Name: MEILLEUR: Barcode Enabled séquençage de Tetrads (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Découvrez la méthode BEST pour isoler et analyser des tétrades de levure par cytométrie en flux. Cette technique automatise la génération de progéniture recombinante tout en conservant l'information de lignée génétique.

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Ce travail a été soutenu par une bourse NIH / NHGRI Génome Scholar / Faculté de transition (K22 HG002908) pour AMD et un partenariat stratégique entre l&#39;Institute for Systems Biology et l&#39;Université du Luxembourg. Les souches ou des plasmides doivent être adressées à Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Construction de souches et caractérisation <ol><li> Construire la souche diploïde hétérozygote pour être utilisé dans le centre de l&#39;accouplement et la sélection de souches haploïdes ou diploïdes 2 hétérozygote en utilisant une souche d&#39;origine naturelle. Les souches ne doivent pas abriter GFP. </li><li> Confirmer que la souche est incapable de croître sur milieu YPD 2 + 200 ug / ml de G418. </li><li> Assurez-vous que la souche est capable de produire des spores. BEST est compatible avec de faibles croix d&#39;efficacité de sporulation, mais basses fréquences de sporulation augmente FACS temps de tri nécessaire. <ol><li> Mettre en place une culture O / N de la souche dans 5 ml de YPD et croître avec agitation à 30 ° C. </li><li> Laver 0,5 ml de la culture O / N, trois fois avec du PBS (pH 7,4). </li><li> Pellet les cellules lavées, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de milieu de sporulation 7. </li><li> Agiter les cellules à température ambiante et vérifier quotidiennement pour la formation des tétrades l&#39;aide d&#39;un microscope contraste de lumière de phase avec un objectif 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Estimer la viabilité des spores de la croix par la dissection classique 2,3 d&#39;un petit nombre (~ 20) de tétrades. La viabilité des spores dans les croisements entre différents milieux de contrainte varie considérablement et de façon imprévisible. Cependant, les attentes a priori de la viabilité des spores peuvent être utilisés pour évaluer l&#39;efficacité d&#39;un meilleur expérience avant les-travail et coûteuses étapes de l&#39;épargne et le génotypage des souches. Par conséquent, cette étape est fortement recommandé. </li></ol> 2. Transformation de diploïdes avec la Bibliothèque de code-barres plasmides <ol><li> Insérez le plasmide code-barres pCL2_BC dans la souche diploïde hétérozygote en utilisant le protocole de transformation décrit dans Gietz et Woods 8 avec les modifications suivantes. <ol><li> Après que les cellules ont été incubées avec le mélange de transformation à 30 ° C pendant 20 min, ajouter du DMSO à 8% du volume du mélange de transformation. L&#39;addition de DMSO a été trouvée pour améliorer l&#39;efficacité de transformation in certains milieux de contrainte 9. </li><li> Après l&#39;étape de choc thermique, un culot cellulaire par une brève centrifugation, décanter le mélange de transformation, et laver les cellules doucement dans YPD. Ensuite, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de YPD et leur permettre de se remettre à température ambiante pendant 3 heures sans agitation. </li></ol></li><li> Sélectionner les transformants par étalement sur milieu YPD + G418 (200 ug / ml) des plaques de gélose. Pour assurer une piscine complexe de codes à barres de plasmide, récolter un grand nombre de colonies, par exemple les 5 plaques avec ~ 2500 colonies par plaque. </li><li> Une fois les colonies sont visibles (2-3 jours de croissance à 30 ° C), mutualiser les transformants en les frottant délicatement de la plaque dans le liquide YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% de glycérol. Vortex cette suspension cellulaire, transfert à un flacon de cryoconservation, et congeler à -80 ° C. Faire un stock congelé pour chaque plaque. Ces stocks congelés servent de souches de départ pour l&#39;étape 3.1 et peuvent également être utilisés pour générer plusieurs tétrades à une date ultérieure, si on le souhaite. </li&gt; </ol> 3. Sporulation la bibliothèque de cellules transformées, pour obtenir à code-barres Tetrads <ol><li> Ranimer les cellules à partir des stocks congelés créés en 2,3 par O / N croissance dans 5 ml de YPD + G418 (200 ug / ml) à 30 ° C avec agitation. </li><li> Laver les cellules de l&#39;O / N cultures 3x dans du PBS (pH 7,4), puis remettre en suspension les cellules dans du milieu de sporulation 7 plus 200 ug / ml de G418. </li><li> Agiter cultures de sporulation à la température ambiante et de suivre les progrès de la sporulation tous les jours jusqu&#39;à de nouvelles tétrades ont cessé de se former. </li><li> Une fois que la culture contient tétrades bien formés et relativement peu de dyades, retirez les cultures de l&#39;agitation et laisser à température ambiante pendant au moins 7 jours. Alors que certains croisements peuvent se prêter à la digestion de la plaque et de la perturbation dès tétrades ont formé (évaluée comme décrit au paragraphe 7.3), l&#39;incubation supplémentaire (7-10 jours dans nos expériences) est essentiel pour d&#39;autres croisements. Par conséquent, cette étape est fortement recommandé. </li></ol> 4. ÉtablirPortes FACS pour Tetrad Tri La méiose exprimé SPS2-GFP fusion sur le plasmide pCL2_BC tétrades permet à la culture de sporulation à être détectés et isolés à partir de la culture par fluorescence. Le protocole suivant a été mis au point pour une FACSAria II. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. FACS portes. Une série de quatre portes successives est utilisée pour isoler les tétrades. Les portes indiquées en (A) et (B) permettent de réduire le nombre de bouquets. Événements fluorescents sont sélectionnés avec la grille en (C). L&#39;histogramme de la (D) présente deux pics. Événements dans la pointe gauche sont principalement tétrades (image en médaillon à gauche), et les événements dans la bonne pointe sont généralement tétrades avec un bourgeon jointe (image en médaillon à droite). Une dernière porte estappliqué à cet histogramme pour sélectionner des événements qui sont pour la plupart tétrades (barres rouges). Ce chiffre a été modifié de Ludlow, et al 1. <ol><li> Chargez la culture sporulée sur un trieur FACS et mis en place deux dispersion et diffusion latérale des portes à terme pour exclure les débris, les cellules agglomérées, et plusieurs cellules par goutte (Figures 2A et 2B). </li><li> Il devrait y avoir une population de cellules fluorescentes, qui lors de l&#39;utilisation de la construction rapporteur SPS2-GFP incluent les dyades et tétrades 10. Porte la GFP vs FSC pour inclure ces événements fluorescents (figure 2C). </li><li> Selon la souche de fond, il peut être nécessaire d&#39;inclure une porte supplémentaire pour éliminer les agrégats qui comprennent des tétrades et d&#39;autres cellules. Si cela est nécessaire, inspecter un histogramme FSC des événements fluorescents et spécifier une porte qui inclut les événements avec FSC inférieure (figure 2D, les événements sont bloquées en rouge). </li><li> Contrôler l&#39;efficacité de t<html> il gating régime de tri ~ 1500 tétrades sur une lame de microscope et compter le nombre des tétrades pour les non-tétrades l&#39;aide d&#39;un microscope à contraste de phase à un grossissement de 400X. Le pour cent de tétrades peut être estimé avec précision en comptant seulement ~ 200 événements triés, mais le tri ~ 1500 réduit la quantité de temps passé à la recherche de cellules sur la lame de microscope. Sinon, le rapport de tétrades à des non-tétrades peut être évaluée lors de l&#39;étape 4.5. </li><li> Vérifiez régulièrement que la trieuse rapporte avec précision le nombre d&#39;événements par tri 25 tétrades sur une lame de microscope et d&#39;examiner les cellules contenues dans la goutte à l&#39;aide d&#39;un microscope à contraste de phase à un grossissement de 400X. Il devrait y avoir 25 tétrades dans la gouttelette. Répétez 3-4x pour évaluer la variance de l&#39;instrument FACS. </li></ol> 5. Tri Tetrads sur une plaque Agar p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 3. Mise en place de la plaque de gélose sur le trieur FACS. Pour trier tétrades dans une petite goutte de la solution de zymolyase placé au milieu d&#39;une norme (circulaire) de plaque de gélose, un standard (100 mm rectangulaire) plaque de 96 puits est le premier placée sur la scène du trieur de cellules et la trieuse est programmé pour déposer tétrades dans un puits particulier (dans ce cas, D5). Ensuite, la plaque circulaire de la gélose est placée sur le dessus de la plaque à 96 puits et aligné de sorte que la goutte de zymolyase est centré sur le puits spécifiée. <ol><li> Chauffer le nombre souhaité de YPD + G418 (200 ug / ml) des plaques pendant au moins 1,5 heure dans un incubateur à 37 ° C positionné près du trieur FACS. </li><li> Une caractéristique clé du protocole de tri est la capacité de cibler avec précision triées par FACS tétrades à un emplacement spécifique sur une plaque de gélose qui contient un pool de solution de zymolyase. Pour ce faire, placez un &quot;point de repère&quot; plaque de 96 puits sur til automatisé unité de dépôt de cellules (ACDU) de la trieuse. Préparer une présentation de sorte que pour trier 25 tétrades dans un puits d&#39;un format de 96 puits. Choisissez un puits près du milieu de la plaque, par exemple, bien D5. Figure 3 montre une boîte de Pétri et plaque de 96 puits chargé sur un trieur de cellules. Tri 25 tétrades par plaque donne colonies bien séparées. </li><li> Amener une pile de 10 plaques d&#39;agar de l&#39;incubateur à 37 ° C à la trieuse. </li><li> Prendre une plaque d&#39;agar-agar et la pipette 25 ul de solution de zymolyase (1 mg / ml dans 0,7 M de sorbitol) sur la gélose à proximité du centre de la plaque. Ensuite, placez la plaque sur le monument plaque de 96 puits, en alignant la gouttelette d&#39;zymolyase sur la cible et de l&#39;étape 5.2, par exemple, bien D5. </li><li> Lancer le tri et de déposer 25 tétrades dans le milieu de la goutte d&#39;zymolyase sur la plaque de gélose. Ensuite, retirez et recouvrir la plaque. </li><li> Répétez les étapes 5.4 et 5.5 jusqu&#39;à 25 tétrades ont été triés en gouttelettes zymolyase sur chaque plaque de la pile. </li&gt; <li> Retournez la pile de plaques contenant tétrade à 37 ° C incubateur. </li><li> Répétez les étapes 5.3 à 5.7 jusqu&#39;à ce que toutes les plaques ont tétrades. </li></ol> 6. Séparation spores <ol><li> Incuber chaque pile de plaques de gélose contenant tétrades-à 37 ° C pendant 1,5 h. </li><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur, ajouter 15-25 perles de verre stérile de 3 mm par plaque, et serrer les plaques comme une pile (ou deux piles de 5 unités) pour 3-5 min. La meilleure séparation des spores est obtenue en déplaçant les plaques de façon rigide d&#39;un côté à l&#39;autre ou de l&#39;avant vers l&#39;arrière. Ne pas déplacer les plaques tels que les perles &quot;remous&quot; autour du bord extérieur de la plaque. Laissez les perles sur les plaques lorsque vous avez terminé. </li><li> Placez la pile de plaques avec des perles face vers le haut dans un incubateur à 30 ° C. Récupérer les prochaines plaques de cheminées de l&#39;incubateur à 37 ° C, et répétez l&#39;étape 6.2. </li><li> Incuber les plaques O / N à 30 ° C. </li></ol> 7. Récolte colonies <ol><li> Aprèsune incubation O / N à 30 ° C, de petites colonies doivent se sont formés sur les plaques. Retirez délicatement les plaques de l&#39;incubateur sans perturber les billes de verre. </li><li> Retirer les perles de verre par soigneusement et rapidement inverser les plaques sur un récipient profond. Le récipient doit être assez profond pour attraper les perles sans leur permettre de rebondir et frapper la plaque de gélose. Tapant sur le fond de la plaque pendant qu&#39;elle est inversée peut aider à déloger les perles qui sont collées à la plaque. Ces perles peuvent être réutilisés par un lavage soigneux avec du savon, bien rincer avec de l&#39;eau déminéralisée et la stérilisation par autoclave. </li><li> Compter le nombre de colonies sur chaque plaque et d&#39;utiliser le nombre de colonies d&#39;estimer l&#39;efficacité de la séparation des spores et la récupération. Par exemple, 25 tétrades par plaque pour une croix avec près de 100% de viabilité pourraient donner un total de 100 colonies par plaque. </li><li> À partir de plaques avec un nombre suffisant de colonies (&gt; 65 pour une haute viabilité croix), les cellules de transfert de chaque colony dans un puits séparé d&#39;une plaque à 96 puits contenant un liquide YPD + G418. En outre, notez que les puits contiennent des colonies de la même plaque de gélose; cette information sera utilisée pour aider le logiciel d&#39;attribution de tétrade. </li><li> Utilisez les puits des plaques de 96 liquide pour ensemencer des cultures pour le génotypage et pour économiser souches que les stocks de glycérol congelés. Détails sur le séquençage RAD-tag et analyse de la séquence peuvent être trouvés dans Ludlow et al 1. </li></ol>

<ol><li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+tetrad+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li>
<li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRose%2C+M+%22Methods+in+Yeast+Genetics+A+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1990).</li>
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<li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li>
<li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+gene+conversion%3A+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

De nombreux domaines de la recherche en génétique, allant de la cartographie caractère complexe 11 à l&#39;étude des mécanismes sous-jacents recombinaison de l&#39;ADN 12, nécessitent un très grand nombre de descendants et des volumes élevés de séquençage de l&#39;ADN. Les techniques qui épousent la puissance d&#39;approches conventionnelles dont la capacité de séquençage d&#39;ADN à haut débit ont le potentiel pour permettre à des études qui étaient auparavant insoluble. Bien que plusieurs haut-débit génétique de levure méthodes ont été appliquées de manière efficace à des problèmes spécifiques, chacun a des limites qui sont loin de la large applicabilité de l&#39;analyse de tétrade classique. Les meilleures adresses à ces défis en adoptant une approche à haut débit combinant tétrade dissection et génotypage de la descendance de croisements de levure. En collaboration avec multiplexé RAD-tag séquençage, le BEST offre un moyen peu coûteux de glaner des informations de génotype pour chaque souche de descendance tout en préservant les relations tétrade au moyen de codes à barres tétrade uniques.0; De tous actuellement utilisé méthodes à haut débit, le BEST récapitule plus étroitement les informations fournies par un centre de levure disséqué manuellement. Best a deux caractéristiques principales. Le premier est l&#39;utilisation de FACS pour isoler rapidement tétrades distance à partir de cellules non sporulés dans la culture (Protocole étapes 5-6). La capacité d&#39;isoler des milliers d&#39;événements fluorescents (de tétrades) donne le meilleur son plus grand gain en débit. Cette automatisation permet un avantage encore plus grand sur la dissection manuelle pour les croisements avec la faible efficacité de la sporulation, en raison de l&#39;augmentation du temps nécessaire pour identifier visuellement des événements rares. Le deuxième élément clé est l&#39;utilisation d&#39;un code-barres moléculaire très complexe (protocole de l&#39;étape 2) qui est transmis à chaque spore de sœur d&#39;une tétrade. Parce que ces codes à barres peuvent être utilisées pour des calculs reconstruire les relations entre les tétrades spores qui ont été distribuées de façon aléatoire à travers une plaque de gélose, de la nécessité de main cellules de tableau dans une grille ordonnée est atténué. Enfin,parce que le code à barres moléculaire et le gène rapporteur GFP-spécifique de la sporulation sont physiquement liés (sur le même plasmide), seuls les tétrades qui ont conservé le code à barres moléculaire sont sélectionnées par tri FACS. Il existe deux considérations qui régissent la durée pendant laquelle les cultures doivent être incubées dans le milieu de sporulation. D&#39;abord, parce que le rapporteur spécifique de la sporulation (SPS2-GFP) est exprimé au début de la méiose, la GFP seule ne fait pas de distinction complets tétrades 4 spores de cellules qui n&#39;ont pas terminé la méiose (c. dyades). Bien FACS supplémentaire déclenchement peut diminuer le nombre de fluorescents, tétrades incomplètes, la meilleure façon de réduire ces événements indésirables est tout simplement suivi la culture de sporulation (étape 3.3) et de procéder une fois de nouvelles tétrades ont cessé de se former. Dans nos expériences, la fréquence des dyades trié est inférieure à 1%. Deuxièmement, pour certains croisements temps supplémentaire passé dans un milieu de sporulation à la température ambiante sans agitation (étape 3.4) significantly améliore la séparation des tétrades par les perles de verre pendant le placage ((Protocole de l&#39;étape 6). En fait, cette étape est absolument nécessaire pour la rupture de certains des croisements. Comme toutes les méthodes à haut débit, le mieux est &quot;bruyants&quot; que l&#39;approche conventionnelle correspondant. La réduction modeste de l&#39;efficacité de meilleur par rapport à la dissection de tétrade classique pourrait résulter d&#39;une combinaison de plusieurs facteurs. Un facteur est la perte accrue de spores viables par ailleurs, ce qui pourrait résulter de l&#39;adhérence à des perles de verre lors de l&#39;épandage ou une augmentation de la mort des spores en raison des contraintes mécaniques du processus. Un deuxième facteur pourrait être la perte de plasmide simple, lors de la méiose. Un troisième facteur pourrait être une diminution effective de colonies utilisables résultant de colonies de génotypes mixtes, environ ~ 5% des colonies dans notre pilote traverse 1. Il est probable que ces colonies représentent échecs de soeur spore séparation. Parce que le fluor rapideescence tri et la séparation des spores permettre la collecte d&#39;énormes nombre de tétrades, BEST est bien équipé pour surmonter diminue l&#39;efficacité de cette ampleur. Alors que les versions futures de MEILLEUR pourraient accroître l&#39;efficacité proche de celle de dissection manuelle, il est peut-être plus probable que la trajectoire exponentielle actuelle de la capacité de séquençage de l&#39;ADN sera rapidement compenser ce niveau de perte utilisable de souche. Quoiqu&#39;il en soit, la capacité d&#39;effectuer une analyse tétrade sur l&#39;échelle à laquelle MEILLEUR peut être appliqué permettra études qui sont actuellement irréalisable par des méthodes manuelles.

La cartographie des gènes de la méiose, communément connu comme l&#39;analyse de tétrades, est au centre de génétique de la levure. En bref, deux souches haploïdes, contenant chacune un seul exemplaire de chaque chromosome, sont accouplés pour former une souche diploïde hétérozygote avec deux copies de chaque chromosome, un de chaque parent. Starving cellules diploïdes pour l&#39;azote induit la méiose (sporulation) dans laquelle les chromosomes en double, subissent un réarrangement, et se divisent en quatre cellules haploïdes (spores ou ségrégeants) avec de nouvelles combinaisons d&#39;allèles de chaque parent. Les quatre spores résultant d&#39;une seule méiose peuvent être isolées par un procédé manuel intitulé dissection tétrade. Classique tétrade dissection 2,3 qui a relativement peu changé depuis la publication originale en 1937 4, a trois objectifs. Tout d&#39;abord, les cellules qui ont subi une méiose (tétrades) doivent être isolés à partir d&#39;un fond de cellules végétatives. Dans une analyse classique, ceci est réalisé par un chercheur qui, à l&#39;aideun microscope, identifie visuellement tétrades sur une plaque de gélose et emploie un appareil de micromanipulateur identifier visuellement tétrades sur une plaque de gélose et l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur pour déplacer la tétrade sur une zone de libre-cellulaire de la plaque. Ensuite, les quatre spores dans la tétrade doivent être séparés physiquement pour empêcher Interspore accouplement. Spores dans une tétrade sont maintenues ensemble par les deux un asque, le reste de la paroi cellulaire de la cellule diploïde d&#39;origine, et un ensemble de ponts Interspore 5. Dans l&#39;analyse de la tétrade classique asque est éliminé par digestion enzymatique, et un chercheur utilise le micromanipulateur de rompre les ponts Interspore et démêler les spores. Enfin, les spores individuelles sont disposées selon un motif quadrillé qui maintient la relation entre les spores, c&#39;est à dire toute la descendance dans une rangée de quatre spores sont sœurs de la même tétrade originale. Un chercheur de levure expérimenté peut compléter le processus de dissection 10 tétrades (un nombre minimum généralement reconnuspar croix) dans environ 15 min. Nous avons développé une nouvelle méthode tétrade génotypage à haut débit, que nous appelons B arcode E nabled S equencing de T etrads (BEST) 1. MEILLEUR élargit les méthodes actuelles de la génétique à haut débit en permettant la génération et le génotypage d&#39;un grand nombre de descendants qui sont isolés, génotypés et entretenus comme des individus d&#39;une manière qui permet aux sœurs relations de spores de quatre produits de la méiose à récupérer. Ceci est accompli en utilisant trois stratégies principales (figure 1). La première est l&#39;introduction d&#39;une construction de rapporteur qui marque les cellules qui ont subi une méiose avec la GFP et leur permet d&#39;être isolés par des cellules activées par fluorescence (FACS). La deuxième est l&#39;incorporation d&#39;un code à barres de l&#39;ADN hautement complexe (une chaîne de 15 nucleotides aléatoires) sous une forme qui est transmis à l&#39;ensemble des quatre spores d&#39;une tétrade et peut être lu par le séquençage de l&#39;ADN recombinant de la Progeny et ainsi identifie spores sœurs de la même tétrade. Troisièmement, il ya l&#39;étape de génotypage et le meilleur est compatible avec de nombreuses plates-formes de génotypage qui captent à la fois un ensemble de marqueurs génomiques ainsi que le code-barres spécifique tétrade. Nous utilisons une séquence de restriction associée au site de l&#39;ADN tag (RAD-seq) 6 Procédé qui dirige le séquençage du génome de sites de restriction spécifiques 1, capturant ainsi une cohérence 2-3% du génome des souches de la descendance ainsi que le code à barres de diffusion plasmidique . La récupération de relations de tétrades ainsi que les données de génotypage empiriquement dérivées d&#39;un croisement permet l&#39;inférence précise des informations manquantes, y compris l&#39;état de marqueurs à faible couverture et la séquence complète du génotype des individus non viables (et donc non récupérable). Ici, nous décrivons l&#39;application de la méthode dans le micro-organisme le plus couramment utilisé pour la cartographie de la méiose, la levure S. cerevisiae. Cependant, avec des substitutions mineures de rea spécifique-organismemessieurs, par exemple différentes protéines spécifiques sporulation fusionnés à la GFP, la méthode doivent être facilement transférables à d&#39;autres micro-organismes, y compris les organismes dans lesquels la cartographie de la méiose est beaucoup plus de main-d&#39;œuvre ou actuellement intraitable. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figure 1. MEILLEUR procédé (A). PCL2_BC Le plasmide est un plasmide de 2 microns avec une fusion GFP-spécifique de la sporulation, la résistance au G418, et un code à barres 15-mère aléatoire. Construction de la banque de plasmides est décrite dans une Ludlow et al. (B) Un pool de plasmides à code-barres est transformé dans la souche diploïde à partir d&#39;une croix. (C) Les transformants sont ensuite cultivées sur la sélection et ~ 10 000 colonies transformées sont mises en commun et sporulés. Au cours de la méiose chaque spore d&#39;une tétrade hérite d&#39;une coopérationpy du plasmide code-barres. (D) Tetrads sont séparées des cellules non sporulés par FACS et recueillies sur des plaques de gélose, où ils sont digérés et perturbé pour permettre à chaque spore pour former une colonie. (E) Les colonies sont ensuite ramassés dans des plaques à 96 puits, phénotypées, et génotypés. Au cours de génotypage du code à barres de plasmide est lu et utilisé pour identifier les quatre membres de chaque tétrade. Ce chiffre a été modifié de Ludlow et al 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>FACSAria II (Unité de commande spéciale)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>D’autres trieurs de cellules devraient travailler pour cette procédure. Les facteurs clés sont : (1) un système laser/détection pour le rapporteur fluorescent utilisé (laser 488 nm pour exciter l’EGFP dans notre cas), (2) la capacité de trier des événements uniques, (3) la possibilité de trier sur des lames de microscope pour évaluer la qualité du tri et (4) la possibilité de trier sur des boîtes de Pétri</td></tr><tr><td>Unité de dépôt cellulaire automatisée (pour FACSAria II)</td><td>BD Biosciences</td><td>643155 (si acheté séparément de l’instrument FACSAria)</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Biobusiness</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html scientifique</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

meilleur: barcode enabled séquençage de tetrads

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Analyse Tetrad est un outil précieux pour la génétique de levure, mais la nature manuel laborieux du processus a entravé son application à grande échelle. Barcode Enabled séquençage de Tetrads (BEST) 1 remplace les processus manuels d&#39;isolement, de perturber et d&#39;espacement tétrades. MEILLEUR isolats tétrades en vertu d&#39;une protéine fusion GFP-sporulation spécifique qui permet le tri cellulaire activé par fluorescence de tétrades directement sur des plaques d&#39;agar-agar, où l&#39;asque est une digestion enzymatique et les spores sont perturbés et disposés de façon aléatoire par des billes de verre de placage. Les colonies haploïdes sont ensuite affectés relations de spores sœurs, c&#39;est à dire des informations sur les spores provenaient de la même tétrade, en utilisant des codes-barres moléculaires lus lors de génotypage. En éliminant le goulot d&#39;étranglement de la dissection manuelle, des centaines voire des milliers de tétrades peuvent être isolés en quelques minutes. Nous présentons ici une description détaillée des procédures expérimentales nécessaires pour effectuer MEILLEUR dans la levureSaccharomyces cerevisiae, à partir d&#39;une souche diploïde hétérozygote l&#39;isolement des colonies dérivées de la descendance haploïde méiotique.

MEILLEUR peut grandement améliorer la rapidité avec laquelle les spores de tétrades peuvent être isolés. A titre d&#39;exemple le débit de cette méthode peut fournir, un chercheur a effectué les FACS tri et la séparation des spores (étapes 5.1 à 6.3) avec 149 plaques de gélose en 3 h 1. Un rendement équivalent (environ 3725 des tétrades) exigerait plus de 90 heures de dissection manuelle. Cependant, comme avec beaucoup de méthodes à haut débit, l&#39;itération courante de la méthode a une certaine perte d&#39;efficacité par rapport à la dissection manuelle. Cette perte se manifeste par une réduction du nombre de colonies récupéré par rapport à l&#39;attente calculé sur la base de la viabilité des spores de la croix, déterminé par dissection manuelle (étape 1.4). En supposant que les causes de la perte de spores (de discussion) affectent spores au hasard, les estimations peuvent être faites de combien de colonies récupérées seront membres de tétrades dans lequel 1, 2, 3, ou 4 spores ont été récupérés (figure 4). Figure 4. Simulation de la méthode d&#39;efficacité au niveau de la tétrade. D&#39;échec pour réussir à récupérer des spores (comme des colonies) peut être due à des spores non-viabilité, l&#39;adhésion des spores aux perles de verre, non-séparation des spores d&#39;un autre, etc La distribution binomiale a été utilisé pour calculer la fraction prévue de tétrades (avec au moins une spore récupéré avec succès) produisant quatre, trois, deux ou une des colonies sur la base de la proportion de toutes les spores récupérées avec succès. Ce graphique peut servir de guide approximatif pour le nombre de souches qui seront finalement assemblés en 3 - ou 4 - tétrades de spores. Comme le nombre de colonies par plaque augmente, plus le nombre de tétrades complètes récupérées. Dans l&#39;expérience décrite ci-dessus, 25 tétrades d&#39;une croix avec la viabilité des spores de près de 100% (comme dethermine par dissection manuelle) 1 ont été étalées sur 149 plaques de gélose. Dans cette expérience, le nombre maximal de colonies observées par plaque était de 80, ce qui indique que 20 spores n&#39;ont pas réussi à former des colonies discrètes. Le nombre moyen de colonies par plaque était de 62. Colonies des plaques 61 contenant 65 colonies ou plus ont été récoltés et séquencés. Parmi les souches 3700 qui ont passé le contrôle de qualité de séquençage, de 72% pourrait être affecté par calcul en 3 - ou 4 - tétrades de spores.

Barcode Enabled séquençage de Tetrads (BEST) remplace les processus manuels d&#39;isolement, de perturber et d&#39;espacement tétrades. MEILLEUR isolats tétrades par cellule activé par fluorescence de tri sur les plaques d&#39;agar-agar, sépare les spores par agitation avec des billes de verre, et qui détermine les colonies disposés de manière aléatoire ont été dérivées à partir de la même origine tétrade utilisant des codes à barres moléculaires.

MEILLEUR: Barcode Enabled séquençage de Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

L'objectif général de cette procédure est de produire un grand nombre de descendants recombinants à partir d'un croisement de levure, tout en conservant l'information indiquant quels descendants proviennent du même tétrade d'origine. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, on transforme la souche diploïde hétérozygote destinée à être utilisée dans le croisement avec une bibliothèque de plasmides contenant un code-barres spécifique au tétrade et un rapporteur fluorescent spécifique à la sporulation. Deuxièmement, on transfère les cellules marquées avec le code-barres vers un milieu de sporulation.Cela permet la formation de tétrades et induit l'expression du rapporteur fluorescent GFP dans les tétrades, mais pas dans les cellules qui ne parviennent pas à sporuler. Ensuite, un trieur FACS sépare les tétrades marquées de façon fluorescente des autres cellules et les dépose directement sur une boîte de gélose, où l'enveloppe externe des tétrades est digérée de manière enzymatique. La dernière étape consiste à utiliser des billes de verre pour séparer et répartir les spores des tétrades digérées à la surface de la boîte de gélose, permettant à chaque spore de former une colonie unique.En fin de compte, les souches obtenues à l’aide de cette méthode seront génotypées à l’aide d’un protocole de séquençage d’ADN multiplexé à haut débit qui permettra de lire le code-barres tétra-spécifique de chaque souche. Les codes-barres sont ensuite utilisés pour identifier chacune des quatre souches issues d’un seul événement méiotique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la dissection manuelle de tétraèdres à sec à l’aide d’un micromanipulateur, est qu’un seul chercheur peut isoler plusieurs milliers de progénitures recombinantes en quelques heures seulement.Les cellules de levure diploïdes utilisées dans cette étude ont été précédemment transformées avec une bibliothèque de plasmides portant des codes-barres comme décrit dans le manuscrit associé, et stockées à moins 80 degrés Celsius afin de revitaliser les cellules à partir des stocks congelés. Incubez-les pendant la nuit dans cinq millilitres de YPD additionné de 200 microgrammes par millilitre de G418 à 30 degrés Celsius sous agitation le jour suivant. Lavez les cellules issues des cultures de nuit trois fois dans du PBS, puis resuspendez-les dans un volume final de deux millilitres de milieu de sporulation, additionné de 200 microgrammes par millilitre.G quatre 18 Agiter les cultures de sporulation à température ambiante. Surveiller l'évolution de la sporulation quotidiennement jusqu'à ce que la formation de nouvelles tétrades cesse. Généralement, cela prend entre deux et quatre jours une fois que les cultures contiennent des tétrades bien formées et relativement peu de dyades.Retirer les cultures de l'agitation et les laisser à température ambiante pendant au moins sept jours avant la séparation des tétrades. L'aspect le plus difficile de cette procédure consiste à obtenir une bonne séparation des spores. Nous avons constaté empiriquement que laisser les cultures sporulées reposer à température ambiante sans agitation pendant au moins une semaine avant la séparation des tétrades améliore grandement la dissociation des spores.Les tétrades provenant de la culture de sporulation peuvent être détectées et isolées par tri cellulaire activé par fluorescence ou par fax, car les plasmides codés à barres dans les cellules diploïdes portent également une protéine de fusion GFP spécifique à la sporulation. Le protocole décrit ici a été développé pour un fax aria deux. Pour commencer cette procédure, chargez la culture sporulée sur le trieur fax et définissez deux fenêtres de diffusion avant et de diffusion latérale afin d'exclure les débris, les cellules agrégées et les multiples cellules par gouttelette.Il devrait y avoir une population de cellules fluorescentes, qui, lorsqu'on utilise le construit rapporteur PS deux GFP, comprend les dyades et les tétrades ; utiliser un histogramme de dispersion latérale (FSC) en fonction de la GFP afin d'inclure ces événements fluorescents. Selon l'arrière-plan génétique de la souche, il peut être nécessaire d'ajouter un tri supplémentaire pour éliminer les agrégats contenant des tétrades et d'autres cellules. Examiner un histogramme de la dispersion latérale (FSC) des événements fluorescents.Dans cet exemple, les événements du pic de gauche correspondent principalement à des tétras, et les événements du pic de droite sont généralement des tétras avec un bourgeon attaché ; appliquez une dernière fenêtre qui inclut les événements présentant une FSC plus faible, majoritairement des tétras, indiqués par les barres rouges. Vérifiez l'efficacité du régime de fenêtrage en triant environ 1 500 tétras sur une lame de microscope et en déterminant la proportion de tétrades par rapport aux non-tétrades. À l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 400 fois, le pourcentage de tétrades peut être estimé avec précision en comptant seulement environ 200 événements triés, mais le tri d’environ 1 500 événements réduit le temps passé à rechercher les cellules sur la lame de microscope.Ces images en champ clair utilisent un grossissement de 600 fois. Montrent des exemples de tétrades à gauche et de non-tétrades à droite après le tri selon les faits. Vérifiez périodiquement que le trieur indique correctement le nombre d'événements en triant 25 tétrades sur une lame de microscope et en examinant les cellules contenues dans la goutte à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 400 fois.Il devrait y avoir 25 tétrades dans la goutte. Répétez l'opération trois ou quatre fois pour évaluer la variance de l'appareil de tri fax lors de cet essai. Préparez les boîtes de gélose pour cette procédure en réchauffant le nombre souhaité de boîtes YPD plus G quatre 18 pendant au moins 1,5 heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius placé près du trieur fax.Une caractéristique essentielle du protocole de tri est la capacité de cibler avec précision les tétrades triées par fax vers un emplacement spécifique sur une plaque d'agar contenant un milieu de solution X. Pour ce faire, placez d'abord une plaque de repère de 96 puits sur l'unité automatisée de dépôt cellulaire du trieur. Préparez ensuite un schéma de tri permettant de trier 25 tétrades dans un seul puits d'une plaque de 96.Un tri en format plaque avec 25 tétras par plaque donne des colonies bien séparées. Choisissez un puits proche du centre de la plaque. Par exemple, le puits D5.Apportez une pile de 10 boîtes de gélose depuis l’incubateur à 37 degrés Celsius vers le trieur. Prenez une boîte de gélose et ajoutez 25 microlitres de solution zy sur la gélose, près du centre de la boîte. Ensuite, placez la boîte sur la plaque 96 puits de repère, en alignant la goutte X sur la cible.Eh bien, cela a été choisi précédemment. Eh bien D cinq. Commencez le tri et déposez 25 tétras au centre de la goutte de zy sur la plaque d'agar. Retirez et couvrez la plaque. Répétez le tri pour chaque plaque jusqu'à ce que 25 tétrades aient été triées dans des gouttes zamo sur chaque plaque de la pile. Replacez la pile de plaques contenant les tétrades dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.Apportez le prochain lot de 10 plaques au trieuse et répétez la procédure de tri. Les spores peuvent être séparées après que les plaques contenant les tétrades aient été incubées à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Pour commencer cette procédure, ajoutez 15 à 25 billes de verre stériles de trois millimètres à chaque plaque, puis agitez les plaques en deux piles de cinq plaques pendant trois à cinq minutes.La meilleure séparation des spores est obtenue en déplaçant rigoureusement les plaques de côté à côté ou de l'avant vers l'arrière. Ne pas déplacer les plaques de manière à faire tourbillonner les billes autour du bord extérieur de la plaque. Laisser les billes sur les plaques une fois terminé.Placer la pile de plaques avec les billes face vers le haut dans une étuve à 30 degrés Celsius. Retirer la pile suivante de plaques de l’étuve à 37 degrés Celsius et répéter la procédure de séparation des spores à l’aide des billes. Incuber toutes les plaques toute la nuit à 30 degrés Celsius le jour suivant la séparation des spores.Retirez soigneusement les boîtes de l'incubateur à 30 degrés Celsius sans déranger les billes de verre. De petites colonies devraient s'être formées sur les boîtes. Retirez les billes de verre en retournant délicatement et rapidement les boîtes au-dessus d'un récipient profond.Tapoter le fond de la plaque alors qu'elle est inversée peut aider à déloger les billes collées à la plaque. Les récipients doivent être suffisamment profonds pour récupérer les billes sans permettre qu'elles rebondissent et heurtent la plaque d'agar. Comptez le nombre de colonies sur chaque plaque et utilisez ce nombre pour estimer l'efficacité de la séparation et de la récupération des spores.Par exemple, 25 tétrades par boîte pour un croisement présentant une viabilité proche de 100 % pourraient produire un total de 100 colonies par boîte à partir de boîtes contenant un nombre suffisant de colonies, comme plus de 65 pour une forte viabilité. Transférez les cellules de chaque colonie dans un puits distinct d'une plaque 96 puits contenant du milieu liquide YPD additionné de G418. Notez également quels puits contiennent des colonies provenant de la même boîte d'agar.Ces informations seront utilisées ultérieurement pour faciliter l'assignation des tétrades. Le logiciel Software best peut grandement accélérer l'isolement des spores provenant des tétrades. Bien que la version actuelle de la méthode présente une certaine perte d'efficacité par rapport à la dissection manuelle, la distribution binomiale a été utilisée pour calculer la fraction attendue de tétrades produisant au moins une spore récupérée avec succès, donnant lieu à 1, 2, 3 ou quatre colonies, en fonction de la proportion de toutes les spores récupérées avec succès.Ce graphique peut servir de guide approximatif pour le nombre de souches qui seront finalement assemblées en tétrades de trois ou quatre spores, comme observé ici. Le nombre de tétrades complètes récupérées augmente avec le nombre de colonies par boîte dans cette étude. 25 rads provenant de croisements avec une viabilité des spores proche de 100 %, déterminée par dissection manuelle, ont été ensemencés sur 149 boîtes d'agar.Le nombre maximal de colonies observées par boîte était de 80, indiquant que 20 spores n'ont pas réussi à former des colonies distinctes. Le nombre moyen de colonies par boîte était de 62. À partir de 61 boîtes contenant 65 colonies ou plus, 4 354 colonies ont été récoltées et séquencées. Parmi les 3 700 souches ayant passé le contrôle qualité du séquençage, 2 665, soit 72 %, ont pu être attribuées par calcul à trois ou quatre tétrades de spores une fois maîtrisées.Cette technique peut être utilisée pour traiter plus d'un millier de tétrades par heure. Toutefois, pour des interventions dépassant trois heures, une aide sera nécessaire.

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