Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

L’objectif général de l’expérience suivante est de suivre l’interaction de deux protéines exprimées dans des feuilles de tabac intactes. Ceci est réalisé en concevant des constructions appropriées, en fusionnant les deux gènes d’intérêt pour diviser les protéines fluorescentes et en transformant ces constructions en agrobactéries. Dans un deuxième temps, des cultures d’agrobactéries sont mélangées et injectées dans des feuilles de tabac, ce qui conduit à l’expression des protéines et à un signal fluorescent reconstitué.

Si les protéines se rapprochent, des feuilles entières ou des protoplastes isolés sont analysés au microscope. On obtient des résultats qui montrent les interactions protéine-protéine en fonction du signal fluorescent émis détecté par microscopie à fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunoprécipitation ou la levure à hybride est que l’interaction protéine-protéine peut être directement surveillée dans la cellule végétale vivante.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que la formation de complexes protéiques dans divers compartiments cellulaires. Pour commencer cette procédure, cultivez les agrobactéries qui seront utilisées pour la transformation des feuilles de tabac. Inoculer 10 millilitres de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés avec 50 microlitres de l’AG L une culture mère de glycérol contenant le plasmide d’intérêt dans un tube stérile de 50 millilitres.

Incuber à 28 degrés Celsius pendant au moins 24 heures, en secouant à 190 tr/min jusqu’à ce que la culture atteigne une OD 600 entre 1,0 et 2,0 le lendemain. Centrifugez les bactéries à 3000 fois G pendant 15 minutes. Après avoir jeté le surnageant, suspendez le granulé dans un milieu d’infiltration fraîchement préparé et ajustez la suspension à un OD 600 de 1,0.

Incuber les cellules agrobactériennes dans un agitateur aérien pendant deux heures dans l’obscurité à température ambiante pour l’infiltration des feuilles de tabac. Choisissez plusieurs feuilles plus anciennes d’un plant de tabac de trois semaines. Mélangez des volumes égaux.

Trois millilitres chacune des agrobactéries portant les constructions d’intérêt. Remplissez une seringue de cinq millilitres sans aiguille avec le mélange de suspension cellulaire pour infiltrer la suspension cellulaire dans les feuilles de tabac. Appuyez soigneusement sur la seringue sur la face inférieure des feuilles à plusieurs endroits, arrosez les plantes et laissez-les couvertes et à l’abri de la lumière pendant deux jours.

Pour isoler les protoplastes d’une feuille infiltrée, placez d’abord la feuille dans une boîte de Pétri et ajoutez une solution enzymatique fraîchement préparée. À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir, coupez la feuille en morceaux d’environ 0,5 centimètre carré. Ensuite, transférez les morceaux de feuilles avec la solution enzymatique dans le vide.

Fiole d’infiltration. Infiltrez l’aspirateur pendant environ 20 secondes jusqu’à ce que des bulles d’air sortent des feuilles. Relâchez l’aspirateur très soigneusement.

Agitez le ballon pendant 90 minutes à 40 tr/min à l’obscurité à température ambiante après 90 minutes. Libérez les protoplastes en agitant pendant une minute à 90 tr/min. Filtrez la solution à travers de la gaze dans un tube à centrifuger à fond rond de 15 millilitres.

Superposez la solution de protoplastes avec deux millilitres de tampon FPCN et centrifugez pendant 10 minutes à 70 fois G avec une accélération et une décélération lentes à température ambiante. Les protoplastes intacts s’accumulent à l’interface entre la solution enzymatique et le FPCN à l’aide d’un large orifice, la pointe de pipette d’un millilitre transfère les protoplastes intacts dans un tube de centrifugation frais. Pour le succès de cette procédure, utilisez toujours des pointes à orifice blanc pour éviter la rupture des protoplastes intacts.

Remplissez le tube avec une centrifugeuse à cinq tampons W pendant deux minutes à 100 fois G avec une accélération et une décélération lentes. Pour granuler les protoplastes, retirez le surnageant avec précaution et remettez le granulé en suspension. Dans environ 200 microlitres de tampon W cinq, en fonction de la quantité de protoplastes.

Pour préparer un échantillon de protoplastes pour la microscopie à balayage laser, faites d’abord le pas, deux petites bandes de scellant à environ deux centimètres de distance sur une lame de microscope. Placez 20 microlitres de solution de protoplastes entre les bandes et placez soigneusement un verre de couverture sur le dessus. Les bandes d’étanchéité empêcheront les protoplastes d’être écrasés par le verre de protection.

Pour préparer un échantillon total de feuille pour la microscopie à balayage laser, coupez un morceau d’un centimètre de la feuille et placez-le sur une lame de microscope avec la face inférieure de la feuille vers le haut. Ajoutez environ 30 microlitres d’eau. Placez un verre de protection sur le dessus et fixez-le fermement avec du ruban adhésif des deux côtés.

L’imagerie est réalisée avec un microscope confocal à balayage laser de type MICCA TCS SP cinq pour le grossissement. Utilisez un objectif d’une magnitude de 63 x avec du glycérol comme support d’imagerie, utilisez la suite d’applications Leica pour l’évaluation. Réglez le laser Argonne à 30 % et la puissance laser à 488 nanomètres à une intensité de 18 %Pour surveiller son signal à 515 nanomètres, réglez la bande passante d’émission du premier détecteur PMT de 495 à 550 nanomètres.

Pour surveiller l’autofluorescence de la chlorophylle. Réglez la bande passante d’émission d’un deuxième détecteur PMT de 650 à 705 nanomètres. Pour surveiller le signal Mcherry, utilisez le laser HENI 5 61.

Réglez l’intensité du laser à 18 % et une troisième bande passante d’émission du détecteur PMT de 587 à 610 nanomètres. Assurez-vous que les images de tous les canaux du détecteur PMT sont prises avec les mêmes paramètres de gain. Le gain doit être compris entre 800 et 900 pour exclure les signaux de fond.

Acquérez des images dans ce format, largeur et hauteur de 1024 par 1024 pixels avec une vitesse de balayage de 100 hertz. Pour les empilements en Z, utilisez une distance maximale de 0,5 micron entre chaque pile. Dans cette étude, la méthode BFC a été utilisée pour surveiller l’interaction de la chaperon moléculaire cytosolique HSP 90 avec les protéines d’amarrage membranaire TPR sept et 64.

Comme le montre ce schéma, Vénus est couplée à la partie cytosolique de la TPR sept, qui réside au niveau du réticulum endoplasmique, ou à la partie 64, qui réside dans l’enveloppe externe du chloroplaste. Hs.P 90 est N fusionné en phase terminale avec SCFP, ce qui permet l’interaction des domaines TPR de talk 64 et TPR seven Avec HSP 90 C, Terminus, SCFP seul est exprimé dans le cytosol en tant que contrôle négatif pour vérifier la localisation du complexe protéique TPR sept HS P 90. TPR sept et HS P 90 ont été co-transformés avec un marqueur RE.

La fluorescence a été surveillée dans les feuilles intactes à titre de contrôle. Le SCFP seul a été exprimé avec le TPR sept et le marqueur RE. Dans toutes les images présentées, la barre d’échelle représente 10 microns.

Les panneaux de gauche montrent une fluorescence reconstituée en vert surveillée à 515 nanomètres. Le marqueur ER apparaît en rouge. Dans les panneaux du milieu, la superposition des deux signaux est illustrée dans les panneaux de droite.

Un signal reconstitué pour le TPR sept avec HS P 90 a été surveillé en chevauchant le marqueur ER apparaissant en jaune. En revanche, aucun signal pour le TPR sept et le témoin négatif pendant la CFP a été surveillé. Dans l’exemple suivant, la protéine chloroplastique tox 64 a été co-exprimée avec HS P 90 en tant que contrôle.

Tox 64 a été co-exprimé avec SCFP seul. Comme précédemment, la fluorescence reconstituée en vert a été surveillée à 515 nanomètres. Les panneaux du milieu montrent l’autofluorescence de la chlorophylle suivie à 480 nanomètres.

En rouge, la superposition des deux signaux est illustrée dans les panneaux de droite. Une fluorescence reconstituée a été observée dans les cellules coex exprimant tox 64 et HSP 90, mais pas dans les cellules. Coex exprimant tox 64 et SCFP seuls.

Étant donné que la localisation exacte de tox 64 et HSP 90 est difficile à déterminer sur des images microscopiques de feuilles entières. Des protoplastes ont été isolés à partir de feuilles de tabac infiltrées pour la microscopie à fluorescence. Comme précédemment, la fluorescence reconstituée a été surveillée à 515 nanomètres, l’autofluorescence de la chlorophylle a été surveillée à 480 nanomètres et des images de superposition ont été créées, comme le montre cette image de superposition, à 64 et HSP 90 peut être détecté comme des structures en forme d’anneau entourant le chloroplaste Off.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir vos constructions, de transformer les feuilles de tabac et de visualiser au mieux le signal fluorescent montrant l’interaction de vos deux protéines d’intérêt.