Name: Captation composé spectrométrie de masse - un outil puissant pour identifier de nouveaux c-di-GMP protéines effectrices (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Découvrez la spectrométrie de masse par composé de capture pour identifier les protéines liant le c-di-GMP chez les bactéries. Cette méthode améliore la spécificité et permet des conditions de lavage rigoureuses grâce au réticulage covalent.

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Nous remercions Alberto Reinders pour son travail d’optimisation des conditions CCMS pour P. aeruginosa. Nous remercions également Pablo Manfredipour l’annotation des protéines de P. aeruginosa. Ces travaux ont été soutenus par la bourse Sinergia du Fonds national suisse (FNS) CRSII3_127433.

1. Préparation Lysate <ol><li> Cultivez P. cellules aeruginosa dans LB à la DO souhaitée. REMARQUE: Pour obtenir des conseils: utiliser ≈ 100 ml de culture / échantillon pour cultures en phase stationnaire et ≈ 500 ml cultur / échantillon pour les cultures en phase logarithmique (DO 600 nm = 0,5). </li><li> Pellet par centrifugation pendant 20 min à 5000 x g. </li><li> Remettre en suspension de 0,5 à 1 g de culot dans 1 ml de tampon de lyse (mM MES 6,7 mM HEPES 6,7 mM, NaCl 200 mM KAC 6,7, DDT 1 mM, pH 7,5) et ajouter inhibiteur de la protéase (mini complète, sans EDTA) ainsi que DNaseI. </li><li> Lyse des cellules par trois passages à travers une cellule de pression française, à 20 000 psi (voir liste des matières). </li><li> Ultra-centrifugeuse de la lysat cellulaire à 100 000 x g pendant 1 h à 4 ° C. </li><li> Enregistrez le surnageant (passez à l&#39;étape 2). </li><li> Laver le culot avec 1 ml de tampon de lyse 1x par pipetage de haut en bas. </li><li> Ultracentrifugeuse à 100 000 x g pendant 1 heure à 4 ° C. </li><li> Flash geler le culot dansazote liquide et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisé pour la capture des protéines membranaires (voir l&#39;étape 3). </li></ol> 2. Suppression des nucléotides libres c-di-GMP et les autres (fraction soluble uniquement) <ol><li> Laver une colonne PD10 de dessalage (voir la liste des matériaux) avec 10 ml de tampon de lyse froid. </li><li> Verser le surnageant (≈ 1 ml) sur la PD10 afin d&#39;éliminer les nucléotides. </li><li> Eluer avec 4 ml de tampon de lyse froid (500 étapes pi). </li><li> Sélectionnez les fractions les plus concentrées comme déterminé par dosage de Bradford, et mettre en commun leur. </li></ol> 3. Pellet et resuspension solubilisation (Fraction membrane seulement) <ol><li> Reprendre le culot dans 500 à 1000 pi de tampon 1x de capture (sans détergent) (voir le tableau 1). NOTE: Le culot est difficile de remettre en suspension. Il est conseillé à la première pipette de haut en bas avec une pipette pour remettre en suspension à peu près le culot, puis d&#39;utiliser une seringue 27 G pour bien homogénéiser la solution. </li><li> Ajouter 1% (p / v) de n-dodécyl-β-D-maltopyranoside (DDM). </li><li> Incuber à 4 ° C pendant au moins 2 heures (ou O / N) sur une roue rotative. </li><li> Ultracentrifugeuse à 100 000 x g pendant 1 heure à 4 ° C. </li><li> Récolter le surnageant. </li></ol> 4. Concentration en protéines Mesure <ol><li> Mesurer la concentration en protéine par dosage de Bradford (par dosage BCA pour la fraction de membrane). </li><li> Régler la concentration totale en protéine de 10 mg / ml. </li></ol> 5. capture <ol><li> Mélanger 300 ug de protéine avec 1 mM de PIB, GTP, ATP, CTP, et 20 ul de tampon de capture 5x (100 mM de HEPES, 250 mM de KAc, MgAc 50 mM, 5% de glycerol, pH 7,5) (tableau 1). Ajuster le volume de réaction de 100 ul avec du H 2 O. REMARQUE: le volume total inclut le volume de la CDG-CC et c-di-GMP en cas de contrôle de la concurrence (voir l&#39;étape 5.3 et le tableau 2). REMARQUE: Les expériences ont été effectuées dans 200 &amp;bandes l 12 tubes PCR (Thermo Scientific); # 181. REMARQUE: pour la fraction membranaire, assurez-vous de toujours garder la concentration de DDM-dessus de la concentration micellaire critique (0,01% p / v) jusqu&#39;à ce que l&#39;étape de solubilisation de protéines dans 8 M d&#39;urée (étape 7.1). </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 30 min sur une roue rotative. </li><li> Ajouter 10 uM CDG-CC (concentration finale). REMARQUE: inclure un contrôle sans CDG-CC (dénommé «contrôle de perles»), et un contrôle additionné de 1 mM c-di-GMP (&quot;de contrôle de la concurrence&quot;) (voir le tableau 2). NOTE: la concentration CDG-CC peut être réglée de 1 à 10 uM. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant au moins 2 heures (O / N pour la fraction de membrane) sur une roue rotative, dans l&#39;obscurité. </li><li> Après une courte rotation, réticulation par l&#39;activation de la partie réactive de la CDG-CC avec une lumière UV pendant 4 min, en utilisant un CaproBox (voir la liste des matériaux, λ = 310 nm, Irradiance ≥10 mW / cm², la distance de la source = 2 cm). REMARQUE: retirer le couvercle des bandes croisées de liaison avant. </li><li> Ajouter 25 ul 5x tampon de lavage (5 M de NaCl, Tris 250 mM, pH 7,5) et 50 pi de billes magnétiques de streptavidine ainsi remis en suspension, homogénéiser délicatement. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 1 heure sur une roue rotative. </li></ol> 6. étapes de lavage NOTE: (Magnet: voir liste des matières). Commencez avec une capture des billes magnétiques dans le couvercle de la bande PCR, avec l&#39;aimant. Puis remplacer la bande PCR par un nouveau contenant la solution de lavage suivant. Retirer l&#39;aimant et remettre en suspension les perles, et incuber 2 min. Isoler et remplacer le couvercle par un couvercle frais. <ol><li> Les étapes de lavage (fraction soluble uniquement) <ol><li> Laver 6 fois dans 200 tampon de lavage ul 1x. </li><li> Laver une fois dans 200 pi qualité HPLC H 2 O. </li><li> Laver 6 fois dans 200 pi 80% d&#39;acétonitrile. </li><li> Laver deux fois dans 200 pi qualité HPLC H 2 O. </li></ol></li><li> Les étapes de lavage (membrane partie seulement) <ol><li> Laver 5 fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,1% DDM. </li><li> Laver deux fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,05% DDM. </li><li> Laver une fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,025% DDM. </li><li> Laver une fois dans 200 pi de tampon de lavage 1x + 0,0125% DDM. </li><li> Lavez 3 fois dans 200 pi mM ABC 100 (bicarbonate d&#39;ammonium, NH 4 CO 3) + 2 M d&#39;urée. </li></ol></li></ol> 7. MS Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Resuspendre les billes (directement dans le couvercle) dans 20 ul ABC 100 mM (100 mM ABC + 8 M d&#39;urée pour la fraction de membrane) et transférer dans des tubes de 1,5 ml. </li><li> Fraction membranaire seulement: incuber à 60 ° C pendant 5 min, sous agitation à 500 tours par minute. </li><li> Ajouter 0,5 ul mM PTCE 200 (tris (2-carboxyéthyl) phosphine) et incuber à 60 ° C pendant 1 heure, en agitant à 500 rpm. Refroidir à 25 ° C. </li><li> Ajouter 0,5 ul de 400 mM fraîchement préparée iodoacétamide et incuber à 25 ° C pendant 30 min, en secouant uneT 500 tours par minute et dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 0,5 pi de 0,5 M de N-acétyl-cystéine et incuber à 25 ° C pendant 10 min, sous agitation à 500 tours par minute. </li><li> Fraction membranaire uniquement: ajouter 1 pl Lys-C et incuber à 37 ° C, O / N. </li><li> Ajouter 2 pg de trypsine et incuber O / N à 37 ° C, en agitant à 500 rpm (enveloppement dans Parafilm pour éviter le dessèchement). NOTE: les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à ce stade. REMARQUE: fraction membrane uniquement: ajouter 100 mM ABC pour ajuster la concentration de l&#39;urée à &lt;2 M avant l&#39;addition de trypsine. </li><li> Brièvement centrifuger les tubes et de recueillir des perles avec l&#39;aimant. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml (répéter cette étape si les perles sont de gauche). </li><li> Ajouter 5 ul de 5% de TFA (acide trifluoroacétique) + 1 ul de HCl 2 M (+ HCl 5 M ul 15 ul de 5% de TFA 2 pour la fraction de membrane). </li><li> Condition colonnes C18 MicroSpin (Le Groupe de Nest, MA, USA) avec 150 ul acétonitrile (spin 20 secondes à 2400 tours par minute). </li><li> Equilibrate les colonnes C18 deux fois avec 150 ul de 0,1% de TFA (spin 20 sec, 2400 rpm). </li><li> Chargez l&#39;échantillon et de spin 2 min, 2000 rpm. </li><li> Recharger l&#39;écoulement sur la colonne et répéter l&#39;étape de filage (2 min, 2000 rpm). </li><li> Laver trois fois avec 150 ul de 0,1% de TFA, 5% d&#39;acétonitrile (20 sec, 2400 rpm). </li><li> Prendre un nouveau tube et on élue deux fois avec 150 ul de 0,1% de TFA, 50% d&#39;acétonitrile (2 min, 2000 rpm). </li><li> Sécher les peptides dans un speed-vac. </li><li> Remettre en suspension dans 40 ul de 98% de H 2 O, 2% d&#39;acétonitrile, d&#39;acide formique à 0,15%. </li><li> Soniquer 20 sec (cycle d&#39;impulsion 0,5, amplitude de 100%; voir la liste des matériaux) et centrifuger 5 sec, 12000 rpm (centrifugeuse de paillasse). Vortex 10 sec, et centrifuger 5 secondes, 12 000 rpm. Transférer dans un flacon de HPLC pour l&#39;analyse LC-MS / MS. </li><li> Congeler à -20 ° C. NOTE: les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C à ce stade. </li></ol> 8. LC-MS / MS Analysis <ol><li> Exécutez un nano-LC (systèmes nano-LC) equipped avec une colonne de RP-HPLC (75 pm x 37 cm) garnie de résine C18 (Magic C18 AQ 3 um) en utilisant un gradient linéaire de 95% de solvant A (acide 0,15% de l&#39;acide formique, 2% d&#39;acétonitrile) et 5% de solvant B ( 98% d&#39;acétonitrile, d&#39;acide formique à 0,15%) à 35% de solvant B sur 60 min à un débit de 0,2 ul / min. </li><li> Analyser les peptides par LC-MS / MS (double-pression LTQ Velos Orbitrap spectromètre de masse, relié à une source d&#39;ions à électronébulisation). REMARQUE: Le mode d&#39;acquisition de données a été créée pour obtenir une haute résolution MS SCAN dans la partie FT du spectromètre de masse à une résolution de 60000 FWHM suivie par des analyses MS / MS dans le piège à ions linéaire des 20 ions les plus intenses. Pour augmenter l&#39;efficacité de tentatives MS / MS, la projection modus chargée de l&#39;Etat a été activé à exclure non affecté et charge individuellement ions. Collusion dissociation induite a été déclenchée lorsque le précurseur dépassé les 100 chefs d&#39;ions. La durée d&#39;exclusion dynamique a été réglée à 30 sec. Le temps d&#39;accumulation d&#39;ions a été réglée à 300 ms (MS) et 50msec (MS / MS). </li></ol> 9. Base de données Recherche <ol><li> Télécharger le P. aeruginosa NCBI-base de données via la page d&#39;accueil du NCBI ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ). </li><li> Convertir les spectres MS brut en fichiers génériques de mascotte (mgf) en utilisant l&#39;outil de conversion MassMatrix ( <a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py</a> ). </li><li> Chercher dans ce fichier mgf utilisant MASCOT version 2.3 contre le P. aeruginosa NCBI-base de données contenant de l&#39;avant et les entrées de protéines reverse-leurres. </li><li> Effectuer une in silico la digestion de la trypsine après lysine et l&#39;arginine (moins suivi par la proline) tolérer manqué deux clivages dans les peptides tryptiques pleinement. </li><li> Définissez les paramètres de recherche de base de données pour permettre methionines oxydé (15,99491 Da) que des modifications variables et carboxyamidomethylation (57,021464 Da) des résidus cystéine que la modification fixe. Pour MASCOT nous scruteing scans haute résolution, définir la tolérance de masse de précurseur de 15 ppm et définir la tolérance de masse de fragment à 0,6 Da. Enfin, réglez la protéine FDR à 1%. </li><li> Importez les recherches mascotte de P. expériences aeruginosa CDSM dans Échafaudages (Proteomesoftware, Version 3), définissez les paramètres pour obtenir une protéine FDR près de 1%, et extraire les comtes spectrale totale. </li><li> Pour les résultats représentatifs présentés dans cet article, nous avons utilisé un test t apparié pour comparer l&#39;expérience avec le contrôle de la concurrence, et seulement considéré succès avec une valeur de p inférieure à 0,1, et un ratio de comptage spectrale supérieure à 2 (expérimenter compte spectrales / contrôle de la concurrence spectrale chiffres). </li><li> Les données peuvent être exportées dans ne importe quel tableur pour une analyse ultérieure. </li></ol> 10. Quantification Sans étiquette <ol><li> Importez les fichiers bruts dans le logiciel ProGenesis LC-MS (dynamique non linéaire, la version 4.0). </li><li> Effectuez un alignement LC-MS et détection de caractéristiques de Setti par défautNGS. </li><li> Exporter les données au format mgf de ProGenesis LC-MS. </li><li> Rechercher les spectres MS / MS en utilisant la mascotte contre le NCBI P. base de données contenant aeruginosa avant et entrées de protéines reverse-leurres. </li><li> Importez les résultats de la recherche de base de données dans ProGenesis LC-MS et cartographier les peptides identifications aux fonctionnalités MS1. </li><li> Pour l&#39;évaluation des données (calcul des niveaux de signification, plier changement ratios) le script ProteinSQAnalysis de SafeQuant a été utilisée (seuil: valeur de q inférieur à 0,1, le ratio de comptage spectrale supérieure à 2). </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une attention particulière devrait être prise à plusieurs étapes du protocole. La concentration en protéine est un paramètre critique avec une concentration de 10 mg / ml étant difficile à atteindre lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de croissance spécifiques (par exemple des biofilms ou des variants petites colonies). Ainsi, la remise en suspension du culot doit être effectuée dans un faible volume de tampon de lyse. Les concentrations de protéines peuvent être diminuées à 8 mg / ml. Par r...

c-di-GMP est un second messager clé utilisé par la plupart des bactéries de contrôler différents aspects de leur croissance et leur comportement. Par exemple, c-di-GMP régule la progression du cycle cellulaire, la motilité et de l&#39;expression d&#39;exopolysaccharides adhésines de surface et 4/2. Grâce à la coordination de ces procédés c-di-GMP favorise la formation du biofilm, un processus qui est associée à des infections chroniques d&#39;une gamme de 5 bactéries pathogènes. c-di-GMP est synthétisé par des enzymes appelées CYCLASES diguanylate (DGCS) qui abritent un domaine catalytique GGDEF 4. Certains DGCS possèdent un site inhibiteur qui régule négativement l&#39;activité de cyclase lors de la liaison c-di-GMP. La dégradation de c-di-GMP est catalysée par deux classes distinctes des phosphodiestérases (PDE) hébergeant soit un EAL catalytique ou HD-GYP domaine 6,7. La majorité des protéines effectrices connus qui se lient directement c-di-GMP appartiennent à l&#39;une des trois classes de protéines: catalytiqueGGDEF ou EAL domaines allié inactifs et domaines Pilz, petits interrupteurs moléculaires qui subissent des changements conformationnels sur c-di-GMP liaison 8. DGCS, PDE et Pilz protéines sont bien caractérisés et leurs domaines peuvent être prédites in silico de façon relativement sûre. Un intérêt particulier est désormais axée sur l&#39;identification de nouvelles classes d&#39;effecteurs c-di-GMP. Certains effecteurs c-di-GMP avec différents motifs de liaison ont été récemment décrits comme le CRP / FNR Bcam1349 de la famille des protéines dans Burkholderia cenocepacia ou FleQ de régulateur transcriptionnel dans P. aeruginosa 9,10. En outre, riboswitchs-GMP-c-di spécifique ont été récemment identifiés et affichés pour contrôler l&#39;expression génique d&#39;une manière c-di-GMP-dépendante 11. Les motifs c-di-GMP de liaison des différents effecteurs sont seulement mal conservée faire des prédictions bioinformatiques de telles protéines difficile. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode biochimique, qui est basé sur l&#39;utilisation d&#39;un spe c-di-GMPcifique de captation composé combinée avec la spectrométrie de masse 1,12,13. Nous avons récemment conçu un roman trivalent c-di-GMP captation composé (CDG-CC, figure 1) 1. Cet échafaudage chimique est composé de: 1) un fragment C-di-GMP utilisée comme appât pour capturer les protéines de liaison à c-di-GMP, 2) un groupe réactif photoactivable-UV utilisé pour réticuler la CDG-CC pour les protéines liées et 3) une biotine d&#39;isoler les protéines capturées en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Le CDG-CC peut être utilisé pour capturer directement et spécifiquement effecteurs c-di-GMP de mélange complexe de macromolécules que lysats cellulaires. Capturer composé à base de produits chimiques et les approches protéomique base ont déjà été signalés à être applicable à un large éventail d&#39;organismes, par exemple Caulobacter crescentus, Salmonella enterica sérotype typhimurium et P. aeruginosa 1,14. Dans ce document méthodologique,nous fournissons une dans la description de la profondeur de la procédure CCMS en utilisant des extraits de P. aeruginosa titre d&#39;exemple. Cette étude établit CCMS comme un outil puissant et polyvalent pour identifier biochimiquement nouveaux composants impliqués dans la signalisation de petite molécule.

<table><tbody><tr><td>caproBox</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td><td>Lampes UV couplées à un bloc de refroidissement à 96 plaques, pour la photoactivation</td></tr><tr><td>caproMag</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>inclus dans le kit de démarrage CCMS</td><td>Pour une manipulation facile des particules magnétiques sans pipetage</td></tr><tr><td>c-di-GMP caproKit caprotec</td><td>bioanalytics</td><td>sur demande</td><td>Le kit contient le composé de capture c-di-GMP, le c-di-GMP (pour le contrôle de compétition), des billes magnétiques enrobées de streptavidine, un tampon de capture et un tampon de lavage</td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage jetables-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Bandelettes PCR 12 tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v sonicateur avec VialTweeter</td><td>Technologie d’échographie Hielscher</td><td>UIS250v et VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de pression française miniature</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

captation composé spectrométrie de masse - un outil puissant pour identifier de nouveaux c-di-gmp protéines effectrices

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Des progrès considérables ont été réalisés au cours de la dernière décennie vers l&#39;identification et la caractérisation des enzymes impliquées dans la synthèse (des cyclases diguanylate) et de dégradation (phosphodiestérases) du second messager c-di-GMP. En revanche, peu d&#39;informations sont disponibles concernant les mécanismes moléculaires et de composants cellulaires à travers laquelle cette molécule de signalisation réglemente un large éventail de processus cellulaires. La plupart des protéines effectrices connus appartiennent à la famille Pilz ou sont dégénéré cyclases ou phosphodiestérases diguanylate qui ont renoncé à la catalyse et ont adopté fonction d&#39;effecteur. Ainsi, afin de mieux définir le réseau c-di-GMP cellulaire dans un large éventail de bactéries méthodes expérimentales sont nécessaires pour identifier et valider de nouveaux effecteurs pour lesquels fiable dans prédictions in silico sûr. Nous avons récemment développé une capture nouveau composé spectrométrie de masse (CCMS) technologie comme un outil puissant pourbiochimiquement identifier et de caractériser les protéines de liaison c-di-GMP. Cette technique a déjà été signalé comme étant applicable à une large gamme d&#39;organismes 1. Ici, nous donnons une description détaillée du protocole que nous utilisons pour sonder ces composants de signalisation. A titre d&#39;exemple, on utilise Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste dans laquelle c-di-GMP joue un rôle essentiel dans la virulence et le contrôle du biofilm. CCMS identifié 74% (38/51) des composants connus ou prévus du réseau c-di-GMP. Cette étude explique la procédure CCMS en détail, et l&#39;établit comme un outil puissant et polyvalent pour identifier de nouveaux composants impliqués dans la signalisation de petite molécule.

Pour identifier de nouveaux effecteurs c-di-GMP dans P. aeruginosa nous avons systématiquement utilisé CCMS pour analyser les fractions solubles et membranaires de P. aeruginosa souche PAO1 d&#39;une culture en phase logarithmique (DO 600 = 0,5). Nous résumons ici et discutons des résultats représentatifs de cette expédition de pêche. Quatre répliques biologiques indépendants ont été utilisés. Pour chaque expérience, deux concentrations CDG-CC différents ont été utilisés (5 uM et 10 uM). Pou...

Le second messager omniprésent c-di-GMP contrôle la croissance et le comportement de nombreuses bactéries. Nous avons mis au point une nouvelle technologie basée sur la spectrométrie de masse des composés de capture pour identifier et caractériser biochimiquement les protéines de liaison c-di-GMP dans pratiquement toutes les espèces bactériennes.

Captation composé spectrométrie de masse - un outil puissant pour identifier de nouveaux c-di-GMP protéines effectrices

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

L’objectif global de l’expérience de spectrométrie de masse de composé de capture est de capturer et d’identifier les protéines de liaison GMP cycliques. Ceci est réalisé par fractionnement, une culture cellulaire par presse française et l’élimination de la matrice cyclique libre gmp. En utilisant une colonne 10 comme deuxième étape, le composé de capture est ajouté et activé par la lumière UV pour réticuler de manière covalente les protéines de liaison GMP de la matrice cyclique liées au composé de capture en l’absence ou en présence d’un excès de GMP de la matrice cyclique libre.Ensuite, le composé de capture est lié à des billes magnétiques enrobées de streptavidine afin de laver intensivement les protéines capturées. Enfin, les protéines capturées sont digérées et préparées pour la spectrométrie de masse afin d’identifier les peptides générés. Les résultats sont ensuite analysés in silico. Le principal avantage du CCMS par rapport à nos méthodes existantes comme la co-précipitation, est que le composé de capture améliore la capture spécifique des partenaires directs et permet des conditions de lavage difficiles grâce à la liaison des coûts covalents.Cette méthode peut maintenant fournir des informations sur la signalisation cyclique bactérienne di GMP. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que la signalisation nucléotidique en général et pratiquement n’importe quelle molécule alimentée par le composé de capture. Avant de commencer cette procédure, préparez et lysez les cellules aérogènes p à travers une ultra-ultracentrifugeuse à cellules de pression françaises, le lysat cellulaire à 100 000 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius.Après avoir économisé le surnageant, laver la pastille avec un millilitre de tampon de lyse en pipetant de haut en bas après l’ultracentrifugation dans les mêmes conditions que précédemment. Congelez rapidement la pastille dans de l’azote liquide, puis stockez l’échantillon congelé à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour la capture des protéines membranaires. Ensuite, laver une colonne de dessalage 10 avec 10 millilitres de tampon de lyse à froid.Versez le supra natant sur le 10 afin d’éliminer les nucléotides, puis éluez avec quatre millilitres de tampon de lyse froide par incréments de 500 microlitres. Utilisez le test de Bradford pour déterminer les fractions les plus concentrées. Regroupez ensuite les fractions sélectionnées dans un tube de 1,5 millilitre Resus.Suspendez le granulé précédemment stocké dans 500 à 1000 microlitres d’un tampon de capture x sans détergent. Ajouter à l’échantillon une solution à 1 % en poids par volume de l’huile d’extrémité Beta D multipurin. Ensuite, incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures sur une roue rotative.Une fois terminé, ultracentrifugez l’échantillon à 100 000 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après l’ultracentrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. À ce stade, mélangez 300 microgrammes de protéines avec un millimolaire de G-D-P-G-T-P-A-T-P-C-T-P, et 20 microlitres de cinq x tampon de capture.Ajustez le volume de réaction à 100 microlitres avec de l’eau. Après avoir incubé l’échantillon à quatre degrés Celsius sur une roue rotative, ajoutez 10 micromolaires de composé de capture GMP cyclique. Ensuite, incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures pour la fraction soluble ou toute la nuit pour la fraction membranaire sur une roue rotative dans l’obscurité.Après un court essorage et le retrait du couvercle, réticulation par activation de la fraction réactive du composé de capture GMP de la matrice cyclique avec une lumière UV pendant quatre minutes à l’aide d’une boîte de rangée de bouchons. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de cinq tampons de lavage et 50 microlitres de streptocoque AVID bien remis en suspension dans des billes magnétiques. Homogénéisez doucement l’échantillon.Ensuite, incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant une heure sur une roue rotative. Après avoir capturé les billes dans le couvercle avec un aimant, lavez les fractions solubles six fois dans 200 microlitres d’un tampon de lavage X après avoir lavé une fois dans 200 microlitres d’eau de qualité HPLC laver six fois dans 200 microlitres de nitrile à 80 % d’acéto-nitrile, et deux fois dans 200 microlitres d’eau de qualité HPLC pour la fraction membranaire laver cinq fois dans 200 microlitres d’un tampon de lavage X et diminuer les concentrations d’huile d’extrémité bêta D multi purique mis à part. Ensuite, mettez les billes en suspension dans 20 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires pour la fraction soluble et de 100 millimolaires de bicarbonate d’ammonium plus huit molaires d’urée.Pour la fraction membranaire, transférez chaque suspension dans des tubes de 1,5 millilitre. Après avoir incubé la fraction membranaire, ajoutez 0,5 microlitre de tris de 200 millimolaires. Deux carboxy-éthylphosphine aux deux fractions et incuber à 60 degrés Celsius pendant une heure avec agitation à 500 tr/min.Une fois que les échantillons ont refroidi à 25 degrés Celsius, ajoutez 0,5 microlitre d’acétamide d’oto de 400 millimolaires fraîchement préparé après l’incubation dans l’obscurité. Ajoutez 0,5 microlitre de 0,5 molaire et d’acétylcystéine à chaque fraction. Ensuite, incubez les échantillons à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes en agitant à 500 tr/min.À ce stade, ajoutez un microlitre de LY C à la fraction membranaire après une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius. Ajoutez deux microgrammes de trypsine à chaque échantillon et enveloppez-les dans du paraform pour éviter le dessèchement. Après avoir incubé et fait tourner les échantillons, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre à l’aide de l’aimant pour éviter de collecter les billes.Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’acide trichloracétique à 5 % et un microlitre d’acide chlorhydrique à deux molaires à la fraction soluble, ajoutez 15 microlitres d’acide trichloracétique à 5 % et cinq microlitres d’acide chlorhydrique à deux molaires à la condition de fraction membranaire. C 18 micro-spin colonnes avec 150 microlitres d’acéto nitrile en tournant 20 secondes à 2, 400 tr/min. Une fois que les colonnes ont été équilibrées deux fois avec 150 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %, chargez l’échantillon et faites-le tourner pendant deux minutes.À 2000 tr/min, rechargez le flux sur les colonnes. Après avoir répété le filage et le lavage des colonnes avec de l’acide trifluoroacétique 0,1 et de l’acide nitrile acéto, prenez un nouveau tube et éluez deux fois avec 150 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 % et à 50 % d’acide nitrile acéto. Une fois que les peptides ont été séchés dans un aspirateur rapide, remettez-les en suspension dans 40 microlitres de 98 % d’eau, 2 % d’acétylnitrile et 0,15 % d’acide formique.Une fois que les échantillons ont été soniqués pendant 20 secondes, faites-les tourner pendant cinq secondes à 12 000 tr/min Après le vortex et la rotation, transférez les échantillons dans des flacons HPLC pour l’analyse lc MS MS. La liste initiale d’une culture en phase logarithmique d’un aérogène P comprend 768 protéines de fraction soluble et 433 protéines de fraction membranaire. Après avoir retiré les protéines non spécifiquement capturées, la liste a été réduite à 76 protéines de fracture solubles et 133 protéines de fraction membranaire. Cela comprenait 13 protéines solubles et 21 protéines membranaires de l’aérogène P qui sont connues ou prédites pour lier le colorant cyclique. BPF.Les 63 autres protéines solubles et les 112 protéines membranaires sont de nouvelles puces cycliques présumées. Protéines de liaison GMP, qui ne contiennent pas l’un des domaines de liaison GMP cycliques connus. CCMS avec des extraits cellulaires récoltés dans différentes conditions de croissance et avec diverses matrices cycliques intracellulaires.Les concentrations de BPF ont également été utilisées. Dans l’ensemble, 74 % des composants de signalisation GMP connus ou prédits ont été capturés. Étant donné qu’au moins neuf de ces gènes se sont révélés transcrits dans des conditions spécifiques et que certains peuvent ne pas se lier du tout à la matrice cyclique, GMP du tout, ce degré de couverture pourrait être proche de la saturation.Ceci, associé à l’observation que la plupart de ces composants ont été capturés avec une spécificité élevée, soutient fortement que cette technique est efficace et puissante. En tentant cette procédure, il est important de se rappeler que la sélection des candidats puissants sera réalisée en comparant la spécificité de capture des effecteurs DGP psychiques connus. Ainsi, suite à cette procédure, des méthodes telles que Drac, ubi, réticulation, balayage différentiel, fluorométrie micros ou télémétrie isotherme peuvent être effectuées afin de valider une liaison spécifique des candidats au cycle de cette GMP.

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marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.

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L’architecture des complexes protéiques est essentiel pour leur fonction. Combinant différentes techniques de spectrométrie de masse s’est avérée puissante pour étudier leur assemblage. Nous fournissons des protocoles pour la réticulation chimique et spectrométrie de masse native et montrer comment ces techniques complémentaires contribuer à élucider l’architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques.

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Multiplexage automatisé de l’échantillon à l’aide de l’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et du marquage isobarique (cPILOT)

Découvrez la spectrométrie de masse par composé de capture pour identifier les protéines liant le c-di-GMP chez les bactéries. Cette méthode améliore la spécificité et permet des conditions de lavage rigoureuses grâce au réticulage covalent.

Captation composé spectrométrie de masse - un outil puissant pour identifier de nouveaux c-di-GMP protéines effectrices

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