Thérapie à base de cellules pour l'insuffisance cardiaque chez le rat: Double thoracotomie pour infarctus du myocarde et épicardique implantation de cellules et Biomatrice

L'objectif de cette procédure est d'effectuer une double thoracotomie sur des rats afin de réaliser une ligature coronaire et une application épipéricardique. Cela est accompli en réalisant d'abord une thoracotomie au niveau de l'espace intercostal quatrième. Ensuite, l'artère coronaire descendante antérieure, ou LAD, est ligaturée.

Ensuite, une seconde thoracotomie est réalisée deux semaines plus tard au niveau de l'espace intercostal cinq. Enfin, les cellules et la matrice sont appliquées à la surface du cœur infarctus en battement. En définitive, une échocardiographie est effectuée pour évaluer la fonction cardiaque et une histologie est réalisée par mesure de la taille de l'infarctus.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la sternotomie, est qu'il s'agit d'une approche peu invasive. La démonstration de la procédure sera effectuée et ine Lopez enverra des collaborateurs de notre laboratoire. Tous les animaux ont été traités conformément aux recommandations de la F-E-L-A-S-A et à la loi suisse sur la protection des animaux. Après avoir saigné à blanc un rat, isolé et nettoyé les os fémoraux selon le protocole décrit, utilisez des ciseaux pour couper les deux extrémités des os.

Ensuite, pour rincer la moelle osseuse, injecter du PBS stérile dans la cavité médullaire de l'os et recueillir la moelle dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger la moelle osseuse recueillie pendant sept minutes à 300 ×g. Retirer le surnageant et ajouter trois millilitres de tampon d'hémolyse. Suspendre le culot, incuber la suspension pendant une minute à température ambiante, puis centrifuger à nouveau pendant sept minutes à 300 ×g après resuspension.

Suspendre le culot dans un milieu de culture stérile. Ajouter du milieu de culture cellulaire supplémentaire dans un flacon de culture de 150 millilitres et ensemencer les cellules le deuxième jour d'incubation. Changer le milieu pour éliminer les cellules non adhérentes et continuer à renouveler le milieu tous les deux jours pendant deux à trois semaines, jusqu'à l'obtention de la densité cellulaire souhaitée.

Pour réaliser la première thoracotomie T, commencez par peser le rat et configurez en conséquence les paramètres du ventilateur. Le débit expiratoire de la ventilation est défini automatiquement. Ensuite, rasez la partie gauche du thorax, allumez un tapis chauffant et réglez-le à 37 degrés Celsius.

Après avoir anesthésié le rat conformément au protocole décrit, effectuez une pression sur l’orteil ou la queue avant de placer le rat sur le tapis chauffant en position supine à l’aide d’un cathéter intraveineux de calibre 14, intubez l’animal, puis reliez le cathéter d’intubation à un ventilateur pour rongeur. Ce dernier doit être programmé pour délivrer 2,5 litres par minute d’oxygène, 2,5 % d’isoflurane, un volume courant de deux millilitres et une fréquence respiratoire de 90 cycles par minute. Après avoir préparé une seringue contenant de la buprénorphine à 0,1 milligramme par kilogramme à administrer par voie sous-cutanée, injectez un tiers de la solution, puis désinfectez la zone avec une solution de Bétadine à 1 %.

Ensuite, incisez la peau perpendiculairement au sternum au niveau de l'espace intercostal quatre et séparez les trois couches musculaires thoraciques. Puis ouvrez l'espace intercostal quatre entre les côtes quatre et cinq. Utilisez un petit rétracteur pour écarter les côtes et exposer le cœur.

Ensuite, ouvrez soigneusement le péricarde et repérez l'artère coronaire antérieure descendante ou LAD, puis utilisez un fil de suture 7,0 pour la ligaturer à quatre millimètres sous l'oreillette. Ensuite, contrôlez le changement de couleur de la zone ischémique à l’aide de trois fils de suture 0 positionnés de manière approximative et distale par rapport au sternum. Effectuez deux points destinés à fermer l’espace intercostal.

Serrer le point distal. Pincer le tube d'échappement du ventilateur pendant deux secondes afin de gonfler la poitrine et éviter un pneumothorax. Ensuite, serrer le deuxième point.

Replacer les couches musculaires en position. Ensuite, utiliser un fil 5-0 pour fermer la peau avec une solution de Bétadine à 1 %. Désinfecter la suture et injecter la solution de buprénorphine restante.

Éteignez le système d'anesthésie et retirez le cathéter d'intubation. Gardez le rat dans une cage sous une lampe chauffante pendant une à deux heures avant de le retourner dans une unité IVC. Deux semaines après la première thoracotomie, la cicatrisation est complète et la cicatrice est à peine visible.

Suivant la procédure décrite précédemment dans cette vidéo pour préparer le rat à la chirurgie, incisez la peau perpendiculairement au sternum au niveau de l'espace intercostal cinq. Séparez les trois couches musculaires et ouvrez l'espace intercostal cinq entre les côtes cinq et six. Utilisez un petit rétracteur pour écarter les côtes et exposer le cœur.

S'il y a une certaine adhérence, utilisez une pince fine pour la détacher délicatement. Ensuite, repérez la zone d'infarctus qui apparaît comme une zone pâle sous le ligature. Si nécessaire, insérez un morceau de suture de sept zéros de 10 centimètres à l'apex et tirez doucement dessus pour mieux visualiser le ventricule gauche.

Ensuite, appliquer les cellules et la matrice à la surface de la zone ischémique du cœur. Après centrifugation, déposer la palette de quatre fois dix puissance six cellules, comme indiqué dans le protocole écrit, sur le cœur avant d'appliquer un adhésif fibrineux pour la recouvrir. La couche de colle fixe les cellules à la surface du cœur.

Après avoir retiré le point de suture au niveau de la position apicale, réinsérer les couches musculaires par un point de suture et désinfecter l’animal. Comme illustré précédemment dans la vidéo, tel que montré ici. Après l’intervention chirurgicale, les animaux ont perdu du poids, puis récupéré rapidement avant de reprendre du poids indépendamment du traitement appliqué. Comme le montre ce graphique de Kaplan, le taux de survie est élevé après la première thoracotomie T ; les animaux traités avec du fibrine et/ou des cellules ont présenté des taux de survie plus faibles que les autres groupes, comme observé sur ce graphique.

Néanmoins, les taux de survie globaux sont restés élevés après une seconde thoracotomie. La fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie. Ces images représentatives en mode M provenant d'animaux sains et d'animaux infarctus illustrent que la contractilité de la paroi du VG est abolie deux semaines après la ligature de l'artère descendant antérieure. La fraction d'éjection a été enregistrée deux semaines après la ligature de l'AD, sur un total de 104 animaux.

La distribution de fréquence montre des méthodes raisonnablement reproductibles avec un coefficient de variation de 17 %. Cette figure illustre la représentation graphique de la fonction cardiaque par la fraction d'éjection mesurée deux et six semaines après la ligature de l'artère LAD. La fonction cardiaque continue de diminuer au cours de cette période. Le remodelage cardiaque se produit également durant cette période et est représenté ici par une augmentation des volumes du VG enregistrés en systole comme en diastole. Enfin, la coloration au trichrome a révélé que du tissu fibrotique, puis finalement une cicatrice transmurale, s'est développée six semaines après la ligature de l'artère LAD. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 40 minutes si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une double thoracotomie peu invasive.