Harmonique nanoparticules régénératrice recherche

L’objectif global de l’expérience suivante est le suivi in vitro de grappes de perles cardiaques dérivées de cellules souches embryonnaires humaines en 3D, en temps réel et à haute résolution spatiale. Ceci est réalisé en cultivant et en développant d’abord des cellules souches embryonnaires jusqu’à ce qu’elles forment des corps d’Embry. Ensuite, les grappes de battage sont disséquées et plaquées sur des filtres poreux en POLYTÉTRAFLUOROÉTHYLÈNE ou en PTFE, ce qui leur permet d’être maintenues sous forme d’air à long terme.

Les cultures liquides, puis les grappes battantes, sont marquées avec des nanoparticules harmoniques afin d’effectuer une microscopie multiphotonique en temps réel. Les résultats obtenus permettent d’analyser l’allongement spatial et la fréquence des contractions cardiaques à l’échelle microscopique. Le principal avantage de ces nanoparticules est donc que vous pouvez utiliser n’importe quelle longueur d’onde, en particulier l’infrarouge, ce qui vous permet d’aller plus profondément dans les tissus et elles sont également très stables dans le temps.

Nous pouvons ainsi surveiller nos longs processus sur de longues périodes. Cette méthode de culture de cellules souches peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la contraction fonctionnelle des cardiomyocytes en trois dimensions. En particulier, la maturation cardiaque et l’ingénierie tissulaire.

Les individus doivent savoir que la procédure de marquage avec des nanoparticules harmoniques ne peut être utilisée que pour la microscopie multiphotonique et ne peut pas être transférée à d’autres types de systèmes d’imagerie. C’est en 2005 que nous avons eu l’idée d’utiliser des nanoparticules harmoniques. Ces nanoparticules présentent des avantages par rapport aux colorants fluorescents et aux points quantiques.

En fait, leur signal ne s’estompe pas avec le temps et ils peuvent être utilisés pour surveiller des échantillons en développement sur de longues périodes. La démonstration visuelle de la préparation de l’échantillon est essentielle pour l’efficacité et la reproductibilité des différentes étapes, en particulier lors de la réalisation de tests de dépistage de drogues, et pourrait également être appliquée à différents tissus ou maladies. Modélisation tissulaire.

Après avoir cultivé et développé des cellules souches embryonnaires humaines ou ESC selon le protocole textuel et les avoir incubées avec de la collagénase chaude, quatre pendant 10 minutes, collectez les fragments de colonie dans deux millilitres de différenciation fraîche, milieu ou DM et centrifugez à 115 fois la gravité pendant trois minutes. Culture, la colonie se fragmente en suspension dans des attaches ultra faibles. Six plaques de puits pendant quatre jours pour leur permettre de former des corps embryonnaires ou ebs.

Ensuite, plaquez l’EBS nouvellement formé sur 0,1 % de plaques à 24 puits enduites de gélatine pendant 15 à 30 jours jusqu’à l’apparition de grappes de battage. Retirez le PBS et à l’aide d’acutus, dissociez les colonies en cellules uniques après centrifugation et réusation, en suspendant les cellules dans une plaque moyenne DM de deux millilitres par agro. Bien loger et incuber à 37 degrés Celsius pendant une journée.

Recueillir l’EBS nouvellement formé et en déposer trois par puits sur des plaques de 24 puits recouvertes de gélatine à 0,1 % après deux à quatre semaines de culture. Identifiez les grappes de cardiomyocytes battants et, à l’aide d’une pipette à pâte allongée et fortement coupée, disséquez-les manuellement. Déposez quatre filtres en PTFE par insert et placez-les chacun dans un puits d’une plaque à six puits.

Après avoir ajouté un millilitre de DM dans chacun, ajoutez bien un grappe de battement disséquée sur chaque filtre PTFE. Pour étiqueter les grappes, transférez les filtres PTFE avec les grappes de battage dans un plat à fond en verre de 3,5 centimètres. Ajoutez un millilitre de nanoparticules de génération de seconde harmonique à 50 microgrammes par millilitre et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour réaliser une imagerie optique non linéaire.

Après avoir transféré des HEB marqués ou des grappes de battements cardiaques dans une chambre d’imagerie, utilisez l’imagerie à grand champ sous éclairage à lumière blanche pour identifier les structures d’intérêt au sein d’EBS différenciés ou de grappes de battements actifs. Effectuez un balayage tridimensionnel rapide à basse résolution pour reconstruire la morphologie globale de l’amas cardiaque et sélectionnez un plan d’image dans le volume de l’amas avec plusieurs nanoparticules visibles de génération de secondes harmoniques à surveiller en temps réel. Les contractions de l’amas cardiaque placent le scanner optique du microscope dans le mode le plus rapide, permettant l’acquisition d’images bidimensionnelles multihertz.

Analysez les images à l’aide du logiciel MATLAB selon le protocole texte, comme illustré ici, avant d’évaluer l’activité de battement. La caractérisation de la réponse optique non linéaire des filtres PTFE est effectuée pour s’assurer que le substrat nu à la fluorescence des photons est très faible et ne peut pas empêcher la mesure des échantillons biologiques pertinents et l’émission d’échantillons isolés. Les nanoparticules de génération de seconde harmonique peuvent être facilement acquises par imagerie à travers le substrat en mode de détection épi.

Dans cette figure, les nanoparticules de génération de seconde harmonique marquées structures cardiaques et EBS sont représentées en pale. Les couleurs rouge, jaune et verte correspondent à l’autofluorescence du NADH tandis que les taches bleues intenses de seconde harmonique proviennent de nanoparticules isolées de génération de seconde harmonique. Notez le bon contraste optique et le marquage relativement clairsemé par rapport aux points quantiques ou aux nanoparticules de conversion ascendante.

Cette figure illustre une vue en coupe d’une deuxième nanoparticules de génération d’harmoniques étiquetées cluster de battements cardiaques. Comme le montre cette vidéo, les structures 3D sont enregistrées à grande vitesse pour surveiller le modèle de contraction dans la deuxième cellule. Les nanoparticules de génération d’harmoniques s’agrègent pour maintenir un taux de vitesse d’acquisition élevé pour résoudre le mouvement NP.

La sensibilité d’acquisition globale n’était pas suffisante pour enregistrer l’autofluorescence des cellules avec émission de seconde harmonique à partir de la génération de la seconde harmonique. L’analyse d’images de nanoparticules effectuée sur des images vidéo indique qu’à l’intérieur d’un même cluster cardiaque, le déplacement est de l’ordre de quelques micromètres, et la fréquence est constante pour le mouvement des nanoparticules de génération de seconde harmonique. Lorsqu’on maîtrise la technique de préparation cellulaire, la dissection de la grappe de paris, la culture d’air liquide et l’agnelage peuvent être effectués en 24 à 36 heures s’ils sont effectués correctement.

Surtout avec cette technique, les contacts à l’air libre doivent être évités pour éviter les contaminations. En suivant cette procédure, on peut appliquer d’autres méthodes telles que des enregistrements électrophysiologiques utilisant plusieurs réseaux d’électrodes afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la corrélation des profils de potentiel d’action avec la fréquence de battement en trois dimensions. Notre nouvelle technique basée sur la détection du signal non linéaire par des nanoparticules harmoniques peut être développée davantage pour les études in vivo qui infectent les longueurs d’onde utilisées pour l’imagerie permettent une pénétration plus profonde dans les tissus.

Un développement possible pourrait être de suivre l’intégration de la structure dérivée de cellules souches pour des applications de médecine régénérative.