Évaluation de la régénération vasculaire dans le SNC Utilisation de la rétine de souris

La rétine de rongeur a depuis longtemps été reconnue comme une fenêtre accessible au cerveau. Dans ce document technique que nous fournissons un protocole qui utilise le modèle de souris de la rétinopathie induite par l'oxygène d'étudier les mécanismes qui conduisent à l'échec de la régénération vasculaire dans le système nerveux central après lésion ischémique. Le système décrit peut également être mise à profit pour explorer des stratégies pour favoriser la repousse des vaisseaux sanguins fonctionnels au sein de la rétine et du système nerveux central.

L’objectif global de cette procédure est d’explorer des stratégies pour favoriser la repousse des vaisseaux sanguins fonctionnels dans la rétine et le SNC après une lésion ischémique. Ceci est accompli en utilisant d’abord un modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène. Ensuite, les composés sont délivrés à l’œil par des injections intravitréennes.

La perfusion des vaisseaux et la fonction barrière sont ensuite vérifiées par angiographie à la fluorescéine. La dernière étape consiste à extraire l’œil et à isoler la rétine. La rétine est ensuite colorée et montée avant l’imagerie.

En fin de compte, la microscopie à immunofluorescence est utilisée pour évaluer les taux de régénération vasculaire après des traitements intravitréens ou chez des souris présentant des modifications génétiques. La technique que nous présentons fournit un système facile et hautement reproductible dans lequel évaluer la régénération vasculaire dans le système nerveux central. Il est basé sur le modèle de Smith de la rétinopathie induite par l’oxygène et peut être très utile dans la conception de stratégies thérapeutiques pour remédier à l’ischémie dans le système nerveux central.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les mécanismes moléculaires qui entraînent ou empêchent la régénération fonctionnelle des vaisseaux sanguins. Dans la CNS. Il peut être utilisé pour étudier l’impact des gènes, des composés pharmacologiques ou élucider les mécanismes pathologiques qui déclenchent la croissance vasculaire.

En plus des maladies oculaires, cette technique peut être extrapolée à d’autres zones du SNC, telles que le cerveau et la moelle épinière. Pour commencer, placez les bébés souris à P sept et une mère adoptive CD dans une chambre à oxygène réglée à 75 % d’oxygène cinq jours plus tard, retirez les animaux de la chambre et remettez-les dans des conditions de logement normales. Ensuite, à P 12 ou P 14, des injections intravitréennes sont effectuées pour délivrer des composés à la rétine interne.

Après avoir anesthésié des souris, vérifiez l’efficacité de l’anesthésie en pinçant séquentiellement la queue, l’arrière-pied et l’oreille avec des pinces. Une aiguille de verre biseautée attachée à une seringue de 10 microlitres avec une goutte de résine époxy doit être préparée à l’avance. Localisez le site d’injection au niveau du limbe postérieur de l’œil.

Insérez l’aiguille à un angle de 45 degrés et injectez le composé d’intérêt. Après avoir appliqué la pommade sur l’œil, retournez la souris dans la cage avec une mère nourricière pour commencer à centrifuger la solution de fluorescéine Dexter et recueillir le surnat pour prévenir la constriction des vaisseaux. Réchauffez la solution de fluorescéine dextrine avant l’injection.

Ensuite, confirmez la profondeur de la sédation chez la souris anesthésiée. Lorsque vous êtes prêt, faites une incision médiane sur l’abdomen avec des ciseaux de dissection. Après avoir ouvert la cage thoracique et retiré le tissu périphérique du cœur, clampez l’aorte descendante.

Insérez une aiguille de calibre 25 remplie de fluorescéine dextrine réchauffée dans le ventricule gauche et perfuser la solution. Dans les deux minutes suivant l’injection, décapitez l’animal et placez la tête sur le côté. Retirez la peau et les paupières en recouvrant l’œil avec des ciseaux à disséquer.

Ensuite, placez une pince incurvée sous l’œil et tirez-la doucement vers le haut jusqu’à ce que le nerf optique soit sectionné. Tournez la tête de la souris de l’autre côté et répétez ces étapes. Pour assurer une meilleure pénétration du fixateur, percez un trou dans la chambre antérieure de l’œil.

À l’aide d’une aiguille de calibre 30, transférez les yeux dans un tube contenant 4 % de paraforme, aldéhyde, et fixez pendant une heure à température ambiante. Après ce temps, retirez le PFA et lavez-vous les yeux quatre fois avec du PBS glacé. Placez les yeux dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid et placez-les sous un stéréomicroscope.

Une fois en place, retirez tout tissu supplémentaire entourant l’œil avec des ciseaux de microdissection et coupez la cornée. À l’aide de deux paires de pinces, décollez la sclère de la périphérie vers le nerf optique. Pincez la lentille avec une pince et extrayez-la de l’œilleton.

Utilisez une paire de pinces comme support et l’autre pour saisir et soulever et retirer soigneusement la lentille. Détachez les vaisseaux aloïdes de la face interne de la rétine à l’aide d’une petite brosse et d’une pince. Ensuite, retirez les faisceaux de vaisseaux hyaloïdes reliés au disque optique à l’aide d’une pince.

Transférez les rétines disséquées dans un microtube à centrifuger de deux millilitres contenant du PBS et placez-les sur de la glace. Avant de commencer la procédure de coloration, les rétines disséquées sont d’abord incubées pendant la nuit avec une légère secousse à quatre degrés Celsius. Dans une solution, une isosélectine B quatre couplée par fluorescence contenant du chlorure de calcium Pendant toute la procédure de coloration, les tubes doivent être recouverts d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la lumière le lendemain.

Retirez la solution colorante et lavez les rétines trois fois dans du PBS pendant 10 minutes. À température ambiante, transférez le photorécepteur de la rétine côté vers le bas sur un microscope. Glissez tout en renforçant la rétine avec une brosse.

Faites quatre incisions radiales équidistantes profondes. À l’aide d’un scalpel chirurgical, aplatissez soigneusement les quadrants et plongez la rétine dans un support de montage pour le photo-blanchiment Placez soigneusement une lamelle sur la surface de la rétine montée sans appliquer de pression et en évitant les bulles d’air. Enfin, les lames sont imagées et quantifiées.

Pour l’oblitération vaso, une augmentation dose-dépendante de la régénération vasculaire a été observée après l’injection de Trin one à P 14 et la repousse. Évalué à P 17 les vaisseaux avec une fonction barrière compromise fuient la fluorescence après profusion d’une dextrine fluorescente après une injection intravitréenne de lentivirus. À P 3, l’inhibition d’IRE 1 alpha a considérablement amélioré la régénération vasculaire dans la phase de croissance vasculaire à P 17.

Une fois ces techniques maîtrisées, l’injection intravitréenne, la perfusion cardiaque et l’extraction rétinienne devraient chacune prendre environ 10 minutes si elles sont effectuées correctement. Lors de cette procédure, il est important de préserver la structure 3D de l’œil, d’éviter une pression excessive qui peut endommager la rétine et compromettre les résultats. N’oubliez pas que travailler avec des animaux, des virus ou des composés bioactifs peut être extrêmement dangereux.

Des précautions de sécurité et des outils stérilisés doivent toujours être utilisés lors de l’exécution de cette procédure.