Name: Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Découvrez comment mesurer le stress oxydatif dans les embryons de poissons zèbres vivants. Cette méthode permet une détection qualitative et quantitative des espèces réactives de l'oxygène au niveau des tissus et des cellules individuelles.

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Le soutien dans le laboratoire de Massimo Santoro provient de HFSP, Marie Curie Action, Telethon et AIRC. Nous remercions Dafne Gays et Emiliano Panieri pour la lecture critique du manuscrit.

1. Préparation des instruments et solutions de travail <ol><li> Préparer la solution de l&#39;eau des poissons. Préparez une solution en dissolvant 2 g de sel de mer de l&#39;océan instantanée &#39;dans 50 ml d&#39;eau distillée. Ajouter 1,5 ml de stocker l&#39;eau de poissons à 1 L d&#39;eau distillée pour préparer prêt à utiliser de l&#39;eau de poisson (60 pg / ml sels de mer de concentration finale). Autoclave le prêt à utiliser l&#39;eau du poisson avant l&#39;utilisation. Cette solution est utilisée en tant que support d&#39;embryon de poisson zèbre. </li><li> Préparer la méthylcellulose pour le montage de l&#39;embryon. Dissoudre 1,5 g de méthylcellulose dans 50 ml d&#39;eau stérile de poisson. Faciliter la dissolution à l&#39;aide d&#39;un aimant sur une plaque d&#39;agitation. La dissolution complète de la poudre peut nécessiter plusieurs heures. Vérifiez la solution pour plus de clarté et aliquote en petits tubes. Conserver à -20 ° C pendant des mois et dégeler aliquotes à usage. Centrifuger la méthylcellulose à 950 g pendant 5 min avant de l&#39;utiliser. Éviter les cycles de gel-dégel de aliquotes. </li><li> Préparer 50 ml de tricaine / acétate d&#39;éthyle-3 benzoate msel éthanesulfonate (solution mère) en dissolvant 200 mg de tricaine dans 100 ml d&#39;eau et ajuster le pH à 7,0 à l&#39;aide de Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservez ce stock à 4 ° C pendant au plus 30 jours. ATTENTION: tricaine est toxique. Utilisez conformément aux lignes directrices de traitement appropriées. </li><li> Induisant un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre <ol><li> Préparer une solution oxydante pour générique stress oxydatif induction: Faire 50 ml de solution d&#39;oxydant par addition de H 2 O 2 stock solution (de peroxyde d&#39;hydrogène; 100 mM) à l&#39;eau du poisson. Utilisation de H 2 O 2 à une concentration finale comprise entre 2 mM et 100 pM. Préparer cette solution juste avant l&#39;utilisation. La solution oxydante peut être appliqué à la fois toute la montagne ROS-détection et unicellulaires méthodes ROS-détection. Ne rangez pas cette solution. ATTENTION: H 2 O 2 est dangereux, et nocif par inhalation et par ingestion. Contact avec une matière combustible peut provoquer un incendie. Manipuler sous une hotte de laboratoire et porter pers appropriéeséquipement de protection onal. </li><li> Préparer une solution oxydante pour mitochondries dérivés stress oxydatif induction: Faire une solution mère d&#39;oxydant (5 mM) en dissolvant 3,9 mg de la roténone dans 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver cette solution à la température ambiante dans l&#39;obscurité. <ol><li> Dissoudre la roténone solution stock à 10 ml d&#39;eau de poissons pour faire une solution prête à utiliser. Utiliser la roténone à une concentration comprise entre 5 à 50 uM. Ne pas utiliser la roténone à des concentrations supérieures à 100 um. À des concentrations appropriées, cette solution oxydante peut être appliquée à la fois à l&#39;ensemble de montage ROS-détection et monocellulaires méthodes de détection des ROS. ATTENTION: La roténone est toxique et dangereux. Manipuler selon les conseils de prudence appropriés. </li></ol></li><li> Induire un stress oxydatif par le gène knock-down: knock-down de l&#39;expression du gène nrf2a dans embryons de poisson zèbre par micro-injection morpholino comme indiqué précédemment par Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Provoquer oxidAtive stress après des lésions tissulaires: générer une marge de blessure à la nageoire caudale des embryons de poisson zèbre à 72 HPF comme décrit précédemment par Niethammer et al, 2009 39.. </li></ol></li><li> Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour cellule unique méthode ROS-détection: <ol><li> Solution pour la détection de ROS général: Dissoudre la sonde moléculaire ROS-sensible générique dans HBSS (solution saline équilibrée de Hanks) afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). Cette solution doit être préparée peu avant utilisation. </li><li> Solution pour la détection spécifique de ROS induite par les mitochondries: Peu de temps avant l&#39;utilisation, dissoudre une sonde mitochondriale de ROS-sensible avec du DMSO faire une solution mère de 5 mM. Dissoudre solution mère dans du HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). REMARQUE: Évitez la lumière et l&#39;oxygène exposition de solutions de travail ROS-détection et leurs solutions mères respectives. Protéger le tube de la lumière à l&#39;aideune feuille d&#39;aluminium. Ne pas entreposer ou sondes réutilisation dissous dans du HBSS. Conserver les solutions mères à -20 ° C pendant un mois. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires et DMSO sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées. </li></ol></li><li> Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour la méthode de montage ROS-détection: Dissoudre la solution sonde boursier ROS-sensible générique (stabilisé dans le DMSO) dans HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-5 M). Evitez la lumière et de l&#39;exposition à l&#39;oxygène. Protéger le tube de la lumière. Préparer cette solution avant de l&#39;utiliser. Ne pas stocker ou réutiliser cette solution. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées. </li><li> Ajoutez 25 ml de solution d&#39;arrêt par addition de 10 ml de sérum bovin fœtal à 15 ml de PBS 1x. Conserver la solution stérile. Conserver cette solution à 4 ° C. Cette solution n&#39;est nécessaire que pour une seule cellule - méthode de détection ROS. </li><li> Régler l&#39;incubateur de l&#39;air de poisson zèbre à 28 ans &amp;# 176; C. </li><li> Régler la centrifugeuse à 4 ° C pour le procédé de détection de ROS cellulaire unique. </li></ol> 2. L&#39;accouplement des poissons adultes et la sélection des embryons de poissons zèbres <ol><li> Mise en place adulte paire poisson zèbre traverse selon des protocoles standard 40. Sélectionnez la ligne transgénique approprié en fonction des besoins expérimentaux spécifiques. </li><li> Ramassez les œufs et les placer dans un plat de 90 mm avec le milieu de l&#39;eau du poisson / de l&#39;embryon. Conserver les œufs à 28 ° C jusqu&#39;à ce que les embryons vont se développer et croître jusqu&#39;au stade désiré de développement (par exemple, 48 HPF, 72 HPF; HPF: heures après la fécondation). </li><li> Écran pour le développement des embryons. Exclure tous les œufs non fécondés ou d&#39;embryons sous-développés. </li><li> Anesthésier embryons en ajoutant 1 ml de tricaïne (solution mère) dans 50 ml d&#39;eau de poissons. </li><li> Sélectionnez Tg embryons fluorescentes sous une loupe binoculaire. </li></ol> 3. Traitement des embryons avec l&#39;agent oxydant <ol><li> Utilisez au moins 30 embryons entre 48 hpf et 72 HPF par des conditions différentes. Laver embryons fois à l&#39;eau du poisson frais pour éliminer tricaine. </li><li> Diviser embryons fluorescentes en trois plats. Ne pas placer plus de 30 embryons / plat. </li><li> Retirer la solution de lavage et ajouter 10 ml de la solution d&#39;oxydant ou de 10 ml d&#39;eau du poisson comme solution de contrôle. </li><li> Incuber les embryons pour 10 min à 1 h à 28 ° C. La période d&#39;incubation dépend du niveau de stress oxydatif d&#39;être induite dans des tissus spécifiques. De courtes périodes sont les meilleurs que les cellules touchées par le stress oxydatif subissent progressivement la mort cellulaire. </li><li> embryons de transfert dans un nouveau plat contenant HBSS et embryons de lavage en remuant. Pré-HBSS chaud à 28 ° C. </li></ol> 4. Méthode de détection Mont ROS entier <ol><li> Recueillir des embryons après traitement oxydant et mettre pas plus de 10 embryons dans un petit tube. Rincer avec de l&#39;HBSS autant que possible. Protéger le tube de la lumière en utilisant une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de détection pour ROSchaque tube. </li><li> Incuber les embryons dans l&#39;obscurité pendant 15 min à 28 ° C pour éviter l&#39;exposition de la lumière. </li><li> Pendant la durée d&#39;incubation préparer une lame de verre pour l&#39;analyse de l&#39;embryon entier. Mettez 300 pi de méthylcellulose sur une &quot;dépression&quot; lame de verre et l&#39;étaler sur la surface du verre avec une pointe de pipette. Éviter les bulles tout en libérant la méthylcellulose. </li><li> A la fin de la période d&#39;incubation, retirer immédiatement la solution ROS-détection et laver deux fois avec 2 ml de HBSS. Laver les embryons en renversant le tube plusieurs fois. Ne pas pipeter ou vortex. </li><li> embryons en une pipette Pasteur en verre de Aspirer. embryons de position près de l&#39;ouverture de la pipette et en douceur les éjectent dans la méthylcellulose. Orienter les embryons de manière appropriée avec un fil de nylon fin. </li><li> Comparer la fluorescence des embryons de contrôle avec des embryons traités. Alternativement, fixer les paramètres de la loupe binoculaire ou microscope confocal fluorescence de sorte que tous les embryons sont imagées par la mêmeparamètres d&#39;imagerie. </li></ol> 5. Single Cell méthode ROS-détection <ol><li> Commencez à l&#39;étape: 3.5. Assurez-vous d&#39;avoir au moins 35 embryons pour chaque condition. </li><li> Transfert d&#39;embryons dans un nouveau plat. Enlever l&#39;eau des poissons autant que possible. Ajouter 10 ml de PBS glacé 1x et 400 pi de inhibiteurs de la protéase cocktail. Dechorionate manuellement embryons avec une pince et retirer le sac du jaune d&#39;oeuf avec une aiguille fine. Remarque: la suppression jaune sac assure échantillons propres pour l&#39;analyse FACS suivant. Cette étape peut être évité selon l&#39;instrument FACS. </li><li> Transfert de-vitellins embryons dans une plaque de 24 puits à puits multiples (15 embryons / puits) et supprimer toute l&#39;eau du poisson. </li><li> Ajouter 300 ul de HBSS, 30 pl de la collagénase P, 50 ul de trypsine-EDTA dans chaque puits. </li><li> Homogénéiser embryons par un léger pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette serré (1000 pi). </li><li> Incuber à 28 ° C pendant 20 min et l&#39;homogénéiser les échantillons par pipetage toutes les 5 min. </li><li> Vérifiez DISR tissuuption en observant une aliquote de homogénat au microscope composé. Faciliter la suspension de cellules individuelles par pipetage. Ne pas incuber les embryons pendant plus de 30 min. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 200 ul de solution d&#39;arrêt. Mélanger à la pipette doucement. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube pré-réfrigérés avec fond étanche. Gardez le tube sur la glace et éviter l&#39;exposition de la lumière. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 250 g à 4 ° C. </li><li> Retirez la phase supérieure et les cellules re-suspension avec de la glace froide HBSS par pipetage. </li><li> Compter les cellules et assurez-vous que vous avez le même nombre de cellules dans l&#39;ensemble de vos échantillons. Ne pas utiliser moins de 2 x 10 6 cellules. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 250 xg à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et suspendre le culot avec 1 ml de glace réfrigéré HBSS contenant la sonde ROS-sensible. </li><li> Incuber le tube à la température ambiante pendant 3 minutes dans l&#39;obscurité. Varier la durée d&#39;incubation en fonction du niveau de stress oxydatif et à til sensibilité de la sonde. </li><li> Transférer les cellules dans un tube FACS. Garder les tubes sur la glace et éviter l&#39;exposition de lumière avant l&#39;analyse FACS. </li><li> Trier les cellules avec un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS). Longueurs d&#39;onde réglée conformément à fluorescence Tg de tissu (par exemple, la GFP) et les spectres d&#39;excitation / émission de la sonde moléculaire utilisée pour la détection ROS (par exemple, les sondes ROS-sensibles mitochondriales spécifiques, sondes ROS-sensibles génériques). </li><li> Pour chaque condition, mesurer tous les échantillons dans la même séance expérimentale en appliquant les mêmes paramètres FACS. Calculer le pourcentage de cellules fluorescentes comme la moyenne des différentes répétitions biologiques. Analyser au moins deux répétitions pour chaque condition. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Étapes critiques La procédure de détection d&#39;un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre décrits ici comprend deux méthodes différentes. L&#39;ensemble de la méthode de montage ROS-détection est principalement un dosage qualitatif pour ROS-détection, tandis que la méthode de détection de ROS cellulaire unique permet des mesures quantitatives plus précises (figure 1). Les deux méthodes offrent un moyen rapide et facile d&#39;évaluer in vivo ROS-détection ...

Le stress oxydatif est spécifiquement définie comme un état qui résulte d&#39;un état redox cellulaire asymétrique. Les réactions d&#39;oxydoréduction complexes qui se produisent régulièrement dans les cellules déterminent l&#39;état redox cellulaire. Les réactions d&#39;oxydoréduction sont constitués de toutes les réactions chimiques qui se composent dans le transfert d&#39;électrons entre les atomes des molécules biologiques produisant la réduction et l&#39;oxydation de molécules (à savoir les réactions d&#39;oxydo-réduction). Ces réactions sont catalysées par des espèces activées électroniquement (par exemple des espèces pro-oxydantes), qui se caractérisent par une extrême instabilité structurelle et activation spontanée d&#39;électrons asymétriques qui échangent avec les biomolécules voisins. Ces réactions résultent en irréguliers dommages à l&#39;ADN, des protéines carboxylation, et l&#39;oxydation des lipides, et peuvent conduire à une mort cellulaire 1. Des niveaux accrus de stress oxydatif ont été associées avec le vieillissement et la progression de différents états pathologiques 2. Le stress oxydatif aété signalé comme étant responsable de modifications vasculaires dans le diabète et les maladies cardio-vasculaires 3,4. Il joue également un rôle critique dans la dégénérescence neuronale dans la maladie d&#39;Alzheimer et la maladie de Parkinson 5. En outre, le stress oxydatif a été démontré comme un facteur essentiel dans la gouvernance progression du cancer et les événements métastatiques 6,7. En outre, les réponses inflammatoires et immunitaires peuvent susciter et à soutenir davantage le stress oxydatif 8. Dans les cellules vivantes, les espèces pro-oxydantes sont dérivées de l&#39;oxygène (ROS, les espèces réactives de l&#39;oxygène) ou de l&#39;azote (RNS; espèces réactives de l&#39;azote). ROS comprennent le radical hydroxyle, l&#39;anion superoxyde (OH.) (O 2 -), et le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2). Le principal RNS est l&#39;oxyde nitreux (NO).. Une série d&#39;espèces réactives secondaires peut être généré par des interactions spontanées entrn ROS et RNS ou les ions métaux libres 9. Par exemple, l&#39;anion superoxyde réagit avec l&#39;oxyde nitreux pour former peroxynitrate (ONOO -), tandis que H 2 O 2 avec la réaction Fe 2 + génère des radicaux hydroxyle. ROS et RNS, en raison de leur capacité à réagir avec plusieurs biomolécules, sont considérés comme une menace dangereuse pour le maintien de l&#39;état redox physiologiques 10. Pour maintenir les cellules de l&#39;état d&#39;oxydo-réduction sont équipées d&#39;une série de détoxification de molécules anti-oxydantes et les enzymes. La superoxyde dismutase (SOD), catalase, glutathion peroxydase et peroxyrédoxines constitue essentiellement l&#39;anti-oxydant enzymatique-arsenal qui fournit une protection cellulaire à partir d&#39;espèces pro-oxydantes, y compris H 2 O 2, OH et OONO -. 11. Également des molécules anti-oxydantes comme la vitamine C et E, polyphénols et CoenzymeQ10 (CoQ10) sont d&#39;une importance critique pour étancher ROS et leur dangereux derivatives 12,13. Cependant, une production excessive des ROS et RNS ou un dysfonctionnement dans le système anti-oxydant, déplace l&#39;état redox cellulaire vers stress oxydatif 14. Outre leur connotation négative, ROS peut jouer différents rôles physiologiques dans les cellules d&#39;origine différente. Les cellules produisent normalement ROS comme molécules de signalisation de la médiation des événements biologiques normaux tels que la défense de l&#39;hôte et la réparation des plaies 15-17. Les espèces réactives sont normalement produites dans les cellules par des enzymes intracellulaires telles que NOx (NADPH oxydase) et XO (xantine oxydase) en réponse à des facteurs de signalisation, des facteurs de croissance, et des fluctuations de niveaux intracellulaires de calcium 18,19. Il a été rapporté que les ROS peut différentiellement moduler l&#39;activité des facteurs nucléaires importantes telles que p53 ou des composants cellulaires tels que l&#39;ATM-kinase, un régulateur maître de la réponse aux dommages de l&#39;ADN 20. Analogue ROS influencent fortement la signalisation cellulaire par la médiation eoxydation de e et l&#39;inactivation des protéines tyrosine phosphatases (PTP), qui sont établis en tant que régulateurs critiques de la transduction du signal 21. En outre, la protéomique basée méthodologies démontrent que RNS sont également responsables de modifications et altérations de la signalisation moléculaire de protéines spécifiques. RNS réagissent avec les groupements thiols de cystéine en les modifiant en S-nitrothiols (SNO) et de déclenchement voies moléculaires concomitantes avec des états pathologiques tels que les maladies inflammatoires et auto-immunes 22,23. Etant donné que des expériences de culture cellulaire ne se reproduisent que partiellement la multitude de facteurs qui agissent in vivo, il est d&#39;un grand intérêt de réaliser des études d&#39;oxydo-réduction dans les modèles animaux 24,25. Pour ce faire, le poisson-zèbre a été considéré comme un modèle animal vertébré approprié pour étudier la dynamique de stress oxydatif 26. Le poisson zèbre est un nouveau système de modèle qui accorde plusieurs avantages pour étudier les événements cellulaires et génétiques au cours des vertébrés developpement et la maladie. Grands groupes d&#39;embryons hebdomadaire peuvent être générées et disponibles pour des besoins expérimentaux. En outre, la clarté optique extraordinaire embryons de poisson zèbre, ainsi que leur petite taille, permet l&#39;imagerie cellulaire unique et le suivi dynamique dans toute une organismes 27. Dans la dernière décennie, un nombre considérable de mutants de poisson zèbre a été générée pour modéliser des conditions pathologiques comme le cancer et les maladies génétiques 28-31. Plus important encore, une multitude de lignées transgéniques ont été produites pour permettre de nombreuses possibilités de manipulations génétiques et biologiques 32. Par exemple, des lignées spécifiques de tissus de poisson-zèbre transgénique sont régulièrement utilisés pour des études in vivo. Ces lignées expriment une protéine fluorescente sous le contrôle d&#39;un promoteur choisi, en offrant la possibilité d&#39;identifier des cellules individuelles in vivo, ainsi que la structure anatomique qu&#39;elles comprennent. Plusieurs études toxicologiques ont déjà utilisé til de poisson zèbre pour évaluer l&#39;effet in vivo de produits chimiques sur homéostasie redox, suggérant la pertinence de ce vertébré comme un modèle animal pour le domaine de la découverte de médicaments et le stress oxydatif 33-35. Même si certains des sondes fluorescentes ont été testés pour surveiller le stress oxydatif chez les larves de poisson zèbre 36,37, il n&#39;y a pas de tests mis en place pour détecter et mesurer les niveaux de stress oxydatif dans les tissus de poisson zèbre et les cellules vivantes. Ici, nous décrivons un procédé pour la quantification in vivo du stress oxydatif dans les cellules d&#39;embryons de poisson zèbre vivant. Les outils d&#39;imagerie, tri FACS, des sondes fluorescentes et les conditions pro-oxydantes sont combinés pour générer simple test pour la détection et la quantification des espèces oxydantes dans des embryons et des tissus de poisson zèbre.

<table><tbody><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>NE PAS STOCKER LES DILUITIONS</td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hank 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Aquarium Mélange de sel de mer</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Csonde générique sensible aux ROS : CellROX Deep Red Reagent</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Sonde sensible aux ROS spécifique aux mitochondries : MitoSOX&nbsp ;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>dissoudre un flacon avec 13 &mu ; l de DMSO</td></tr><tr><td>Hydroéthidine</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Préparer une solution mère de 5 mM dans du DMSO.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870 ; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>dissoudre la poudre dans du DMSO ; diluite dans l’eau</td></tr><tr><td>de poisson Iodure de propidium&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycine D (7-AAD)&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td> : Timme-LaLaragy et al. ; 2012 (PMID : 22174413) ; Kobayashi et al. ; 2002 (PMID :12167159)</td></tr><tr><td>Collagénase P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Dissoudre la poudre à 100 mg/ml dans du HBSS stérile. Stocker les aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur complet de protéase Comprimés</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Dissoudre un comprimé dans 1 ml d’eau</td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA (10x), sans rouge de phénol</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Préparer 1x solution de travail avant utilisation</td></tr><tr><td>Microscope composé&nbsp ;</td><td>Stéréomicroscope ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>avec éclairage fluorescent</td> Appareil photo <td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>pour l’acquisition d’images de fluorescence</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules activées par fluorescence</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS&nbsp ;</td><td>Plaque multipuits BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Falcon</td><td>353047 Boîtes de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri stérilisées, non traitées 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Des niveaux élevés d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) peuvent entraîner une modification de l&#39;état redox cellulaire vers l&#39;état de stress oxydatif. Cette situation provoque l&#39;oxydation de molécules (lipides, ADN, protéines) et conduit à la mort cellulaire. Le stress oxydatif a également un impact sur la progression de plusieurs pathologies telles que le diabète, les rétinopathies, la neurodégénérescence, et le cancer. Ainsi, il est important de définir des outils pour étudier les conditions de stress oxydatif, non seulement au niveau des cellules individuelles, mais aussi dans le contexte des organismes entiers. Ici, nous considérons l&#39;embryon de poisson zèbre comme un utile système in vivo pour effectuer des études et présenter un protocole pour mesurer le stress oxydatif in vivo. Profitant de sondes fluorescentes ROS et des lignes fluorescentes de poisson zèbre transgénique, nous développons deux méthodes différentes pour mesurer le stress oxydatif in vivo: i) un &quot;embryon toute méthode ROS-détection&quot; pour la mesure qualitative du stress oxydatif et ii) un &quot;unicellulaire ROS méthode de détection &quot;pour des mesures quantitatives de stress oxydatif. Ici, nous démontrons l&#39;efficacité de ces procédés, en augmentant le stress oxydatif dans les tissus par des agents oxydants et des méthodes physiologiques ou génétiques. Ce protocole est prête pour les écrans génétiques avant et il aidera relations adresse de cause à effet de ROS dans des modèles animaux de pathologies liées au stress oxydatif, comme les troubles neurologiques et le cancer.

En appliquant la méthode décrite ici, nous pouvons facilement mesurer et détecter le stress oxydatif (et niveaux de ROS) dans les tissus embryonnaires de poisson zèbre. Après avoir traversé le poisson zèbre adulte, les oeufs sont recueillis et ont permis de développer à 28 ° C à 72 heures après la fécondation (HPF). Pour induire un stress oxydatif, nous proposons deux approches différentes: 1) le traitement des embryons avec de fortes réactifs pro-oxydants ou 2) la promotion de la formation de ROS après une lésion tissu...

Ici, nous rapportons un protocole pour mesurer le stress oxydatif chez les embryons de poisson-zèbre vivants. Cette procédure permet de détecter les espèces réactives de l’oxygène (ROS) à la fois dans les tissus embryonnaires entiers et dans les populations unicellulaires. Ce protocole permettra d’effectuer des analyses qualitatives et quantitatives.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer de manière qualitative et quantitative le stress oxydatif chez des embryons vivants de poisson zèbre. Ceci est réalisé en ajoutant une solution oxydante à des embryons préparés afin d'induire un stress oxydatif, ou en créant une lésion au niveau de la nageoire caudale de l'embryon. Les embryons sont ensuite traités pour la détection du stress oxydatif selon une méthode monocellulaire ou selon une méthode de montage entier.Ensuite, les préparations sont incubées avec une sonde de détection des ROS. Les résultats peuvent indiquer le taux de stress oxydatif et le niveau de ROS, selon une microscopie confocale de montages complets ou une analyse cytofluorométrique de cellules individuelles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'immunofluorescence pour les marqueurs de stress oxydatif, est qu'elle permet une détection directe dans le contexte d'un organisme vivant et une quantification au niveau de tissus individuels.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche fondamentale, comme l'exploration des conditions de stress oxydatif dans le contexte d'un état pathologique. Les personnes novices dans ce domaine peuvent éprouver des difficultés en raison de dommages tissulaires accidentels, les sondes moléculaires brutes et sensibles pouvant constituer une source imprévue d'acidité. De plus, comme de forts niveaux de stress oxydatif entraînent nécessairement la mort cellulaire, tandis que des niveaux trop faibles peuvent être difficiles à détecter, ces problèmes ne se manifesteront que lors de la préparation de la solution destinée à induire un stress oxydatif mitochondrial composée de rot connu dans le DMSO, qui doit être préparée à partir d'une solution mère de rot connu à une concentration comprise entre cinq et 50 micromoles, et jamais supérieure à 100 micromoles, car le rot connu est toxique et dangereux.Tenez compte des précautions indiquées. La solution de sonde pour la détection des trous de Mount Ross ne doit pas être exposée à la lumière ni à l'oxygène pendant sa préparation, et elle doit être préparée fraîchement pour la méthode de détection de Ross en cellule unique. Une solution d'arrêt composée de FBS dans du PBS doit être préparée et conservée à quatre degrés Celsius.D'autres préparations incluent le réglage de l'incubateur à air pour zebrafish à 28 degrés Celsius et le refroidissement de la centrifugeuse à quatre degrés Celsius pour la méthode de la cellule unique. Les croisements de zebrafish, la collecte des embryons et l'anesthésie sont tous effectués. À l'aide d'une méthodologie standard, recueillir les embryons d'intérêt entre 48 et 72 heures après la fécondation.Après avoir anesthésié les embryons, rincer deux fois l'anesthésique, puis charger les embryons dans trois boîtes, avec au maximum 30 par boîte pour la détection brute au niveau cellulaire unique. Collecter au moins 35 embryons par condition dans plusieurs boîtes. Ensuite, ajouter 10 millilitres de solution oxydante ou, en tant que contrôle négatif, une solution témoin.Appliquer 10 millilitres d'eau, puis attendre de 10 à 60 minutes pendant que les embryons s'incubent à 28 degrés Celsius. Préchauffer également le HBSS à 28 degrés Celsius pour le lavage. Après l'incubation, transférer les embryons dans une nouvelle boîte contenant du HBSS tiède et agiter en tournant.Procédez ensuite à la détection de Ross en montage entier ou au niveau cellulaire unique. Une option plus physiologique consiste à induire un stress après un dommage tissulaire en utilisant la technique de blessure de la nageoire caudale décrite par NI Tomer et collaborateurs. Après le traitement par oxydant, transférez des groupes de jusqu'à 10 embryons dans de petits tubes.Les rincer abondamment avec du HBSS et les protéger de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Ensuite, ajouter un millilitre de solution de détection brute dans chaque tube et incuber les tubes pendant 15 minutes à 28 degrés Celsius pendant qu’ils incubent. Préparer une lame de verre contenant à la fois la condition témoin et la condition expérimentale.Couvrez une lame creuse avec 300 microlitres de méthylcellulose. N'insérez pas de bulles lors de l'éjection de la méthylcellulose. Après l'incubation des embryons, remplacez rapidement la solution dans les tubes par deux millilitres de HBSS et retournez les tubes plusieurs fois pour laver les embryons.Aspirez ensuite les embryons dans l'extrémité d'une micropipette et expulsez-les délicatement sur la lame traitée. Orientez les embryons à l'aide d'un fin fil de nylon et procédez à l'analyse à l'aide d'un microscope à balayage fluorescent ou confocal. Veillez à analyser tous les embryons dans les mêmes conditions.Transférez les embryons du rinçage HBSS vers une nouvelle boîte, en éliminant autant que possible la solution. Décortiquez maintenant manuellement les embryons. Cette étape est absolument nécessaire pour dissocier les embryons en cellules individuelles.Ensuite, transférez les embryons dans une plaque de 24 puits en plaçant 15 embryons dans chacun. Remplissez idéalement trois puits pour chaque condition. Ensuite, retirez complètement la solution et remplacez-la par 300 microlitres de HBSS, 30 microlitres de collagénase P et 50 microlitres de trypsine-EDTA.À l’aide d’une pipette réglée à un millilitre, homogénéisez les embryons à l’aide du trieur. Une fois tous les puits préparés, transférez la plaque à 28 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes et, toutes les cinq minutes, effectuez une trituration des échantillons afin d’assurer une bonne homogénéisation. Placez également quelques tubes microfuge sur de la glace pour recueillir les tissus dès qu’ils seront prêts.Au bout de 20 minutes, prélevez un échantillon et vérifiez au microscope que le tissu est dissocié en une suspension de cellules individuelles. Dans le cas contraire, poursuivez l'incubation jusqu'à un maximum de 30 minutes au total. Lorsque le tissu est prêt, arrêtez la réaction en ajoutant 200 microlitres supplémentaires de solution d'arrêt.Mélangez ceci avec le TRI à l’aide d’une pipette de un millilitre. Ensuite, transférez le contenu de chaque puits dans un tube microfuge prérefroidi et conservez ces tubes sur de la glace à l’abri de la lumière. Puis, centrifugez les échantillons à 250 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, retirez le surnageant par aspiration. Resuspendez le culot cellulaire dans du HBSS glacé avec un léger tri, et vérifiez que la suspension contient au moins 2 millions de cellules. Puis, resuspendez les cellules dans un millilitre de la solution brute du sondes sensible.Incubez-les à température ambiante et à l'abri de la lumière pendant environ trois minutes. Ajustez ce temps d'incubation de manière empirique. Ensuite, transférez les cellules dans des tubes FACS protégés de la lumière.Procédez à des analyses par fax pour détecter le marqueur transgénique. Fluorescence et fluorescence de la sonde Ross pendant votre analyse. Calculez toujours les niveaux de perte en tant qu'augmentations multiplicatives par rapport aux échantillons témoins afin de normaliser la fluorescence de fond.Toute la détection Mount Ross a été utilisée pour examiner l'accumulation de peroxyde d'hydrogène au site d'une plaie. Des queues intactes et lésées ont été comparées après 20 minutes de traitement par un oxydant. Un signal non spécifique a été détecté dans les deux conditions.La même expérience avec un prétraitement des embryons afin de réduire les niveaux de peroxyde d'hydrogène. L'utilisation de l'inhibiteur OX VAs 28 70 a révélé que les signaux détectés dépendaient effectivement de l'accumulation de Ross rot. Des embryons traités connus ont également été examinés en montage entier.Sous forte augmentation, les régions anatomiques pouvaient être identifiées. Cela a produit Ross, comme indiqué par le comptage en fluorescence des cellules positives à Ross par fax, qui a été réalisé pour la détection de Ross au niveau de la cellule unique. Cette analyse a été effectuée sans inclusion de cellules mortes. Contrôle.Les cellules non traitées ont également été analysées. La comparaison de ces résultats a permis une quantification très facile de l'accumulation de Ross. Le test s'avère excellent pour évaluer un nombre quelconque de manipulations expérimentales.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 90 minutes si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas que le travail avec des sondes moléculaires peut être extrêmement dangereux et la précaution. L'utilisation de gants doit toujours être prise en compte lors de l'exécution de cette procédure.

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