Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l'architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser le système de culture tridimensionnel comme moyen de distinguer le phénotype mammaire bénin du phénotype mammaire malin. Ceci est accompli en plaçant d’abord les cellules de contrôle et expérimentales en trois exemplaires sur une couche de matrigel à facteur de croissance réduit dans une lame de chambre à huit puits. La deuxième étape consiste à apporter des changements de milieu complets et frais avec 2 % de GFR Matrigel tous les quatre jours, permettant aux colonies de type stupide de se développer pendant 10 à 15 jours.

Ensuite, les images en contraste de phase des colonies de type ASER cultivées en 3D sont acquises à une résolution de cinq fois. La dernière étape consiste à traiter les cultures de type aser pour l’analyse immunochimique avec des marqueurs moléculaires pertinents, suivie de l’acquisition d’images confocales de deux colonies de type immuno-coloration en C au niveau de la section médiane. En fin de compte, le contraste de phase et les images confocales des cellules cultivées en culture 3D sont utilisés pour identifier les changements phénotypiques et moléculaires cellulaires et ainsi différencier les cellules mammaires bénignes des cellules malignes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les cultures bidimensionnelles, les tests d’invasion ou de migration, est qu’elle peut récapituler l’architecture tissulaire du sein bénin et sa perte d’organisation lors de la transformation maligne. Ainsi, cette technique peut être utilisée efficacement pour différencier les cellules mammaires bénignes des cellules malignes malignes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer du sein, telles que le défaut des voies de signalisation sur le phénotype cellulaire, et à identifier de nouvelles voies oncogéniques et/ou suppressives de tumeurs.

Pour commencer l’expérience, décongelez le facteur de croissance réduit ou le matrigel GFR à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, réchauffez l’ensemble du média HME à 37 degrés Celsius et placez une lame de chambre à huit puits sur de la glace pour qu’elle refroidisse. Ajoutez 40 microlitres de GFR Matrigel au centre de chaque puits de la lame pré-refroidie.

Étalez le gel aussi uniformément que possible à l’aide d’une pointe de pipette P 200, en évitant les bulles et l’étalement excessif, ce qui peut entraîner la formation d’un ménisque. Ensuite, solidifiez le matrigel en incubant la lame à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant que le matri gel solidifie les yeux de trypsine, les cellules HME, puis rassemblez-les dans un tube de 15 millilitres et faites tourner les cellules à 150 fois la gravité pendant quatre minutes, comptez les cellules et diluez-les à 12 500 cellules par millilitre. Dans un milieu complet, ajoutez du matrigel GFR à la suspension cellulaire à une concentration finale de 2 % et ajoutez 400 microlitres de la solution dans chaque puits de la lame de chambre précodée.

Placez ensuite la lame dans un incubateur tamponné au CO2. Remplacez le support par un support complet et frais tous les quatre jours pendant 15 jours. Pour les études sur les inhibiteurs, ajoutez des inhibiteurs à petites molécules dans le milieu complet au moment de l’ensemencement, suivis de changements de milieux frais complétés par les inhibiteurs tous les trois jours pour commencer la croissance des cellules et triplez pour chaque série de traitement.

Prenez des images en contraste de phase des structures ASER de chaque puits à une résolution de cinq fois à l’aide d’un microscope à contraste de phase fixé à un décaleur de diapositives et à un ordinateur. Prenez les images en déplaçant la diapositive d’une image à l’autre, en couvrant tout le puits de la lame chambrée sur toute la largeur. Comptez le nombre total de structures aser, le nombre de structures plates rondes simples et le nombre de structures multi-aser ou de structures à croissance aléatoire manquant d’organisation.

Et avec les processus de ramification émanant, calculez le pourcentage de structures plates rondes simples par rapport aux structures malignes et tracez les informations. Sous forme de graphique à colonnes. Calculez la signification à l’aide du test T d’étudiant bilatéral non apparié.

Préparez les réactifs pour la coloration par immunofluorescence comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Ensuite, utilisez une pipette P 200 pour aspirer soigneusement le milieu conditionné. Fixez ensuite l’ASIN ou les structures avec du paraformaldéhyde 2 % fraîchement préparé à température ambiante pendant 20 minutes après la fixation, perméez les cellules avec 0,5 % de tritton X 100 pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez les cultures trois fois avec 100 millimètres de glycine pendant 10 à 15 minutes à chaque lavage. Ensuite, bloquez les cellules dans la mémoire tampon de bloc primaire pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les cultures dans 20 microgrammes par millilitre de fragment de chèvre anti souris fab two dans le tampon de bloc primaire, également appelé la deuxième solution de blocage pendant 30 minutes pour bloquer les espèces IgG de souris amino react dans le matrigel.

Après le blocage, incubez les cellules avec l’anticorps primaire dans une deuxième solution de blocage pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules trois fois avec un tampon d’immunofluorescence ou un tampon I avec un balancement doux pendant 10 à 15 minutes pour chaque lavage. Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents dans le tampon if F pendant 45 minutes.

Ensuite, lavez les cellules trois fois pendant 10 minutes chacune avec un tampon if F et un balancement doux. Montez les lames avec un DPI contenant un réactif anti-décoloration pour visualiser les noyaux. Laissez les lames sécher toute la nuit à température ambiante.

Ensuite, acquérez des images confocales au milieu de la colonie des cellules qui se développent au-dessus du matrigel et une série de coupes optiques sur toute la longueur de la structure asner en empilant z des images confocales de cellules contrôlées par DHE et C CN colorées par DPI, six cellules knockdown le cinquième jour montrent que les cellules knockdown manquent d’organisation. Au 15e jour, la croissance des cellules témoins s’arrête avec des ASIN différenciés ou des structures et une lumière bien définie qui divergent des cellules knockdown, qui présentent un phénotype ramifié et tubulaire invasif. La coloration immunofluorescente montre la perte d’expression de la laminine par rapport à l’intégrine alpha six et de l’herrine ECA, indiquant respectivement la perturbation de la membrane basale, la perte de polarité basale et le contact cellulaire avec les cellules.

Dans les cellules malignes, les cellules de contrôle présentent une couche intacte autour de l’expression basale asinine de l’expression anormale de l’intégrine alpha six, de l’expression apicale de GM un 30 et de l’eca. Ici, à la jonction cellulaire, le phénotype malin des cellules HME knockdown de CCN six a été inversé avec un traitement exogène de la protéine CCN six humaine recombinante purifiée deux lignées de cellules mammaires hautement métastatiques, certaines 1 49 et M-D-A-M-B 2 31. Ils ont été traités avec des inhibiteurs de la carte kinase P 38, SB 2 0 3 8 50 et SB 2 0 2 1 90, ce qui a réduit le comportement malin.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver des cellules mammaires en culture 3D et d’utiliser efficacement la croissance sino like sur matrigel comme lecture pour différencier les phénotypes de cellules mammaires bénignes des cellules malignes malignes.