MEILLEUR: Barcode Enabled séquençage de Tetrads

L'objectif général de cette procédure est de produire un grand nombre de descendants recombinants à partir d'un croisement de levure, tout en conservant l'information indiquant quels descendants proviennent du même tétrade d'origine. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, on transforme la souche diploïde hétérozygote destinée à être utilisée dans le croisement avec une bibliothèque de plasmides contenant un code-barres spécifique au tétrade et un rapporteur fluorescent spécifique à la sporulation. Deuxièmement, on transfère les cellules marquées avec le code-barres vers un milieu de sporulation.

Cela permet la formation de tétrades et induit l'expression du rapporteur fluorescent GFP dans les tétrades, mais pas dans les cellules qui ne parviennent pas à sporuler. Ensuite, un trieur FACS sépare les tétrades marquées de façon fluorescente des autres cellules et les dépose directement sur une boîte de gélose, où l'enveloppe externe des tétrades est digérée de manière enzymatique. La dernière étape consiste à utiliser des billes de verre pour séparer et répartir les spores des tétrades digérées à la surface de la boîte de gélose, permettant à chaque spore de former une colonie unique.

En fin de compte, les souches obtenues à l’aide de cette méthode seront génotypées à l’aide d’un protocole de séquençage d’ADN multiplexé à haut débit qui permettra de lire le code-barres tétra-spécifique de chaque souche. Les codes-barres sont ensuite utilisés pour identifier chacune des quatre souches issues d’un seul événement méiotique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la dissection manuelle de tétraèdres à sec à l’aide d’un micromanipulateur, est qu’un seul chercheur peut isoler plusieurs milliers de progénitures recombinantes en quelques heures seulement.

Les cellules de levure diploïdes utilisées dans cette étude ont été précédemment transformées avec une bibliothèque de plasmides portant des codes-barres comme décrit dans le manuscrit associé, et stockées à moins 80 degrés Celsius afin de revitaliser les cellules à partir des stocks congelés. Incubez-les pendant la nuit dans cinq millilitres de YPD additionné de 200 microgrammes par millilitre de G418 à 30 degrés Celsius sous agitation le jour suivant. Lavez les cellules issues des cultures de nuit trois fois dans du PBS, puis resuspendez-les dans un volume final de deux millilitres de milieu de sporulation, additionné de 200 microgrammes par millilitre.

G quatre 18 Agiter les cultures de sporulation à température ambiante. Surveiller l'évolution de la sporulation quotidiennement jusqu'à ce que la formation de nouvelles tétrades cesse. Généralement, cela prend entre deux et quatre jours une fois que les cultures contiennent des tétrades bien formées et relativement peu de dyades.

Retirer les cultures de l'agitation et les laisser à température ambiante pendant au moins sept jours avant la séparation des tétrades. L'aspect le plus difficile de cette procédure consiste à obtenir une bonne séparation des spores. Nous avons constaté empiriquement que laisser les cultures sporulées reposer à température ambiante sans agitation pendant au moins une semaine avant la séparation des tétrades améliore grandement la dissociation des spores.

Les tétrades provenant de la culture de sporulation peuvent être détectées et isolées par tri cellulaire activé par fluorescence ou par fax, car les plasmides codés à barres dans les cellules diploïdes portent également une protéine de fusion GFP spécifique à la sporulation. Le protocole décrit ici a été développé pour un fax aria deux. Pour commencer cette procédure, chargez la culture sporulée sur le trieur fax et définissez deux fenêtres de diffusion avant et de diffusion latérale afin d'exclure les débris, les cellules agrégées et les multiples cellules par gouttelette.

Il devrait y avoir une population de cellules fluorescentes, qui, lorsqu'on utilise le construit rapporteur PS deux GFP, comprend les dyades et les tétrades ; utiliser un histogramme de dispersion latérale (FSC) en fonction de la GFP afin d'inclure ces événements fluorescents. Selon l'arrière-plan génétique de la souche, il peut être nécessaire d'ajouter un tri supplémentaire pour éliminer les agrégats contenant des tétrades et d'autres cellules. Examiner un histogramme de la dispersion latérale (FSC) des événements fluorescents.

Dans cet exemple, les événements du pic de gauche correspondent principalement à des tétras, et les événements du pic de droite sont généralement des tétras avec un bourgeon attaché ; appliquez une dernière fenêtre qui inclut les événements présentant une FSC plus faible, majoritairement des tétras, indiqués par les barres rouges. Vérifiez l'efficacité du régime de fenêtrage en triant environ 1 500 tétras sur une lame de microscope et en déterminant la proportion de tétrades par rapport aux non-tétrades. À l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 400 fois, le pourcentage de tétrades peut être estimé avec précision en comptant seulement environ 200 événements triés, mais le tri d’environ 1 500 événements réduit le temps passé à rechercher les cellules sur la lame de microscope.

Ces images en champ clair utilisent un grossissement de 600 fois. Montrent des exemples de tétrades à gauche et de non-tétrades à droite après le tri selon les faits. Vérifiez périodiquement que le trieur indique correctement le nombre d'événements en triant 25 tétrades sur une lame de microscope et en examinant les cellules contenues dans la goutte à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 400 fois.

Il devrait y avoir 25 tétrades dans la goutte. Répétez l'opération trois ou quatre fois pour évaluer la variance de l'appareil de tri fax lors de cet essai. Préparez les boîtes de gélose pour cette procédure en réchauffant le nombre souhaité de boîtes YPD plus G quatre 18 pendant au moins 1,5 heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius placé près du trieur fax.

Une caractéristique essentielle du protocole de tri est la capacité de cibler avec précision les tétrades triées par fax vers un emplacement spécifique sur une plaque d'agar contenant un milieu de solution X. Pour ce faire, placez d'abord une plaque de repère de 96 puits sur l'unité automatisée de dépôt cellulaire du trieur. Préparez ensuite un schéma de tri permettant de trier 25 tétrades dans un seul puits d'une plaque de 96.

Un tri en format plaque avec 25 tétras par plaque donne des colonies bien séparées. Choisissez un puits proche du centre de la plaque. Par exemple, le puits D5.

Apportez une pile de 10 boîtes de gélose depuis l’incubateur à 37 degrés Celsius vers le trieur. Prenez une boîte de gélose et ajoutez 25 microlitres de solution zy sur la gélose, près du centre de la boîte. Ensuite, placez la boîte sur la plaque 96 puits de repère, en alignant la goutte X sur la cible.

Eh bien, cela a été choisi précédemment. Eh bien D cinq. Commencez le tri et déposez 25 tétras au centre de la goutte de zy sur la plaque d'agar.

Retirez et couvrez la plaque. Répétez le tri pour chaque plaque jusqu'à ce que 25 tétrades aient été triées dans des gouttes zamo sur chaque plaque de la pile. Replacez la pile de plaques contenant les tétrades dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Apportez le prochain lot de 10 plaques au trieuse et répétez la procédure de tri. Les spores peuvent être séparées après que les plaques contenant les tétrades aient été incubées à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Pour commencer cette procédure, ajoutez 15 à 25 billes de verre stériles de trois millimètres à chaque plaque, puis agitez les plaques en deux piles de cinq plaques pendant trois à cinq minutes.

La meilleure séparation des spores est obtenue en déplaçant rigoureusement les plaques de côté à côté ou de l'avant vers l'arrière. Ne pas déplacer les plaques de manière à faire tourbillonner les billes autour du bord extérieur de la plaque. Laisser les billes sur les plaques une fois terminé.

Placer la pile de plaques avec les billes face vers le haut dans une étuve à 30 degrés Celsius. Retirer la pile suivante de plaques de l’étuve à 37 degrés Celsius et répéter la procédure de séparation des spores à l’aide des billes. Incuber toutes les plaques toute la nuit à 30 degrés Celsius le jour suivant la séparation des spores.

Retirez soigneusement les boîtes de l'incubateur à 30 degrés Celsius sans déranger les billes de verre. De petites colonies devraient s'être formées sur les boîtes. Retirez les billes de verre en retournant délicatement et rapidement les boîtes au-dessus d'un récipient profond.

Tapoter le fond de la plaque alors qu'elle est inversée peut aider à déloger les billes collées à la plaque. Les récipients doivent être suffisamment profonds pour récupérer les billes sans permettre qu'elles rebondissent et heurtent la plaque d'agar. Comptez le nombre de colonies sur chaque plaque et utilisez ce nombre pour estimer l'efficacité de la séparation et de la récupération des spores.

Par exemple, 25 tétrades par boîte pour un croisement présentant une viabilité proche de 100 % pourraient produire un total de 100 colonies par boîte à partir de boîtes contenant un nombre suffisant de colonies, comme plus de 65 pour une forte viabilité. Transférez les cellules de chaque colonie dans un puits distinct d'une plaque 96 puits contenant du milieu liquide YPD additionné de G418. Notez également quels puits contiennent des colonies provenant de la même boîte d'agar.

Ces informations seront utilisées ultérieurement pour faciliter l'assignation des tétrades. Le logiciel Software best peut grandement accélérer l'isolement des spores provenant des tétrades. Bien que la version actuelle de la méthode présente une certaine perte d'efficacité par rapport à la dissection manuelle, la distribution binomiale a été utilisée pour calculer la fraction attendue de tétrades produisant au moins une spore récupérée avec succès, donnant lieu à 1, 2, 3 ou quatre colonies, en fonction de la proportion de toutes les spores récupérées avec succès.

Ce graphique peut servir de guide approximatif pour le nombre de souches qui seront finalement assemblées en tétrades de trois ou quatre spores, comme observé ici. Le nombre de tétrades complètes récupérées augmente avec le nombre de colonies par boîte dans cette étude. 25 rads provenant de croisements avec une viabilité des spores proche de 100 %, déterminée par dissection manuelle, ont été ensemencés sur 149 boîtes d'agar.

Le nombre maximal de colonies observées par boîte était de 80, indiquant que 20 spores n'ont pas réussi à former des colonies distinctes. Le nombre moyen de colonies par boîte était de 62. À partir de 61 boîtes contenant 65 colonies ou plus, 4 354 colonies ont été récoltées et séquencées. Parmi les 3 700 souches ayant passé le contrôle qualité du séquençage, 2 665, soit 72 %, ont pu être attribuées par calcul à trois ou quatre tétrades de spores une fois maîtrisées.

Cette technique peut être utilisée pour traiter plus d'un millier de tétrades par heure. Toutefois, pour des interventions dépassant trois heures, une aide sera nécessaire.