Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

L'objectif général de l'expérience suivante est de surveiller l'interaction de deux protéines exprimées dans des feuilles entières de tabac. Cela est réalisé en concevant des constructions appropriées, en fusionnant les deux gènes d'intérêt avec des protéines fluorescentes divisées, puis en transformant ces constructions dans des bactéries agro. Dans un deuxième temps, des cultures de bactéries agro sont mélangées et injectées dans des feuilles de tabac, ce qui conduit à l'expression des protéines et à un signal fluorescent reconstitué.

Si les protéines entrent en proximité étroite, des feuilles entières ou des protoplastes isolés sont ensuite analysés au microscope. Les résultats obtenus montrent des interactions entre protéines en fonction du signal fluorescent émis, détecté par microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport à des méthodes existantes telles que la co-immunoprécipitation ou le système deux-hybride chez la levure est que l'interaction entre protéines peut être directement surveillée dans la cellule végétale vivante.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, comme la formation de complexes protéiques dans divers compartiments cellulaires. Pour commencer cette procédure, faire croître les bactéries agro destinées à la transformation des feuilles de tabac. Inoculer 10 millilitres de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés avec 50 microlitres de la culture stock de glycérol AG L1 contenant le plasmide d'intérêt dans un tube stérile de 50 millilitres.

Incuber à 28 degrés Celsius pendant au moins 24 heures, sous agitation à 190 tr/min, jusqu'à ce que la culture atteigne une DO 600 comprise entre 1,0 et 2,0 le jour suivant. Centrifuger les bactéries à 3000 × g pendant 15 minutes. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendre le culot dans un milieu d'infiltration fraîchement préparé et ajuster la suspension à une DO 600 de 1,0.

Incuber les cellules agrobactériennes dans un agitateur rotatoire pendant deux heures à l'obscurité et à température ambiante pour l'infiltration des feuilles de tabac. Choisir plusieurs feuilles âgées provenant d'une plante de tabac âgée de trois semaines. Mélanger des volumes égaux.

Trois millilitres de chacune des bactéries agrobactériennes portant les constructions d'intérêt. Remplir une seringue de cinq millilitres sans aiguille avec le mélange de suspension cellulaire afin d'injecter la suspension dans les feuilles de tabac. Appuyer délicatement la seringue sur l'abaxial des feuilles en plusieurs endroits, arroser les plantes et les laisser couvertes et protégées de la lumière pendant deux jours.

Pour isoler des protoplastes à partir d'une feuille infiltrée, placez d'abord la feuille dans une boîte de Pétri et ajoutez une solution enzymatique fraîchement préparée. À l'aide d'une lame de rasoir neuve, découpez la feuille en morceaux d'environ 0,5 centimètre carré. Ensuite, transférez les morceaux de feuille avec la solution enzymatique sous vide.

Flacon d'infiltration. Effectuez une infiltration sous vide pendant environ 20 secondes, jusqu'à ce que des bulles d'air émergent des feuilles. Relâchez très prudemment le vide.

Agiter le flacon pendant 90 minutes à 40 tr/min à l’obscurité et à température ambiante après 90 minutes. Libérer les protoplastes en agitant pendant une minute à 90 tr/min. Filtrer la solution à travers de la gaze dans un tube de centrifugation rond de 15 millilitres.

Recouvrir la solution de protoplastes avec deux millilitres de tampon FPCN et centrifuger pendant 10 minutes à 70 ×g avec une accélération et une décélération lentes, à température ambiante. Les protoplastes intacts s'accumuleront à l'interface entre la solution enzymatique et le FPCN ; à l’aide d’une pipette d’un millilitre à orifice large, transférer les protoplastes intacts dans un tube de centrifugation neuf. Pour réussir cette procédure, utiliser systématiquement des embouts à orifice blanc afin d’éviter la rupture des protoplastes intacts.

Remplir le tube avec du tampon W5 et centrifuger pendant deux minutes à 100 × g avec une accélération et une décélération lentes. Pour faire précipiter les protoplastes, retirer soigneusement le surnageant et resuspendre le culot dans environ 200 microlitres de tampon W5, selon la quantité de protoplastes.

Pour préparer un échantillon de protoplastes pour la microscopie à balayage laser, placez d'abord deux petites bandes de scellant à environ deux centimètres d'intervalle sur une lame de microscope. Déposez 20 microlitres de la solution de protoplastes entre les bandes et posez délicatement une lamelle par-dessus. Les bandes de scellant empêcheront les protoplastes d'être écrasés par la lamelle.

Pour préparer un échantillon complet de feuille pour la microscopie à balayage laser, découpez un morceau de feuille d'un centimètre de longueur et placez-le sur une lame de microscope avec la face inférieure de la feuille tournée vers le haut. Ajoutez environ 30 microlitres d'eau. Placez une lamelle par-dessus et fixez-la fermement avec du ruban adhésif des deux côtés.

L'imagerie est réalisée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser de type MICCA TCS SP five pour l'agrandissement. Utilisez un objectif d'un grossissement de 63 x avec du glycérol comme milieu d'imagerie, et utilisez le logiciel Leica Application Suite Advanced Fluorescence pour l'évaluation. Réglez le laser Argonne à 30 % et la puissance du laser à 488 nanomètres à une intensité de 18 %. Pour surveiller le signal à 515 nanomètres, réglez la bande passante d'émission du premier détecteur PMT entre 495 et 550 nanomètres.

Pour surveiller l'autofluorescence de la chlorophylle, réglez une deuxième bande passante d'émission du détecteur PMT entre 650 et 705 nanomètres. Pour surveiller le signal M cherry, utilisez le laser HENI 5 61.

Réglez l'intensité du laser à 18 % et une bande passante d'émission d'un troisième détecteur PMT comprise entre 587 et 610 nanomètres. Assurez-vous que les images provenant de tous les canaux de détecteur PMT sont prises avec les mêmes réglages de gain. Le gain doit se situer entre 800 et 900 pour exclure les signaux de fond.

Acquérir des images dans ce format, avec une largeur et une hauteur de 1024 par 1024 pixels et une vitesse de balayage de 100 hertz. Pour les empilements en Z, utiliser une distance maximale de 0,5 micromètre entre chaque coupe. Dans cette étude, la méthode BFC a été utilisée pour surveiller l'interaction de la chaperonne moléculaire cytosolique HSP 90 avec les protéines d'ancrage membranaire TPR sept et à 64.

Comme le montre ce schéma, Venus est couplée à la partie cytosolique soit de la TPR sept, localisée au niveau du réticulum endoplasmique, soit de la 64, située dans l’enveloppe externe du chloroplaste. Hs.P 90 est fusionnée à l’extrémité N-terminale à SCFP, permettant l’interaction des domaines TPR de talk 64 et de la TPR sept avec l’extrémité C-terminale de HSP 90. SCFP seul est exprimé dans le cytosol comme contrôle négatif afin de vérifier la localisation du complexe protéique TPR sept-HS P 90. La TPR sept et la HS P 90 ont été codétransformées avec un marqueur du RE.

La fluorescence a été surveillée dans des feuilles intactes servant de témoin. La SCFP seule a été exprimée conjointement avec TPR sept et le marqueur du RE. Dans toutes les images présentées, l'échelle représente 10 micromètres.

Les panneaux situés à gauche montrent la fluorescence reconstituée en vert, mesurée à 515 nanomètres. Le marqueur du réticulum endoplasmique apparaît en rouge. Les panneaux centraux présentent la superposition des deux signaux, tandis que les panneaux de droite les affichent séparément.

Un signal reconstitué pour TPR sept, conjointement avec HS P 90, a été observé en superposition avec le marqueur du RE apparaissant en jaune. En revanche, aucun signal pour TPR sept ni pour le témoin négatif en tant que CFP n’a été détecté. Dans l’exemple suivant, la protéine chloroplastique tox 64 a été coexprimée avec HS P 90 comme témoin.

Tox 64 a été coexprimé avec SCFP seul. Comme précédemment, la fluorescence reconstituée en vert a été mesurée à 515 nanomètres. Les panneaux centraux montrent l'autofluorescence de la chlorophylle mesurée à 480 nanomètres.

Le chevauchement en rouge des deux signaux est montré dans les panneaux de droite. Une fluorescence reconstituée a été observée dans les cellules coexprimant tox 64 et HSP 90, mais pas dans les cellules coexprimant tox 64 et SCFP seul.

Étant donné qu'il est difficile de déterminer la localisation exacte de tox 64 et de HSP 90 sur des images microscopiques de feuilles entières, des protoplastes ont été isolés à partir de feuilles de tabac infiltrées pour la microscopie de fluorescence. Comme précédemment, la fluorescence reconstituée a été observée à 515 nanomètres, la fluorescence autofluorescente de la chlorophylle a été détectée à 480 nanomètres, et des images superposées ont été générées ; comme le montre cette image superposée, tox 64 et HSP 90 peuvent être détectés sous forme de structures en anneau entourant le chloroplaste Off.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment concevoir vos constructions, transformer les feuilles de tabac, et comment visualiser au mieux le signal fluorescent montrant l'interaction entre vos deux protéines d'intérêt.