Ingénierie tissulaire de la tumeur stromale Microenvironnement avec application de Cancer Cell Invasion

L’objectif global de la procédure suivante est de générer une matrice native à partir de fibroblastes pour évaluer l’invasion des cellules tumorales. Ceci est accompli d’abord en cultivant des fibroblastes sur du plastique dans un milieu enrichi en acide sorbique pour générer la matrice native. Dans la deuxième étape, la matrice native est détachée et libérée de la surface de croissance en plastique, puis cette matrice est ensemencée de cellules tumorales et soulevée à l’interface air-liquide après une période déterminée.

Ces cultures 3D sont récoltées pour l’analyse histologique de l’invasion des cellules tumorales. En fin de compte, les effets de la matrice native des fibroblastes sur l’invasion des cellules tumorales peuvent être évalués par une analyse immunohistologique. Ainsi, l’avantage de cette technique pour générer des cultures 3D typiques est que nous pouvons évaluer la matrice native produite par les fibroblastes eux-mêmes en l’absence de substrats synthétiques ou étrangers, tels que le collagène de type un inter-espèces Commencez par ensemencer 200 000 fibroblastes par puits dans six plaques de puits dans un milieu de fibroblaste, complété par de l’acide IC fraîchement préparé.

Deux phosphates refed les cellules tous les deux à trois jours avec deux à cinq millilitres de milieu frais. Une épaisse couche de cellules noyées dans la matrice extracellulaire visible à l’œil nu se formera au bout de six semaines. Selon les cellules utilisées, la matrice visible peut se former tôt ou tard et peut commencer à se détacher de la parabole, comme on le voit ici.

Pour libérer cette couche de la plaque de culture tissulaire, grattez doucement la circonférence de la matrice avec une pointe de micro-pipette d’un millilitre, puis poussez les bords de la matrice vers le centre du puits. Les cellules et la matrice native doivent se détacher facilement de la surface de la plaque et flotter maintenant dans le support. Répartissez la matrice native à l’intérieur du support pour éviter qu’elle ne se replie sur elle-même.

Laissez la matrice native flotter et se remodeler pendant cinq jours, en continuant à changer de support tous les deux à trois jours en raison de la résistance à la traction et du remodelage intrinsèque. La matrice se contractera considérablement et se réduira à une matrice native plus petite mais plus épaisse, moment auquel elle sera prête à être utilisée. Pour l’essai d’invasion.

Pour l’essai d’invasion. Utilisez d’abord une pince émoussée pour transférer doucement la matrice native sur un filet en nylon. Une fois sur le filet, utilisez une pointe de micro-pipette d’un millilitre et une pince émoussée pour étaler doucement la matrice afin qu’elle soit aussi plate que possible.

Ensuite, étalez une petite quantité de vaseline sur une extrémité d’un cylindre clonal stérile par matrice. Placez ensuite les cylindres sur les matrices natives, vaseline vers le bas, pour assurer une étanchéité parfaite entre la matrice native et les anneaux clonaux. Ajoutez maintenant 250 000 cellules de carcinome épidermoïde cutané ou cellules SCC dans un milieu de croissance de site en carats dans les cylindres.

Une fois que les cellules SCC cutanées se sont installées sur la matrice native, retirez les cylindres, puis soulevez la matrice native en nylon et les cellules SEC cutanées jusqu’à l’interface air-liquide, et sur un support en treillis métallique d’acier inoxydable plié. Enfin, ajoutez le milieu de croissance des kératinocytes, complété par de l’acide sorbique jusqu’à ce que le niveau du milieu touche le fond de la matrice native, en changeant le milieu tous les deux à trois jours et en récoltant sept et 14 jours après l’ensemencement des cellules cutanées du SCC. Cette technique ouvre la possibilité d’examiner et de comparer le comportement invasif des cellules tumorales dans différents environnements stromaux 3D.

Comme le montrent ces images, l’invasion des kératinocytes cutanés du CSC RDEB était significativement retardée dans les matrices natives C sept surexprimant dans les panels droits par rapport aux témoins RDEB déficients en C sept dans les panels gauche. Le développement de cette technique a permis aux chercheurs d’évaluer directement l’influence de la matrice native produite par les fibroblastes sur les processus cellulaires tumoraux tels que l’invasion.