À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

L’objectif général de cette procédure est d’effectuer une imagerie par immunofluorescence intra-vitale de l’oreille de souris porteuses d’un mélanome afin d’étudier la dynamique des composants matriciels du tissu tumoral. Ceci est accompli en inoculant d’abord une oreille de souris avec des cellules de mélanome GFP exprimant B 16 F 10. Ensuite, une intervention chirurgicale est pratiquée sur l’oreille de la souris afin de séparer la peau ventrale de la peau de l’oreille dorsale et d’exposer le tissu tumoral.

Ensuite, une immunocoloration est effectuée sur le tissu exposé de l’oreille dorsale. Enfin, l’animal est préparé pour l’imagerie intra-vitale. En fin de compte, la stéréomicroscopie fluorescente ou la microscopie multiphotonique est utilisée pour montrer la localisation et le comportement dynamique des cellules tumorales et de leurs composants matriciels.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes d’imagerie en direct est que nous pouvons imager les interactions dynamiques des cellules tumorales avec les cellules stromales associées telles que les cellules immunitaires, mais c’est dans le contexte de la matrice extracellulaire fibrillaire et maillée. Cette méthode peut donc vous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie tumorale, telles que la façon dont les cellules tumorales interagissent avec leur microenvironnement physique, ce qui peut à son tour fournir des informations importantes sur la progression des tumeurs. Une partie de la procédure sera démontrée par Vita Kki, un scientifique principal de notre laboratoire. Pour préparer les cellules tumorales à l’injection, commencez par cultiver des cellules de mélanome B 16 F 10 GFP.

Après avoir centrifugé les cellules, transférez-les dans un tube einor de 1,5 millilitre et essorez-les à nouveau, retirez tout surnageant à l’exception d’une fine couche de milieu qui reste juste au-dessus de la pastille, remettez les cellules en suspension dans une suspension cellulaire épaisse à côté de charger la boue cellulaire dans un volume de 10 microlitres. Seringue Hamilton. Retirez le capuchon de la pointe d’une aiguille de calibre 33 attachée et chargez 20 microlitres de boue sur le dessus de la chambre de pointe.

Tirez ensuite sur le piston jusqu’à ce que cinq microlitres de boue soient chargés à l’intérieur de la seringue. Après avoir anesthésié une souris C 57 black six avec une anesthésie injectable, rasez la tête de la souris, démêlez les poils de la tête et autour de l’oreille et rincez-la à l’eau. À l’aide de ruban adhésif, fixez le bord proximal de l’oreille sur le bout d’un index.

Insérez l’aiguille de la seringue Hamilton entre le derme dorsal et le cartilage de l’oreille d’une souris C 57 black six, en pénétrant l’oreille de la partie proximale à distale sur environ deux à trois millimètres. Injectez la suspension cellulaire et rétractez lentement l’aiguille de la peau. Laissez les cellules tumorales former une tumeur solide sur une période de sept à neuf jours, à l’aide d’un microscope à fluorescence pour suivre la croissance tumorale.

Après avoir utilisé un mélange d’oxygène humidifié et d’isofluor pour anesthésier la souris, placez la souris sur un coussin chauffant à 37 degrés Celsius et effectuez un léger pincement des orteils. Pour confirmer que l’animal est suffisamment anesthésié. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux et maintenez la souris sur un coussin chauffant contrôlé par thermistance rectale tout au long de la procédure.

Ensuite, placez doucement l’oreille porteuse de la tumeur sur une pile de lames de verre. Ensuite, utilisez de petites bandes de ruban adhésif pour fixer les bords antérieur et postérieur de l’oreille à la pile à l’aide d’un scalpel, coupez la peau ventrale de l’oreille le long de l’anti hélice du pavillon de la souris. Retirez les rubans de l’oreille à l’aide d’une pince à épiler incurvée.

Décollez doucement le derme ventral et le cartilage du derme dorsal. Utilisez le tampon de sonnerie pour laver l’oreille afin d’effectuer une coloration immunofluorescente. Appliquez des anticorps primaires ciblant les molécules de la matrice extracellulaire dans le tampon de blocage sur l’oreille exposée et placez une lamelle sur le dessus.

Incuber pendant 15 minutes avant d’utiliser environ cinq millilitres de tampon de sonnerie pour laver l’oreille deux fois. Appliquez les anticorps secondaires appropriés ou le streptocoque Aden dans un tampon de blocage. Appliquez une lamelle et incubez pendant 15 minutes avant de laver deux fois Comme précédemment, pliez la zone dermique ouverte dans le mencia conki EM et utilisez des lingettes stériles pour sécher le derme externe non ouvert de l’oreille.

Placez l’oreille sur une pile de lames de verre et appliquez 0,5 microlitre de colle chirurgicale sur les bords dorsaux antérieur et postérieur pour l’immobiliser pour une imagerie à court terme de deux heures ou moins. Ajouter un tampon stérile comme sorbate fraîchement préparé sur l’oreille immobilisée et appliquer un lamelle. Ensuite, utilisez un stéréomicroscope fluorescent avec deux lentilles pour imager l’oreille.

Pour l’imagerie à long terme. Placez la sortie d’une aiguille attachée à un réservoir contenant un sorbate sous le couvercle et glissez à environ 0,5 centimètre de l’oreille. Utilisez une pompe péristaltique à une vitesse d’un microlitre par minute pour fournir constamment le tampon à la chambre.

Ouvrez le logiciel d’acquisition. Ajustez le gain d’intensité de fluorescence, le grossissement et le temps d’exposition de l’image, plusieurs champs contenant des cellules tumorales, ainsi que des protéines de matrice extracellulaire colorées pour effectuer une imagerie intra vitale à l’aide de la microscopie multiphotonique avec de la graisse de silicium. En commençant à la base de l’oreille.

Construisez une paroi circulaire d’environ deux centimètres de diamètre et de deux à trois millimètres de hauteur autour de l’oreille. Remplissez le cercle avec une sonnerie de sorbate. Placez la souris sur la platine sur un coussin chauffant, réglé à 37 degrés Celsius et configurez les paramètres du microscope selon le protocole texte.

Comme le montre cette figure, de nombreuses structures peuvent être distinguées en fonction de leur morphologie après immuno-marquage. Pour les composants de la membrane basale tels que le collagène quatre ou le prolean, surtout les protéines structurelles qui ne peuvent normalement pas être détectées par SHG. La méthode classique de détection matricielle peut être visualisée.

Par exemple, nous avons constaté que les dizaines et C se déposent à différents endroits du stroma tumoral à partir des forces des collagènes fibrillaires qui se développent dans le microenvironnement tumoral peuvent conduire à l’expansion ou à la contraction de la matrice tumorale et, par conséquent, à un remodelage du système vasculaire tumoral similaire à la cicatrisation des plaies. Ici, nous montrons que nous pouvons effectuer une microscopie time-lapse à deux photons, tout en imageant simultanément des tenas immuno-marqués et une matrice C avec un photoblanchiment minimal des quatre fluorescents, même en microscopie à haute densité de photons. Dans cette vidéo, les cellules tumorales qui étaient superposées sur le derme exposé pré-coloré pour le collagène quatre ont adhéré au tissu et en groupes ont commencé à migrer collectivement le long de la membrane basale des vaisseaux sanguins et des sites adipeux.

Une fois maîtrisé, l’ensemble de la procédure d’ouverture de l’oreille et d’immunocoloration prend deux heures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une immunocoloration intravitale pour étudier les interactions de la matrice cellulaire dans les tumeurs à l’aide de l’épifluorescence ou de la microscopie à deux photons.