Néonatale Pial électroporation de surface

L’objectif global de cette procédure est de marquer génétiquement et de manipuler les progéniteurs neuraux de la surface du pelage. Pour ce faire, il suffit d’insérer d’abord une pipette en verre remplie d’une solution d’ADN plasmatique dans la région de la surface du pelage. La deuxième étape consiste à injecter l’ADN dans l’espace méningé, recouvrant la surface de la peau.

Ensuite, les électrodes sont orientées de manière à fournir correctement le courant à la surface du pelage. La dernière étape consiste à électroporer l’ADN en progéniteurs de surface de pelage par application de courant. En fin de compte, cette méthode peut être combinée à d’autres techniques pour montrer l’histoire naturelle et les déterminants moléculaires de la surface de la peau, de la prolifération des progéniteurs neuraux, de la migration et/ou de la différenciation.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transduction virale sont que l’électroporation est plus sûre, plus flexible et ne nécessite pas la création de particules virales ou d’emballage. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches neurales et des cellules progénitrices, telles que la contribution de ces progéniteurs de surface de peeling aux tissus, l’histogenèse et la fonction des circuits neuronaux. Pour commencer, utilisez un extracteur de pipette pour former des pipettes à partir de tubes capillaires en verre une fois tirées, coupez la pointe avec des ciseaux tranchants.

Ensuite, préparez une solution de bouillon vert rapide à 1 % en utilisant de l’eau filtrée sans nucléases. Après avoir dilué le tampon EDTA d’intérêt de l’ADN plasmatique libre d’endotoxines, combinez-le dans les proportions appropriées à la solution verte rapide à 1 %. À l’aide d’une pipette standard, placez la quantité souhaitée de mélange plasmidique à injecter sur un morceau de film de cire de paraffine pour référence.

Ensuite, à l’aide d’un micro-injecteur, insérez soigneusement la pipette en verre assemblée dans le tube contenant le mélange de plasmides. Évitez de toucher l’embout sur les bords du tube pour éviter de le casser. Aspirez la solution dans la pipette en réduisant lentement le cadran de transfert.

Une fois qu’un volume suffisant a été chargé, composez vers l’avant jusqu’à ce que la pression revienne à la position neutre de zéro. Hector Pascals. Ensuite, placez l’embout à côté de l’injection de référence et utilisez la pédale du micro-injecteur pour éjecter un volume.

Ajustez la pression jusqu’à ce que la quantité soit égale au volume de référence précédemment pipeté. Après avoir calibré le volume d’injection, récupérez les animaux pour l’injection plasmidique. Une fois la profondeur de l’anesthésie confirmée, tenez le chiot à l’aide du pouce et de l’index de la main la moins dominante.

Utilisez la main dominante pour cibler la région souhaitée, les hémisphères corticaux et d’autres structures superficielles telles que les collicules supérieurs doivent être facilement visibles. Une fois que l’emplacement correct a été identifié, insérez la pipette au-delà de la peau et du crâne. Prendre soin d’éviter les artères cérébrales.

Pour cibler la surface du pelage, arrêtez immédiatement d’avancer la pipette Dès que le crâne a été pénétré avec la pointe de la pipette dans la bonne position, injectez la solution plasmidique à l’aide de la pédale du micro-injecteur Après l’injection, retirez délicatement la pipette. Empêchez l’embout de sécher et de se boucher entre les injections en le plaçant dans les gouttelettes de test situées sur le film de paraffine. Répétez ces étapes jusqu’à ce que tous les chiots soient injectés pour augmenter la conductance et éviter de brûler la peau.

Couvrez les TRO de trois millimètres en platine avec du gel d’électroporation. Ensuite, ajustez les paramètres électro pour les injections dans le cortex. Placez la sonde chargée négativement sur la zone injectée et la sonde chargée positivement autour de la région controlatérale sous l’œil.

L’orientation de l’électrode doit être à un angle de 45 à 60 degrés par rapport à la ligne médiane. Utilisez la pédale pour déclencher le courant et maintenez la pince à épiler TRO en place pendant trois à cinq impulsions. En fonction de l’âge et du poids du chiot, les impulsions doivent cibler l’ADN dans les cellules de surface de la peau sous-jacentes.

Le pôle négatif peut être balayé sur la zone d’injection. Entre les impulsions ou une électrode plus grande peut être utilisée pour augmenter la surface électro immédiatement après l’électroporation, nettoyez soigneusement le gel des chiots et placez-les sous une lampe chauffante pendant environ cinq minutes. Les chiots perdront de manière aiguë leur petit doigt rougeâtre naturel dans les minutes qui suivent l’électroporation due à la cyanose.

Observez les chiots pour la récupération de la couleur naturelle et l’initiation d’un mouvement normal avant de les ramener dans leurs cages ou des injections dans la colonne supérieure. Localisez la région cible juste en arrière et latéralement de Lambda et à peu près sur la ligne médiane, en suivant les mêmes étapes que celles qui viennent d’être démontrées. Avec des injections réussies, le mélange plasmidique remplit naturellement les contours de la colus supérieure.

Lors d’un fonctionnement électrique après des injections de colus supérieures, placez la sonde chargée négativement de l’électrode sur la zone injectée et la sonde chargée positivement autour de l’œil, du museau ou du menton. Dans ce cas, l’orientation de l’électrode est à un angle de 25 à 40 degrés par rapport à la ligne médiane. Cette image montre le cortex latéral dorsal après électroporation de plasmides rapporteurs fluorescents exprimant le trèfle marqué à membrane en vert et le marqueur bfp.

Deux protéines nucléaires montrées ici en pseudo-couleur rouge. Des dendrites étendues sont trouvées dans cet interneurone cortical environ deux mois après l’électroporation. Les cellules positives EGFP sont positives BRDU, ce qui indique qu’elles proliféraient pendant la procédure d’électroporation.

Lorsque vous essayez cette technique, il est important de se concentrer sur un ciblage approprié de la surface du pelage afin d’éviter de perturber le cortex sous-jacent et/ou le système vasculaire.