Name: Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Découvrez comment mesurer le stress oxydatif dans les embryons de poissons zèbres vivants. Cette méthode permet une détection qualitative et quantitative des espèces réactives de l'oxygène au niveau des tissus et des cellules individuelles.

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Le soutien dans le laboratoire de Massimo Santoro provient de HFSP, Marie Curie Action, Telethon et AIRC. Nous remercions Dafne Gays et Emiliano Panieri pour la lecture critique du manuscrit.

1. Préparation des instruments et solutions de travail <ol><li> Préparer la solution de l&#39;eau des poissons. Préparez une solution en dissolvant 2 g de sel de mer de l&#39;océan instantanée &#39;dans 50 ml d&#39;eau distillée. Ajouter 1,5 ml de stocker l&#39;eau de poissons à 1 L d&#39;eau distillée pour préparer prêt à utiliser de l&#39;eau de poisson (60 pg / ml sels de mer de concentration finale). Autoclave le prêt à utiliser l&#39;eau du poisson avant l&#39;utilisation. Cette solution est utilisée en tant que support d&#39;embryon de poisson zèbre. </li><li> Préparer la méthylcellulose pour le montage de l&#39;embryon. Dissoudre 1,5 g de méthylcellulose dans 50 ml d&#39;eau stérile de poisson. Faciliter la dissolution à l&#39;aide d&#39;un aimant sur une plaque d&#39;agitation. La dissolution complète de la poudre peut nécessiter plusieurs heures. Vérifiez la solution pour plus de clarté et aliquote en petits tubes. Conserver à -20 ° C pendant des mois et dégeler aliquotes à usage. Centrifuger la méthylcellulose à 950 g pendant 5 min avant de l&#39;utiliser. Éviter les cycles de gel-dégel de aliquotes. </li><li> Préparer 50 ml de tricaine / acétate d&#39;éthyle-3 benzoate msel éthanesulfonate (solution mère) en dissolvant 200 mg de tricaine dans 100 ml d&#39;eau et ajuster le pH à 7,0 à l&#39;aide de Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservez ce stock à 4 ° C pendant au plus 30 jours. ATTENTION: tricaine est toxique. Utilisez conformément aux lignes directrices de traitement appropriées. </li><li> Induisant un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre <ol><li> Préparer une solution oxydante pour générique stress oxydatif induction: Faire 50 ml de solution d&#39;oxydant par addition de H 2 O 2 stock solution (de peroxyde d&#39;hydrogène; 100 mM) à l&#39;eau du poisson. Utilisation de H 2 O 2 à une concentration finale comprise entre 2 mM et 100 pM. Préparer cette solution juste avant l&#39;utilisation. La solution oxydante peut être appliqué à la fois toute la montagne ROS-détection et unicellulaires méthodes ROS-détection. Ne rangez pas cette solution. ATTENTION: H 2 O 2 est dangereux, et nocif par inhalation et par ingestion. Contact avec une matière combustible peut provoquer un incendie. Manipuler sous une hotte de laboratoire et porter pers appropriéeséquipement de protection onal. </li><li> Préparer une solution oxydante pour mitochondries dérivés stress oxydatif induction: Faire une solution mère d&#39;oxydant (5 mM) en dissolvant 3,9 mg de la roténone dans 2 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver cette solution à la température ambiante dans l&#39;obscurité. <ol><li> Dissoudre la roténone solution stock à 10 ml d&#39;eau de poissons pour faire une solution prête à utiliser. Utiliser la roténone à une concentration comprise entre 5 à 50 uM. Ne pas utiliser la roténone à des concentrations supérieures à 100 um. À des concentrations appropriées, cette solution oxydante peut être appliquée à la fois à l&#39;ensemble de montage ROS-détection et monocellulaires méthodes de détection des ROS. ATTENTION: La roténone est toxique et dangereux. Manipuler selon les conseils de prudence appropriés. </li></ol></li><li> Induire un stress oxydatif par le gène knock-down: knock-down de l&#39;expression du gène nrf2a dans embryons de poisson zèbre par micro-injection morpholino comme indiqué précédemment par Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Provoquer oxidAtive stress après des lésions tissulaires: générer une marge de blessure à la nageoire caudale des embryons de poisson zèbre à 72 HPF comme décrit précédemment par Niethammer et al, 2009 39.. </li></ol></li><li> Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour cellule unique méthode ROS-détection: <ol><li> Solution pour la détection de ROS général: Dissoudre la sonde moléculaire ROS-sensible générique dans HBSS (solution saline équilibrée de Hanks) afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). Cette solution doit être préparée peu avant utilisation. </li><li> Solution pour la détection spécifique de ROS induite par les mitochondries: Peu de temps avant l&#39;utilisation, dissoudre une sonde mitochondriale de ROS-sensible avec du DMSO faire une solution mère de 5 mM. Dissoudre solution mère dans du HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-10 M). REMARQUE: Évitez la lumière et l&#39;oxygène exposition de solutions de travail ROS-détection et leurs solutions mères respectives. Protéger le tube de la lumière à l&#39;aideune feuille d&#39;aluminium. Ne pas entreposer ou sondes réutilisation dissous dans du HBSS. Conserver les solutions mères à -20 ° C pendant un mois. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires et DMSO sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées. </li></ol></li><li> Préparer 5 ml de solution ROS-détection pour la méthode de montage ROS-détection: Dissoudre la solution sonde boursier ROS-sensible générique (stabilisé dans le DMSO) dans HBSS afin de préparer une solution de travail (gamme de concentration: 2,5-5 M). Evitez la lumière et de l&#39;exposition à l&#39;oxygène. Protéger le tube de la lumière. Préparer cette solution avant de l&#39;utiliser. Ne pas stocker ou réutiliser cette solution. ATTENTION: Manipuler sondes moléculaires sous une hotte en conformité avec les lignes directrices appropriées. </li><li> Ajoutez 25 ml de solution d&#39;arrêt par addition de 10 ml de sérum bovin fœtal à 15 ml de PBS 1x. Conserver la solution stérile. Conserver cette solution à 4 ° C. Cette solution n&#39;est nécessaire que pour une seule cellule - méthode de détection ROS. </li><li> Régler l&#39;incubateur de l&#39;air de poisson zèbre à 28 ans &amp;# 176; C. </li><li> Régler la centrifugeuse à 4 ° C pour le procédé de détection de ROS cellulaire unique. </li></ol> 2. L&#39;accouplement des poissons adultes et la sélection des embryons de poissons zèbres <ol><li> Mise en place adulte paire poisson zèbre traverse selon des protocoles standard 40. Sélectionnez la ligne transgénique approprié en fonction des besoins expérimentaux spécifiques. </li><li> Ramassez les œufs et les placer dans un plat de 90 mm avec le milieu de l&#39;eau du poisson / de l&#39;embryon. Conserver les œufs à 28 ° C jusqu&#39;à ce que les embryons vont se développer et croître jusqu&#39;au stade désiré de développement (par exemple, 48 HPF, 72 HPF; HPF: heures après la fécondation). </li><li> Écran pour le développement des embryons. Exclure tous les œufs non fécondés ou d&#39;embryons sous-développés. </li><li> Anesthésier embryons en ajoutant 1 ml de tricaïne (solution mère) dans 50 ml d&#39;eau de poissons. </li><li> Sélectionnez Tg embryons fluorescentes sous une loupe binoculaire. </li></ol> 3. Traitement des embryons avec l&#39;agent oxydant <ol><li> Utilisez au moins 30 embryons entre 48 hpf et 72 HPF par des conditions différentes. Laver embryons fois à l&#39;eau du poisson frais pour éliminer tricaine. </li><li> Diviser embryons fluorescentes en trois plats. Ne pas placer plus de 30 embryons / plat. </li><li> Retirer la solution de lavage et ajouter 10 ml de la solution d&#39;oxydant ou de 10 ml d&#39;eau du poisson comme solution de contrôle. </li><li> Incuber les embryons pour 10 min à 1 h à 28 ° C. La période d&#39;incubation dépend du niveau de stress oxydatif d&#39;être induite dans des tissus spécifiques. De courtes périodes sont les meilleurs que les cellules touchées par le stress oxydatif subissent progressivement la mort cellulaire. </li><li> embryons de transfert dans un nouveau plat contenant HBSS et embryons de lavage en remuant. Pré-HBSS chaud à 28 ° C. </li></ol> 4. Méthode de détection Mont ROS entier <ol><li> Recueillir des embryons après traitement oxydant et mettre pas plus de 10 embryons dans un petit tube. Rincer avec de l&#39;HBSS autant que possible. Protéger le tube de la lumière en utilisant une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de détection pour ROSchaque tube. </li><li> Incuber les embryons dans l&#39;obscurité pendant 15 min à 28 ° C pour éviter l&#39;exposition de la lumière. </li><li> Pendant la durée d&#39;incubation préparer une lame de verre pour l&#39;analyse de l&#39;embryon entier. Mettez 300 pi de méthylcellulose sur une &quot;dépression&quot; lame de verre et l&#39;étaler sur la surface du verre avec une pointe de pipette. Éviter les bulles tout en libérant la méthylcellulose. </li><li> A la fin de la période d&#39;incubation, retirer immédiatement la solution ROS-détection et laver deux fois avec 2 ml de HBSS. Laver les embryons en renversant le tube plusieurs fois. Ne pas pipeter ou vortex. </li><li> embryons en une pipette Pasteur en verre de Aspirer. embryons de position près de l&#39;ouverture de la pipette et en douceur les éjectent dans la méthylcellulose. Orienter les embryons de manière appropriée avec un fil de nylon fin. </li><li> Comparer la fluorescence des embryons de contrôle avec des embryons traités. Alternativement, fixer les paramètres de la loupe binoculaire ou microscope confocal fluorescence de sorte que tous les embryons sont imagées par la mêmeparamètres d&#39;imagerie. </li></ol> 5. Single Cell méthode ROS-détection <ol><li> Commencez à l&#39;étape: 3.5. Assurez-vous d&#39;avoir au moins 35 embryons pour chaque condition. </li><li> Transfert d&#39;embryons dans un nouveau plat. Enlever l&#39;eau des poissons autant que possible. Ajouter 10 ml de PBS glacé 1x et 400 pi de inhibiteurs de la protéase cocktail. Dechorionate manuellement embryons avec une pince et retirer le sac du jaune d&#39;oeuf avec une aiguille fine. Remarque: la suppression jaune sac assure échantillons propres pour l&#39;analyse FACS suivant. Cette étape peut être évité selon l&#39;instrument FACS. </li><li> Transfert de-vitellins embryons dans une plaque de 24 puits à puits multiples (15 embryons / puits) et supprimer toute l&#39;eau du poisson. </li><li> Ajouter 300 ul de HBSS, 30 pl de la collagénase P, 50 ul de trypsine-EDTA dans chaque puits. </li><li> Homogénéiser embryons par un léger pipetage de haut en bas avec une pointe de pipette serré (1000 pi). </li><li> Incuber à 28 ° C pendant 20 min et l&#39;homogénéiser les échantillons par pipetage toutes les 5 min. </li><li> Vérifiez DISR tissuuption en observant une aliquote de homogénat au microscope composé. Faciliter la suspension de cellules individuelles par pipetage. Ne pas incuber les embryons pendant plus de 30 min. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 200 ul de solution d&#39;arrêt. Mélanger à la pipette doucement. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube pré-réfrigérés avec fond étanche. Gardez le tube sur la glace et éviter l&#39;exposition de la lumière. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 250 g à 4 ° C. </li><li> Retirez la phase supérieure et les cellules re-suspension avec de la glace froide HBSS par pipetage. </li><li> Compter les cellules et assurez-vous que vous avez le même nombre de cellules dans l&#39;ensemble de vos échantillons. Ne pas utiliser moins de 2 x 10 6 cellules. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 250 xg à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et suspendre le culot avec 1 ml de glace réfrigéré HBSS contenant la sonde ROS-sensible. </li><li> Incuber le tube à la température ambiante pendant 3 minutes dans l&#39;obscurité. Varier la durée d&#39;incubation en fonction du niveau de stress oxydatif et à til sensibilité de la sonde. </li><li> Transférer les cellules dans un tube FACS. Garder les tubes sur la glace et éviter l&#39;exposition de lumière avant l&#39;analyse FACS. </li><li> Trier les cellules avec un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS). Longueurs d&#39;onde réglée conformément à fluorescence Tg de tissu (par exemple, la GFP) et les spectres d&#39;excitation / émission de la sonde moléculaire utilisée pour la détection ROS (par exemple, les sondes ROS-sensibles mitochondriales spécifiques, sondes ROS-sensibles génériques). </li><li> Pour chaque condition, mesurer tous les échantillons dans la même séance expérimentale en appliquant les mêmes paramètres FACS. Calculer le pourcentage de cellules fluorescentes comme la moyenne des différentes répétitions biologiques. Analyser au moins deux répétitions pour chaque condition. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Étapes critiques La procédure de détection d&#39;un stress oxydatif dans les embryons de poisson zèbre décrits ici comprend deux méthodes différentes. L&#39;ensemble de la méthode de montage ROS-détection est principalement un dosage qualitatif pour ROS-détection, tandis que la méthode de détection de ROS cellulaire unique permet des mesures quantitatives plus précises (figure 1). Les deux méthodes offrent un moyen rapide et facile d&#39;évaluer in vivo ROS-détection ...

Le stress oxydatif est spécifiquement définie comme un état qui résulte d&#39;un état redox cellulaire asymétrique. Les réactions d&#39;oxydoréduction complexes qui se produisent régulièrement dans les cellules déterminent l&#39;état redox cellulaire. Les réactions d&#39;oxydoréduction sont constitués de toutes les réactions chimiques qui se composent dans le transfert d&#39;électrons entre les atomes des molécules biologiques produisant la réduction et l&#39;oxydation de molécules (à savoir les réactions d&#39;oxydo-réduction). Ces réactions sont catalysées par des espèces activées électroniquement (par exemple des espèces pro-oxydantes), qui se caractérisent par une extrême instabilité structurelle et activation spontanée d&#39;électrons asymétriques qui échangent avec les biomolécules voisins. Ces réactions résultent en irréguliers dommages à l&#39;ADN, des protéines carboxylation, et l&#39;oxydation des lipides, et peuvent conduire à une mort cellulaire 1. Des niveaux accrus de stress oxydatif ont été associées avec le vieillissement et la progression de différents états pathologiques 2. Le stress oxydatif aété signalé comme étant responsable de modifications vasculaires dans le diabète et les maladies cardio-vasculaires 3,4. Il joue également un rôle critique dans la dégénérescence neuronale dans la maladie d&#39;Alzheimer et la maladie de Parkinson 5. En outre, le stress oxydatif a été démontré comme un facteur essentiel dans la gouvernance progression du cancer et les événements métastatiques 6,7. En outre, les réponses inflammatoires et immunitaires peuvent susciter et à soutenir davantage le stress oxydatif 8. Dans les cellules vivantes, les espèces pro-oxydantes sont dérivées de l&#39;oxygène (ROS, les espèces réactives de l&#39;oxygène) ou de l&#39;azote (RNS; espèces réactives de l&#39;azote). ROS comprennent le radical hydroxyle, l&#39;anion superoxyde (OH.) (O 2 -), et le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2). Le principal RNS est l&#39;oxyde nitreux (NO).. Une série d&#39;espèces réactives secondaires peut être généré par des interactions spontanées entrn ROS et RNS ou les ions métaux libres 9. Par exemple, l&#39;anion superoxyde réagit avec l&#39;oxyde nitreux pour former peroxynitrate (ONOO -), tandis que H 2 O 2 avec la réaction Fe 2 + génère des radicaux hydroxyle. ROS et RNS, en raison de leur capacité à réagir avec plusieurs biomolécules, sont considérés comme une menace dangereuse pour le maintien de l&#39;état redox physiologiques 10. Pour maintenir les cellules de l&#39;état d&#39;oxydo-réduction sont équipées d&#39;une série de détoxification de molécules anti-oxydantes et les enzymes. La superoxyde dismutase (SOD), catalase, glutathion peroxydase et peroxyrédoxines constitue essentiellement l&#39;anti-oxydant enzymatique-arsenal qui fournit une protection cellulaire à partir d&#39;espèces pro-oxydantes, y compris H 2 O 2, OH et OONO -. 11. Également des molécules anti-oxydantes comme la vitamine C et E, polyphénols et CoenzymeQ10 (CoQ10) sont d&#39;une importance critique pour étancher ROS et leur dangereux derivatives 12,13. Cependant, une production excessive des ROS et RNS ou un dysfonctionnement dans le système anti-oxydant, déplace l&#39;état redox cellulaire vers stress oxydatif 14. Outre leur connotation négative, ROS peut jouer différents rôles physiologiques dans les cellules d&#39;origine différente. Les cellules produisent normalement ROS comme molécules de signalisation de la médiation des événements biologiques normaux tels que la défense de l&#39;hôte et la réparation des plaies 15-17. Les espèces réactives sont normalement produites dans les cellules par des enzymes intracellulaires telles que NOx (NADPH oxydase) et XO (xantine oxydase) en réponse à des facteurs de signalisation, des facteurs de croissance, et des fluctuations de niveaux intracellulaires de calcium 18,19. Il a été rapporté que les ROS peut différentiellement moduler l&#39;activité des facteurs nucléaires importantes telles que p53 ou des composants cellulaires tels que l&#39;ATM-kinase, un régulateur maître de la réponse aux dommages de l&#39;ADN 20. Analogue ROS influencent fortement la signalisation cellulaire par la médiation eoxydation de e et l&#39;inactivation des protéines tyrosine phosphatases (PTP), qui sont établis en tant que régulateurs critiques de la transduction du signal 21. En outre, la protéomique basée méthodologies démontrent que RNS sont également responsables de modifications et altérations de la signalisation moléculaire de protéines spécifiques. RNS réagissent avec les groupements thiols de cystéine en les modifiant en S-nitrothiols (SNO) et de déclenchement voies moléculaires concomitantes avec des états pathologiques tels que les maladies inflammatoires et auto-immunes 22,23. Etant donné que des expériences de culture cellulaire ne se reproduisent que partiellement la multitude de facteurs qui agissent in vivo, il est d&#39;un grand intérêt de réaliser des études d&#39;oxydo-réduction dans les modèles animaux 24,25. Pour ce faire, le poisson-zèbre a été considéré comme un modèle animal vertébré approprié pour étudier la dynamique de stress oxydatif 26. Le poisson zèbre est un nouveau système de modèle qui accorde plusieurs avantages pour étudier les événements cellulaires et génétiques au cours des vertébrés developpement et la maladie. Grands groupes d&#39;embryons hebdomadaire peuvent être générées et disponibles pour des besoins expérimentaux. En outre, la clarté optique extraordinaire embryons de poisson zèbre, ainsi que leur petite taille, permet l&#39;imagerie cellulaire unique et le suivi dynamique dans toute une organismes 27. Dans la dernière décennie, un nombre considérable de mutants de poisson zèbre a été générée pour modéliser des conditions pathologiques comme le cancer et les maladies génétiques 28-31. Plus important encore, une multitude de lignées transgéniques ont été produites pour permettre de nombreuses possibilités de manipulations génétiques et biologiques 32. Par exemple, des lignées spécifiques de tissus de poisson-zèbre transgénique sont régulièrement utilisés pour des études in vivo. Ces lignées expriment une protéine fluorescente sous le contrôle d&#39;un promoteur choisi, en offrant la possibilité d&#39;identifier des cellules individuelles in vivo, ainsi que la structure anatomique qu&#39;elles comprennent. Plusieurs études toxicologiques ont déjà utilisé til de poisson zèbre pour évaluer l&#39;effet in vivo de produits chimiques sur homéostasie redox, suggérant la pertinence de ce vertébré comme un modèle animal pour le domaine de la découverte de médicaments et le stress oxydatif 33-35. Même si certains des sondes fluorescentes ont été testés pour surveiller le stress oxydatif chez les larves de poisson zèbre 36,37, il n&#39;y a pas de tests mis en place pour détecter et mesurer les niveaux de stress oxydatif dans les tissus de poisson zèbre et les cellules vivantes. Ici, nous décrivons un procédé pour la quantification in vivo du stress oxydatif dans les cellules d&#39;embryons de poisson zèbre vivant. Les outils d&#39;imagerie, tri FACS, des sondes fluorescentes et les conditions pro-oxydantes sont combinés pour générer simple test pour la détection et la quantification des espèces oxydantes dans des embryons et des tissus de poisson zèbre.

<table><tbody><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>NE PAS STOCKER LES DILUITIONS</td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hank 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Aquarium Mélange de sel de mer</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Csonde générique sensible aux ROS : CellROX Deep Red Reagent</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Sonde sensible aux ROS spécifique aux mitochondries : MitoSOX&nbsp ;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>dissoudre un flacon avec 13 &mu ; l de DMSO</td></tr><tr><td>Hydroéthidine</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Préparer une solution mère de 5 mM dans du DMSO.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870 ; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>dissoudre la poudre dans du DMSO ; diluite dans l’eau</td></tr><tr><td>de poisson Iodure de propidium&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycine D (7-AAD)&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td> : Timme-LaLaragy et al. ; 2012 (PMID : 22174413) ; Kobayashi et al. ; 2002 (PMID :12167159)</td></tr><tr><td>Collagénase P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Dissoudre la poudre à 100 mg/ml dans du HBSS stérile. Stocker les aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur complet de protéase Comprimés</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Dissoudre un comprimé dans 1 ml d’eau</td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA (10x), sans rouge de phénol</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Préparer 1x solution de travail avant utilisation</td></tr><tr><td>Microscope composé&nbsp ;</td><td>Stéréomicroscope ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>avec éclairage fluorescent</td> Appareil photo <td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>pour l’acquisition d’images de fluorescence</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules activées par fluorescence</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS&nbsp ;</td><td>Plaque multipuits BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Falcon</td><td>353047 Boîtes de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri stérilisées, non traitées 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Des niveaux élevés d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) peuvent entraîner une modification de l&#39;état redox cellulaire vers l&#39;état de stress oxydatif. Cette situation provoque l&#39;oxydation de molécules (lipides, ADN, protéines) et conduit à la mort cellulaire. Le stress oxydatif a également un impact sur la progression de plusieurs pathologies telles que le diabète, les rétinopathies, la neurodégénérescence, et le cancer. Ainsi, il est important de définir des outils pour étudier les conditions de stress oxydatif, non seulement au niveau des cellules individuelles, mais aussi dans le contexte des organismes entiers. Ici, nous considérons l&#39;embryon de poisson zèbre comme un utile système in vivo pour effectuer des études et présenter un protocole pour mesurer le stress oxydatif in vivo. Profitant de sondes fluorescentes ROS et des lignes fluorescentes de poisson zèbre transgénique, nous développons deux méthodes différentes pour mesurer le stress oxydatif in vivo: i) un &quot;embryon toute méthode ROS-détection&quot; pour la mesure qualitative du stress oxydatif et ii) un &quot;unicellulaire ROS méthode de détection &quot;pour des mesures quantitatives de stress oxydatif. Ici, nous démontrons l&#39;efficacité de ces procédés, en augmentant le stress oxydatif dans les tissus par des agents oxydants et des méthodes physiologiques ou génétiques. Ce protocole est prête pour les écrans génétiques avant et il aidera relations adresse de cause à effet de ROS dans des modèles animaux de pathologies liées au stress oxydatif, comme les troubles neurologiques et le cancer.

En appliquant la méthode décrite ici, nous pouvons facilement mesurer et détecter le stress oxydatif (et niveaux de ROS) dans les tissus embryonnaires de poisson zèbre. Après avoir traversé le poisson zèbre adulte, les oeufs sont recueillis et ont permis de développer à 28 ° C à 72 heures après la fécondation (HPF). Pour induire un stress oxydatif, nous proposons deux approches différentes: 1) le traitement des embryons avec de fortes réactifs pro-oxydants ou 2) la promotion de la formation de ROS après une lésion tissu...

Ici, nous rapportons un protocole pour mesurer le stress oxydatif chez les embryons de poisson-zèbre vivants. Cette procédure permet de détecter les espèces réactives de l’oxygène (ROS) à la fois dans les tissus embryonnaires entiers et dans les populations unicellulaires. Ce protocole permettra d’effectuer des analyses qualitatives et quantitatives.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer de manière qualitative et quantitative le stress oxydatif chez des embryons vivants de poisson zèbre. Ceci est réalisé en ajoutant une solution oxydante à des embryons préparés afin d'induire un stress oxydatif, ou en créant une lésion au niveau de la nageoire caudale de l'embryon. Les embryons sont ensuite traités pour la détection du stress oxydatif selon une méthode monocellulaire ou selon une méthode de montage entier.Ensuite, les préparations sont incubées avec une sonde de détection des ROS. Les résultats peuvent indiquer le taux de stress oxydatif et le niveau de ROS, selon une microscopie confocale de montages complets ou une analyse cytofluorométrique de cellules individuelles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'immunofluorescence pour les marqueurs de stress oxydatif, est qu'elle permet une détection directe dans le contexte d'un organisme vivant et une quantification au niveau de tissus individuels.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche fondamentale, comme l'exploration des conditions de stress oxydatif dans le co

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Biologie

Poisson-zèbre constituent un modèle vertébré puissant qui a été sous-utilisée pour les études métaboliques. Nous décrivons ici un moyen rapide pour mesurer...

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

Cette vidéo présente un test basé sur l’immunofluorescence très sensible pour détecter les dommages oxydatifs induits par les PM2,5 dans le cœur des embryons de poisson-zèbre en mesurant les niveaux de 8-OHdG et de γH2AX, qui indiquent respectivement des dommages à l’ADN et des cassures de l’ADN double brin.

Dosage de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN médiés par les PM2,5 chez les embryons de poissons

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High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

L'exposition à des agents tératogènes peut causer des malformations congénitales. Poisson zèbre sont utiles pour déterminer le potentiel tératogène de produits chimiques. Nous démontrons l'utilité de poisson zèbre en exposant embryons à différents niveaux de nitrites et également à différents moments de l'exposition. Nous montrons que le nitrite peut être toxique et provoquer des anomalies graves du développement.

Poisson zèbre comme modèle pour évaluer le potentiel tératogène de nitrite

Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.

Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

Ce protocole utilise un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs disséqués des embryons de poisson-zèbre.

Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre

Le poisson-zèbre a récemment été exploité comme modèle pour valider les modificateurs potentiels de rayonnement. Le présent protocole décrit les étapes détaillées de l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour des expériences de dépistage basées sur les rayonnements et certaines approches observationnelles pour évaluer l’effet de différents traitements et rayonnements.

Les larves de poisson-zèbre comme modèle pour évaluer les radiosensibilisants ou les protecteurs potentiels

Les RASopathies sont des syndromes génétiques multisystémiques causés par l’hyperactivation de la voie RAS-MAPK. Des variants potentiellement pathogènes en attente de validation émergent en permanence alors que de mauvaises preuves précliniques limitent le traitement. Ici, nous décrivons notre protocole in vivo pour tester et valider les niveaux d’activation ERK associés à RASopathy et sa modulation pharmacologique au cours de l’embryogenèse par imagerie FRET en direct chez le poisson-zèbre...

Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Ce protocole décrit une méthode de microscopie optique peu coûteuse pour évaluer la morphologie et la fonction cardiaques chez les embryons de poisson-zèbre, permettant une évaluation reproductible de la cardiotoxicité pour le développement sans avoir besoin de systèmes d’imagerie avancés.

Imagerie cardiaque fonctionnelle chez les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie standard et de l’analyse vidéo : applications dans la recherche environnementale et biomédicale

Découvrez comment mesurer le stress oxydatif dans les embryons de poissons zèbres vivants. Cette méthode permet une détection qualitative et quantitative des espèces réactives de l'oxygène au niveau des tissus et des cellules individuelles.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

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