées avec Slack B ont présenté une augmentation plus importante de la valeur de la longueur d'onde maximale. Le peptide S-F-L-L-R-NH₂, sel de trifluoroacétate, et le pentapeptide activateur du récepteur de la thrombine en position terminale, qui exerce une activité d'agoniste vis-à-vis du récepteur couplé aux protéines G activé par une protéase (récepteur activé par la protéase de type 1), ont également montré des réponses différentes entre les cellules non résectées et celles transfectées avec Slack B.

Ces résultats montrent que la présence du canal Slack B augmente significativement le décalage de la VPO observé lors de l'activation des récepteurs GPCR endogènes dans les cellules K, et démontrent la faisabilité d'utiliser cet essai pour étudier les interactions entre protéines canales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment développer et réaliser un essai de biosenseur optique sans marquage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours, à condition que les cellules et les réactifs aient été préparés soigneusement lors de la tentative de cette procédure.

Il est important de garder à l'esprit que les paramètres du test, tels que le nombre de cellules à semer, le temps d'incubation des ligands, etc., doivent être optimisés pour chaque lignée cellulaire. Une fois cette procédure réalisée, vous pouvez utiliser d'autres méthodes, telles que R et l'IA, afin d'identifier les protéines spécifiques nécessaires au changement observé du signal. N'oubliez pas que le travail avec des cultures cellulaires humaines peut présenter des risques extrêmement élevés, et que des précautions, comme l'utilisation d'une hotte de sécurité biologique, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.