Reconstruction de 3-Dimensional Volume histologique et son application à l'étude de souris glandes mammaires

L'objectif général de la vidéo suivante est de présenter une méthode d'inscription d'images pour l'histologie tridimensionnelle et la reconstruction volumétrique afin d'étudier les modifications de la macrostructure cellulaire du tissu mammaire. Pour ce faire, les glandes mammaires sont excisées chez des souris trois jours après le début de la lactation, chez des souris de type sauvage et chez des souris présentant une invalidation du gène du facteur de croissance insulinomimétique sept, IGF BP sept. Les glandes sont ensuite traitées et incluses dans des blocs de paraffine en vue de leur sectionnement.

Des images suivantes de la surface optique du bloc de tissu sont capturées, puis le bloc de tissu est sectionné. Des images des sections sont prises, et à l'aide d'un logiciel personnalisé, chaque section est alignée avec l'image correspondante de la surface du bloc afin de reconstruire le volume histologique de la glande mammaire. Les données obtenues mettent en évidence les différences de taille entre les glandes mutantes et de type sauvage.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la microscopie confocale tridimensionnelle en double, est qu'elle fournit des informations sur une étendue spatiale beaucoup plus grande. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier et valider de nouvelles techniques et algorithmes en imagerie médicale volumétrique et en thérapies, ainsi que pour réaliser des analyses tridimensionnelles à haute résolution de différents organes. Ce volume d'histologie reconstruit offre une représentation fiable de l'échantillon étudié, sans erreur d'enregistrement propagée.

L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous avons remarqué que les souris nulles pour l'IGF P sept ont des portées plus petites et sont incapables de maintenir plusieurs portées importantes, ce qui nous a amenés à étudier la structure de leurs glandes mammaires. Une fois le tissu inclus dans la paraffine, utilisez un microtome rotatif pour émousser le bloc jusqu'à ce que l'excès de paraffine soit retiré. Ensuite, à l'aide d'une fraiseuse verticale, percez des trous d'un millimètre dans au moins deux coins du bloc de paraffine perpendiculairement à la cassette, puis montez le bloc de tissu sur le microtome rotatif.

Ensuite, pour installer le système d'imagerie de la surface du bloc devant le microtome, placez un appareil photo muni d'un objectif télé à un léger angle par rapport à la surface du bloc de tissu. L'appareil photo doit être connecté à un ordinateur placé devant le microtome. Placez ensuite une source lumineuse devant le bloc de manière à ce que l'appareil photo capte le reflet de la lumière provenant du bloc.

Régler l'angle de la caméra jusqu'à ce que le tissu à la surface du bloc soit clairement distinguable de la paraffine environnante. Capturer une image optique de la face du bloc. Ensuite, à l'aide du microtome, couper des rubans de quatre sections de cinq micromètres d'épaisseur.

Transférez les rubans dans un bain d'eau froide, séparez les sections du ruban, puis prélevez à la spatule la deuxième et la quatrième section depuis l'eau froide et déposez-les sur une lame. Transférez-les ensuite dans un bain d'eau tiède pour les détendre et éliminer les rides. Le choix de la deuxième et de la quatrième section permet d'obtenir un espace de cinq micromètres entre les sections.

Une fois qu'elles sont déridées, remonter les sections sur les lames de microscope en les prélevant à l’aide d'une spatule. Comme précédemment, noter que la coupe, le montage et le déridage des sections peuvent provoquer certaines distorsions, telles que des déchirures, des plis, des rétrécissements ou des expansions. Ces artefacts compliquent l'alignement des sections d'histologie.

Colorer les sections avec l'hématoxyline et l'éosine à l'aide d'un colorateur automatique. Ensuite, appliquer les lamelles sur les lames à l'aide d'un couvre-objet automatique et numériser les lames à l'aide d'un scanner histologique numérique, à la résolution souhaitée. Pour ce protocole, le grossissement est de 20 x et la résolution est de 0,47 micromètre.

Cette section de la vidéo présente un aperçu du processus d'inscription d'images, qui est réalisé à l'aide d'un logiciel personnalisé développé dans notre laboratoire combiné à MATLAB c plus plus. En utilisant ITK, commencez par sous-échantillonner les images d'histologie à la résolution des images de face de bloc. Cela réduira les images d'histologie d'un facteur de 0,026.

Ensuite, pour la segmentation d'images et la sélection de points, ouvrez quelques images de surface de bloc dans MATLAB et utilisez l'outil de curseur de données pour mesurer les valeurs de pixel des trous de registration. Utilisez la valeur moyenne des pixels comme seuil fixe pour segmenter les trous de registration. Pour supprimer les segments supplémentaires, utilisez la circularité et la surface des objets segmentés afin de conserver les trous et d'éliminer les segments superflus.

Ensuite, pour chaque glande mammaire, sélectionnez une image de section de bloc comme référence. Alignez les centres des trous de repérage des autres images de section de bloc sur les centres des trous de repérage de l'image de référence. Puis, à l'aide des transformations obtenues pour les trous de repérage, alignez les images de section de bloc ; pour les images de section ainsi alignées, segmentez manuellement ou extrayez le tissu du fond pour les sections h et d.

Utilisez la technique de seuillage OSU pour segmenter les images à partir du fond et créer des masques binaires des images d'histologie. Ensuite, à l'aide de l'histogramme des objets étiquetés, identifiez et sélectionnez l'objet le plus volumineux dans chaque masque. Extrayez les points de contour d'un pixel de largeur à partir des masques d'histologie et de surface de bloc.

Ensuite, utilisez un algorithme de descripteurs de Fourier pour déterminer la transformation rigide initiale entre les points limites des images d'histologie et leurs images correspondantes de la surface du bloc. Cette transformation initiale inclut les facteurs de translation, de rotation et d'échelle. Transformez chaque image d'histologie à l'aide de la transformation initiale obtenue à l'étape précédente.

Pour affiner l'inscription rigide, supprimez les sections des bords à forte courbure du contour histologique à l'aide d'un filtre de type « rolling ball ». Ensuite, sélectionnez aléatoirement 500 points selon une distribution uniforme parmi les points restants de la limite histologique. Transformez les points de la limite histologique à l'aide de la transformation initiale obtenue à partir des descripteurs de Fourier.

Utilisez les points limites de la surface du bloc et appliquez l'algorithme des points les plus proches itératifs pour déterminer la transformation rigide entre les points limites de la surface du bloc et l'histologie. Points limites aléatoires. Ensuite, transformez les images d'histologie obtenues à l'étape précédente afin de créer une image visuelle du volume d'histologie dans le logiciel de visualisation 3D.

Dans Me vis lab, sélectionnez les modules, puis le module Fichier divers et ajoutez le module Composer 3D à partir de fichiers 2D. Ensuite, choisissez Image dans le menu et ajoutez le module Convertir la propriété de l'image. Enfin, ajoutez un module Afficher 3D parmi les modules de visualisation des visualiseurs 3D.

Double-cliquez sur Composer 3D à partir de fichiers 2D pour charger les images, puis cliquez sur Créer 3D. Ajustez la taille du voxel en double-cliquant sur Propriété de l'image Convertir, puis définissez la taille du voxel à 0.018 0.018 0.01. Visualisez le volume en double-cliquant sur Afficher 3D.

Enfin, visualisez la pile d'images à un grossissement de cinq fois en suivant les étapes décrites dans le document accompagnant. Afin de mieux caractériser le déficit du souris nulle pour I-G-F-B-P sept, une reconstruction 3D des glandes mammaires a été réalisée comme décrit ici. Ces figures montrent les volumes d'histologie reconstruits des glandes mammaires de type sauvage et nulles.

Remarquez que la glande mutante à droite est plus courte et plus étroite que la glande de type sauvage à gauche, mais présente une profondeur à peu près identique, la glande de type sauvage mesurant 1,06 millimètre et la glande nulle 1,02 millimètre de profondeur. Observez également que les glandes de type sauvage situées à gauche comportent peu de tissu stromal, indiqué par la coloration rose à l'éosine, tandis que les glandes nulles à droite semblent principalement constituées de tissu stromal. Ici, la coloration à l'hématotoxyline, qui met en évidence les cellules nucléées, montre que la glande nulle conserve sa densité, tandis que la glande de type sauvage semble contenir principalement des structures glandulaires.

Pour approfondir cette analyse, des images à plus haute résolution de la région du ganglion lymphatique ont été alignées ici. On observe de grandes structures qui auraient été remplies de lait. En revanche, la glande déficiente pour I-G-F-B-P sept présente peu de structures bien développées.

De plus, ces structures sont densément peuplées de cellules de type fibroblaste. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer une reconstruction 3D d'un organe en reconstituant des séries de coupes issues de scans. Bien. À présent, lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de nommer systématiquement les lames et les scans, car leur nombre sera important, et l'organisation séquentielle est la clé du succès de cette méthode.

D'autres méthodes, telles que l'immunohistochimie pour des marqueurs cellulaires et pathologiques spécifiques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme : comment la vascularisation pénètre-t-elle une tumeur ?