Induite par laser Répartition Spectroscopy: Une nouvelle approche pour la cartographie et la quantification de nanoparticules dans les tissus d'organes

L'objectif général de cette procédure est de proposer une méthode simple et robuste pour cartographier et quantifier les éléments organiques et inorganiques dans les tissus biologiques à l'aide d'un équipement de table entièrement compatible avec la microscopie optique conventionnelle. Ceci est réalisé en focalisant une impulsion laser sur l'échantillon d'intérêt afin d'initier la décomposition et l'étincelle du matériau. Le plasma émet un rayonnement qui est ensuite analysé par un spectromètre.

La deuxième étape consiste à sélectionner et identifier les raies spectrales correspondant aux éléments d'intérêt et à balayer la surface de l'échantillon. Ensuite, effectuez des mesures d'étalonnage afin de déterminer les concentrations élémentaires. La dernière étape consiste à établir la cartographie élémentaire du tissu de l'échantillon à partir de tous les spectres enregistrés, en utilisant une échelle d'intensité relative ou de concentration.

En fin de compte, la spectroscopie de décomposition induite par laser est utilisée pour montrer la distribution tissulaire de divers éléments sans aucun marquage, comparée à d'autres méthodes existantes telles que la fluorescence micro-X ou les techniques basées sur la spectrométrie de masse. La spectroscopie de décomposition induite par laser, ou LIBS, est simple à mettre en œuvre, fonctionne à pression atmosphérique et est compatible avec la plupart des systèmes de microscopes optiques.

En outre, elle permet d'atteindre un niveau de sensibilité en parties par million avec une résolution de l'ordre du micron. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé en nanotechnologie appliquée aux études biologiques, comme la distribution dans un échantillon de tissu de nanoparticules contenant un élément métallique, sans nécessiter l'étiquetage des nanoparticules. La technique peut s'étendre à la pathologie en raison de sa faible limite de détection pour identifier des éléments métalliques anormaux tels que le cuivre, le fer et l'aluminium pouvant être présents dans différents organes du corps, en particulier le cerveau. Cette méthode peut ainsi fournir des informations sur la détection et l'identification des nanoparticules.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme la détection d'éléments inorganiques dans l'unité de charge utile (TCU) ou la distribution d'éléments hétérogènes. Les scientifiques amenés à réaliser de telles expériences devront ajuster soigneusement les paramètres d'acquisition afin d'obtenir un signal aussi fort que possible sans endommager excessivement les échantillons. Commencez l'expérience en préparant les lames d'échantillons à étudier pour ce protocole.

Obtenez des organes à partir de souris porteuses de tumeurs, injectées avec une solution de nanoparticules de gadolinium, afin de réaliser des lames. Placez des tranches d'organes de 100 micromètres d'épaisseur sur une lame en quartz ou dans une boîte de Pétri. Conservez toujours les lames à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, préparez les échantillons pour l'étalonnage. Étiquetez plusieurs vials avec des concentrations, en commençant à zéro nanomolaire et en terminant à cinq millimolaires. Pour chaque vial, préparez 100 microlitres de mélange d'eau contenant du gadolinium à la concentration appropriée.

Une fois cette étape terminée, préparez une lame. Prélevez cinq microlitres à partir du premier flacon et déposez-les sur la lame en quartz ou dans la boîte de Pétri. Veillez à identifier la goutte pour une utilisation ultérieure.

Déplacez-vous de trois millimètres le long de la circonférence et déposez cinq microlitres de la concentration suivante sur la lame. Procédez de la même manière pour chacune des solutions restantes. Laissez sécher le contenu de la lame pendant 20 minutes à température ambiante.

Ce dispositif LIP utilise un laser nanoseconde au néodyme-yttrium-aluminium-grenat produisant un faisceau de longueur d'onde 1064 nanomètres. Utilisez une partie du faisceau pour synchroniser le système de spectromètre. Dirigez l'autre partie à travers un atténuateur commandé par ordinateur, utilisé pour ajuster et stabiliser l'énergie des impulsions laser pendant toute la durée de l'expérience.

Ensuite, dirigez le faisceau vers la zone d'échantillon. Focalisez le faisceau sur la platine de translation contrôlée par logiciel, qui maintiendra le porte-échantillon, ainsi qu'une caméra CCD pour surveiller le montage de la surface de l'échantillon.

Un autre pour surveiller le panache de plasma. Analyser la lumière provenant de la décomposition de l'échantillon dans un spectromètre à réseau avec une caméra ICCD maintenue à moins 26 degrés Celsius. Pour la mesure, commencer par stabiliser le laser et refroidir la caméra à moins 26 degrés Celsius.

10 minutes avant l'expérience. Lorsque vous êtes prêt, utilisez l'atténuateur pour régler l'énergie de l'impulsion à cinq millijoules. Ensuite, récupérez une lame d'échantillon à étudier et préparez-vous à la monter sur la platine d'échantillon.

Fixez l'échantillon sur le porte-échantillon motorisé. Une fois cette opération terminée, retournez à l'ordinateur. Pour positionner l'échantillon, déplacez la platine afin qu'une partie de l'échantillon se trouve dans le faisceau du laser.

Régler le foyer du laser à environ 100 micromètres sous la surface de l'échantillon. Une fois cette opération effectuée, le laser forme des cratères de 50 micromètres ou moins. Utiliser l'ordinateur pour régler la fente d'entrée du spectromètre à 40 micromètres et les paramètres du tube ICCD pour la mesure de cartographie.

Réglez la position du support pour cibler une région de l'échantillon. Prenez une image panoramique haute résolution de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière à large spectre. Utilisez ensuite un logiciel et l'image capturée pour définir la région de balayage et la résolution du libs.

Ici, la grille mesure 100 sur 100, avec 100 micromètres entre chaque point. Lancez l'acquisition automatisée des données en chaque point de la grille. Un spectre est mesuré et enregistré dans un fichier.

Lorsque les mesures sont terminées dans environ 30 minutes, prendre une deuxième image de la tranche d'échantillon, puis regrouper tous les spectres en un seul fichier de données pour une utilisation ultérieure. Ensuite, retirer la lame d'échantillon et préparer le montage des échantillons de calibration. Fixer la lame de quartz contenant les échantillons de calibration sur la platine de translation près de l'ordinateur.

Positionnez le centre du premier échantillon d'étalonnage dans le trajet du laser. Conservez les paramètres de l'expérience et enregistrez un spectre. Procédez de la même manière pour chacun des échantillons de concentrations différentes de gadolinium.

Voici des exemples de spectres enregistrés en une seule prise à partir de différentes régions du tissu rénal. Le spectre bleu a été enregistré dans la région centrale du rein. Le spectre rouge correspond à la membrane rénale et le spectre vert concerne la zone périphérique.

Les nanoparticules injectées, à base de gadolinium, sont composées d'une matrice de polys laane avec des ions gadolinium chélatés par un ligand doca à leur surface. Dans la plage spectrale de 286 nanomètres à 320 nanomètres utilisée, le gadolinium, le calcium, le fer, le silicium et l'aluminium peuvent être détectés. Remarquez comment les intensités varient selon les différentes régions de l'échantillon, suggérant une grande hétérogénéité des concentrations de ces éléments. La cartographie tissulaire du gadolinium, du silicium et du fer dans une coupe de rein de souris a été réalisée à l'aide des données provenant de libs avec une résolution d'environ 100 micromètres.

L'intensité de l'échelle est exprimée en unité arbitraire. Il s'agit d'une image en lumière naturelle. À titre de comparaison, des résultats similaires ont été obtenus avec des échantillons tumoraux.

Comme pour cette carte du gadolinium et du tissu tumoral SQ 20 B, une échelle de couleurs fausses a été superposée à l'image en lumière naturelle. Pour cette expérience, des nanoparticules ont été administrées directement dans la tumeur. Après une heure, la tumeur a été retirée et préparée pour analyse.

Notez que près de la moitié du volume tumoral contient des particules sur les échantillons. Cette technique peut être réalisée en moins d'une heure pour des échantillons d'un centimètre carré avec une résolution de 100 micromètres, à condition d'être effectuée correctement. Lors de l'analyse par LIBS, il est important de garder à l'esprit que les mesures sont effectuées à partir du plasma induit par laser et qu'il est crucial de contrôler tous les paramètres pendant toute la durée de l'expérience en suivant scrupuleusement le protocole.

D'autres méthodes peuvent être réalisées, comme l'immunohistochimie sur des tranches adjacentes, afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le type de cellule impliqué dans le processus d'intérêt après son développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la nanotechnologie appliquée à la biologie et à la médecine pour explorer la distribution de composés contenant des éléments métalliques dans les tissus biologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser les techniques de lips afin de cartographier plusieurs éléments dans les tissus biologiques.