À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une imagerie immunofluorescente in vivo de l'oreille de souris porteuses de mélanome afin d'étudier la dynamique des composants de la matrice du tissu tumoral. Cela est réalisé en inoculant d'abord des cellules de mélanome B16F10 exprimant la GFP dans l'oreille d'une souris. Ensuite, une chirurgie est effectuée sur l'oreille de la souris afin de séparer la peau ventrale de la peau dorsale et d'exposer le tissu tumoral.

Ensuite, une immunomarquage est effectuée sur le tissu exposé de l'oreille dorsale. Enfin, l'animal est préparé pour l'imagerie intravitale. En définitive, une microscopie stéréo fluorescente ou une microscopie multiphoton est utilisée pour montrer la localisation et le comportement dynamique des cellules tumorales ainsi que de leurs composants matriciels.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux autres méthodes d'imagerie en direct est que nous pouvons observer les interactions dynamiques entre les cellules tumorales et les cellules associées au stroma, telles que les cellules immunitaires, mais dans le contexte d'une matrice extracellulaire fibrillaire et en forme de réseau. Cette méthode peut donc vous aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie tumorale, comme la manière dont les cellules tumorales interagissent avec leur microenvironnement physique, ce qui pourrait à son tour fournir des informations importantes sur la progression des tumeurs. Une partie de la procédure sera démontrée par Vita Kki, scientifique principale de notre laboratoire. Pour préparer les cellules tumorales à l'injection, commencez par cultiver des cellules de mélanome B 16 F 10 GFP.

Après centrifugation des cellules, transférez-les dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre et centrifugez à nouveau ; retirez tout le surnageant sauf une fine couche de milieu qui reste juste au-dessus du culot, puis resuspendez les cellules pour obtenir une suspension cellulaire concentrée, prête à être chargée sous forme de suspension dans un volume de 10 microlitres à l’aide d’une seringue Hamilton. Retirez le bouchon de l’aiguille fixée de calibre 33 et chargez 20 microlitres de la suspension au-dessus de la chambre de l’aiguille.

Ensuite, tirez doucement sur le piston jusqu'à ce que cinq microlitres de suspension soient chargés à l'intérieur de la seringue. Après avoir anesthésié une souris C57BL/6 à l'aide d'une anesthésie injectable, rasez la tête de la souris, retirez les poils sur la tête et autour de l'oreille, puis rincez à l'eau. À l'aide d'un ruban adhésif, fixez le bord proximal de l'oreille sur l'extrémité d'un doigt index.

Insérez l'aiguille de la seringue Hamilton entre le derme dorsal et le cartilage de l'oreille d'une souris C57 black six, en pénétrant l'oreille de la partie proximale vers la partie distale sur environ deux à trois millimètres. Injectez la suspension cellulaire et retirez lentement l'aiguille de la peau. Laissez les cellules tumorales former une tumeur solide sur une période de sept à neuf jours, en utilisant un microscope à fluorescence pour suivre la croissance tumorale.

Après avoir anesthésié la souris à l’aide d’un mélange d’oxygène humidifié et d’isoflurane, placer la souris sur un tapis chauffant réglé à 37 degrés Celsius et effectuer une légère pincée du orteil afin de confirmer que l’animal est suffisamment anesthésié. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux et maintenir la souris sur un tapis chauffant contrôlé par un thermistor rectal pendant toute la durée de la procédure.

Ensuite, placez délicatement l'oreille porteuse de la tumeur sur un empilement de lames de verre. Utilisez ensuite de petites bandes de ruban adhésif pour fixer les bords antérieur et postérieur de l'oreille à l'empilement. À l’aide d’un scalpel, incisez la peau ventrale de l’oreille le long de l’anthélix de la pavillon de la souris. Retirez les bandes adhésives de l’oreille à l’aide de pinces courbes.

Détacher délicatement le derme ventral et le cartilage du derme dorsal. Utiliser du tampon de Ringer pour laver l'oreille afin de réaliser une coloration immunofluorescente. Appliquer les anticorps primaires ciblant les molécules de la matrice extracellulaire dans du tampon de blocage sur l'oreille exposée, puis poser une lamelle par-dessus.

Incuber pendant 15 minutes avant d'utiliser environ cinq millilitres de tampon de Ringer pour laver l'oreille deux fois. Appliquer les anticorps secondaires appropriés ou la streptavidine dans le tampon de blocage. Appliquer une lame couvre-objet et incuber pendant 15 minutes avant de laver deux fois comme précédemment. Replier la zone dermique ouverte dans l'EM mencia conki et utiliser des compresses stériles pour sécher la dermite externe non ouverte de l'oreille.

Placez l'oreille sur un empilement de lames de verre et appliquez 0,5 microlitre de colle chirurgicale sur les bords dorsaux antérieur et postérieur afin de l'immobiliser pour une imagerie à court terme de deux heures ou moins. Ajoutez au-dessus de l'oreille immobilisée une solution tampon stérile fraîchement préparée de ringer au sorbate. Appliquez ensuite une lamelle. Utilisez ensuite un microscope stéréo à fluorescence équipé d'un objectif double pour imager l'oreille.

Pour l'imagerie à long terme. Placer l'extrémité d'une aiguille reliée à un réservoir contenant du ringer sorbate sous la lamelle, à environ 0,5 centimètre de l'oreille. Utiliser une pompe péristaltique à une vitesse de un microlitre par minute pour acheminer constamment le tampon vers la chambre.

Ouvrez le logiciel d'acquisition. Ajustez le gain, l'intensité de fluorescence, le grossissement et le temps de pose de l'image, plusieurs champs contenant des cellules tumorales, ainsi que des protéines de la matrice extracellulaire marquées, afin de réaliser un imagerie intravitale en microscopie à deux photons avec de la graisse de silicone. Commencez à la base de l'oreille.

Construire une paroi circulaire d'environ deux centimètres de diamètre et de deux à trois millimètres de hauteur autour de l'oreille. Remplir le cercle avec une solution de Ringer au sorbate. Placer la souris sur la platine, sur un tapis chauffant réglé à 37 degrés Celsius, et configurer les paramètres du microscope conformément au protocole écrit.

Comme le montre cette figure, de nombreuses structures peuvent être distinguées selon leur morphologie après immunomarquage. Pour les composants de la membrane basale tels que le collagène IV ou la proline, surtout les protéines structurales qui normalement ne peuvent pas être détectées par génération de seconde harmonique (SHG). La méthode classique de détection de la matrice peut être visualisée.

Par exemple, nous avons constaté que les tensines et la C sont déposées dans des emplacements différents du stroma tumoral ; les forces fibrillaires développées par les collagènes au sein du microenvironnement tumoral peuvent entraîner une expansion ou une contraction de la matrice tumorale, et par conséquent, un remodelage de la vascularisation tumorale similaire à celui observé lors de la cicatrisation. Ici, nous montrons que nous pouvons réaliser une microscopie dynamique à deux photons tout en imposant simultanément une immunomarquage de la matrice de tensines et de C, avec un photoblanchiment minimal des fluorochromes, même en microscopie à densité de photons élevée. Dans cette vidéo, des cellules tumorales préalablement déposées sur du derme exposé, prémarquées pour le collagène IV, adhèrent au tissu et commencent, en groupes, à migrer collectivement le long de la membrane basale des vaisseaux sanguins et des sites adipeux.

Une fois maîtrisée, la procédure complète d'ouverture de l'oreille et de coloration immuno-histochimique prend deux heures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une coloration immuno-histochimique intravitale pour étudier les interactions entre les cellules et la matrice dans les tumeurs, en utilisant une microscopie en épifluorescence ou une microscopie à deux photons.