Reconstruction de 3-Dimensional Volume histologique et son application à l'étude de souris glandes mammaires

L’objectif général de la vidéo suivante est de présenter une approche de recalage d’images pour l’histologie tridimensionnelle, la reconstruction volumique afin d’étudier les changements dans la macrostructure cellulaire mammaire. Pour ce faire, les glandes mammaires sont excisées chez des souris trois jours après le début de la lactation chez les souris de type sauvage et de type insuline liant la protéine de liaison sept, IGF BP sept null. Les glandes sont ensuite traitées et intégrées dans des blocs de paraffine pour la section.

Ensuite, des images faciales du bloc optique des blocs de tissus sont capturées et le bloc de tissu est sectionné. Des images des coupes sont capturées et, à l’aide d’un logiciel personnalisé, chaque section est alignée avec l’image correspondante de la face du bloc afin de reconstruire le volume histologique de la glande mammaire. Les données qui en résultent mettent en évidence des différences de taille entre les glandes mutantes et les glandes de type sauvage.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale tridimensionnelle à deux volets, est qu’elle fournit des informations sur une plus grande étendue spatiale. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier et valider de nouvelles techniques et algorithmes en imagerie médicale volumétrique et en thérapies, ainsi que pour créer une analyse 3D haute résolution de différents organes. Ce volume histologique reconstruit représente fidèlement l’échantillon du procédé, sans erreur de recalage propagée.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que les souris nulles IGF P sept ont des portées plus petites et sont incapables de supporter plusieurs grandes portées, nous avons donc décidé d’étudier la structure de leurs glandes mammaires. Une fois que le tissu est incorporé dans la paraffine, utilisez un microtome rotatif pour couper le bloc jusqu’à ce que l’excès de paraffine soit éliminé. Ensuite, à l’aide d’une fraiseuse verticale, percez des trous d’un millimètre dans au moins deux coins du bloc de paraffine perpendiculairement à la cassette et montez le bloc de tissu sur le microtome rotatif.

Ensuite, pour installer le système d’imagerie faciale du bloc devant le microtome, placez une caméra avec un téléobjectif légèrement incliné par rapport à la surface du bloc de tissu. La caméra doit être connectée à un ordinateur devant le microtome. Placez ensuite une source lumineuse devant le bloc de sorte que la caméra capte la réflexion de la lumière du bloc.

Ajustez l’angle de la caméra jusqu’à ce que le tissu à la surface du bloc soit facilement distingué de la paraffine environnante. Capturez une image de la face d’un bloc optique. Ensuite, à l’aide du microtome, coupez des rubans de quatre sections de cinq microns d’épaisseur.

Transférez les rubans dans un bain d’eau froide, séparez les sections du ruban, puis prélevez les deuxième et quatrième sections de l’eau froide sur une lame. Transférez-les dans un bain d’eau chaude pour les défroisser. Le choix des deuxième et quatrième sections permet d’obtenir un espace de cinq microns entre les sections.

Une fois qu’ils sont défroissés, ils remontent, les sections du microscope sont lamellées en les ramassant. Comme précédemment, notez que la coupe, le montage et le plissement des sections peuvent provoquer des distorsions, telles que des déchirures, des plis, un rétrécissement et une dilatation. Ces artefacts compliquent le repérage des coupes histologiques.

Teindre les sections avec h et d à l’aide d’un colorant automatique. Ensuite, glissez les lames à l’aide d’une pantoufle automatique à l’aide d’un scanner de lames d’histologie numérique, numérisez les lames à la résolution d’intérêt. Pour ce protocole, le grossissement est de 20 x et la résolution est de 0,47 microns.

Cette section de la vidéo donne un aperçu du processus de recalage des images, qui est réalisé à l’aide d’un logiciel personnalisé développé dans notre laboratoire combiné à MATLAB c plus plus. À l’aide d’ITK, commencez par sous-échantillonner les images histologiques à la résolution des images de la face du bloc. Cela réduira les images histologiques d’un facteur 0,026.

Ensuite, pour la segmentation d’images et la sélection de points, ouvrez quelques images de faces de bloc dans MATLAB et utilisez l’outil de curseur de données pour mesurer les valeurs de pixels des trous de recalage. Utilisez la valeur moyenne des pixels comme seuil fixe pour segmenter les trous de repérage. Pour supprimer les segments supplémentaires, utilisez la circularité et la surface des objets segmentés pour conserver les trous et supprimer les segments supplémentaires.

Ensuite, pour chaque glande mammaire, sélectionnez une image de visage de bloc comme référence. Alignez les centres des trous de repérage du reste du bloc, faites face aux images sur les centres des trous de repérage de l’image de référence. Ensuite, à l’aide des transformations obtenues pour les trous de recalage, alignez les images de face de bloc pour les images de face de bloc alignées, segmentez manuellement ou extrayez le tissu de l’arrière-plan pour les sections h et d.

Utilisez la technique de seuillage OSU pour segmenter les images à partir de l’arrière-plan et créer des masques binaires des images histologiques. Ensuite, à l’aide de l’histogramme des objets étiquetés, identifiez et sélectionnez l’objet le plus dimensionnable dans chaque masque. Extrayez les points limites d’un pixel de large à partir des masques faciaux d’histologie et de bloc.

Ensuite, utilisez un algorithme de descripteurs de Fourier pour trouver la transformée rigide initiale entre les points limites de l’histologie et leurs images de face de bloc correspondantes. Cette transformation initiale inclut les facteurs de translation, de rotation et d’échelle. Transformez chaque image histologique avec la transformation initiale obtenue à l’étape précédente.

Pour affiner le repérage rigide, retirez les sections de bord à haute courbure du contour histologique à l’aide d’un filtre à bille roulante. Ensuite, à l’aide de la distribution uniforme, sélectionnez de manière aléatoire 500 points à partir des points limites histologiques restants. Transformez les points limites de l’histologie avec la transformation initiale obtenue à partir des descripteurs de Fourier.

Utilisez les points limites de la face du bloc et utilisez l’algorithme itératif des points les plus proches pour trouver la transformation rigide entre le bloc, les points limites de la face et l’histologie. Points limites aléatoires. Transformez ensuite les images histologiques obtenues à l’étape précédente pour créer une image visuelle du volume histologique dans le logiciel de visualisation 3D.

Moi vis labo, choisissez les modules, classez divers et ajoutez le module composé 3D à partir de fichiers 2D. Choisissez ensuite l’image dans le menu et ajoutez le module de conversion de propriété d’image. Enfin, ajoutez un module de vue 3D à partir des modules de visualisation 3D des visionneuses.

Double-cliquez sur composer 3D à partir de fichiers 2D pour charger les images et cliquez sur créer 3D. Ajustez la taille du voxel en double-cliquant sur la propriété de l’image, convertissez, et définissez la taille du voxel sur 0.018 0.018 0.01. Visualisez le volume en double-cliquant sur voir 3D.

Enfin, visualisez la pile d’images à un grossissement de cinq x en suivant les étapes du document d’accompagnement. Pour mieux caractériser la déficience des sept souris nulles, une reconstruction 3D des glandes mammaires a été réalisée comme décrit ici. Ces figures montrent les volumes histologiques reconstitués du type sauvage et des glandes mammaires nulles.

Notez que la glande mutante de droite est plus courte et plus étroite que le type sauvage de gauche, mais a à peu près la même profondeur que la glande de type sauvage à 1,06 millimètre et la glande nulle à 1,02 millimètre de profondeur. Remarquez également que les glandes de type sauvage à gauche ont peu de tissu stromal indiqué par la coloration rose à l’éoïne, tandis que les glandes nulles à droite semblent être principalement du tissu stromal. Ici, la coloration à l’hémat-toïne, qui identifie les cellules nucléées, montre que la glande nulle maintient sa densité tandis que la glande de type sauvage semble contenir principalement des structures glandulaires.

Pour approfondir cette étude, des images à plus haute résolution de la zone du ganglion lymphatique ont été alignées ici. On voit de grandes structures, qui auraient été remplies de lait. En revanche, la glande nulle I-G-F-B-P a peu de structures bien développées.

De plus, ces structures sont encombrées de fibroblastes comme des cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une reconstruction 3D d’un organe en reconstruisant des sections de série de scan. Bon. Maintenant, lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de nommer systématiquement les lames et les numérisations car il y aura un grand nombre des deux, et l’organisation séquentielle est la clé du succès Après cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’immunohistochimie pour des marqueurs cellulaires et pathologiques spécifiques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que, comment le système vasculaire imprègne-t-il une tumeur ?