Name: Génération efficace dorigine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez la reprogrammation de fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes induites sans transgènes grâce au virus Sendai. Cette méthode efficace et sécurisée facilite la recherche en médecine régénérative.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lee pour des discussions utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire Lee a été soutenue par des subventions de Robertson Investigator Award de New York Fondation des cellules souches et du Maryland souches Fonds de recherche sur les cellules (TEDCO).

1. Préparation de la cellule et des médias (Jour 1) <ol><li> Culture et élargir fibroblastes humains avec du milieu DMEM contenant 10% de FBS. </li><li> Plate fibroblastes humains (figure 1) sur une plaque de 24 puits à la densité appropriée pour bien le jour avant la transduction. REMARQUE: Les dilutions en série suivantes sont recommandées (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K et 6.25K) parce que différents types de cellules ont la capacité de fixation différents. </li><li> Incuber les cellules pour un jour de plus dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, assurant que les cellules ont pleinement adhéré et étendu. </li></ol> 2. Effectuer transduction (Jour 2) <ol><li> Le jour de la transduction, vérifier la densité cellulaire et choisir les plus efficaces puits de la densité (figure 2). Il est préférable de choisir trois densités différentes: haute (80 ~ 90%), moyen (50 ~ 70%) et faible (20 ~ 40%). </li><li> Au moins 1 heure avant la transduction, aspirer le fibroblmédias ast des cellules et modifier nouveaux 300 pi de milieu de fibroblastes. </li><li> Supprimer un jeu de 4 différents tubes de virus Sendai de -80 ° C stockage. Décongeler chaque tube en même temps dans un bain-marie à 37 ° pendant quelques secondes, puis prendre les tubes à partir du bain d&#39;eau. Après cela, les décongeler à la température ambiante; tubes de centrifugation à 6000 g pendant 10 secondes et les placer sur la glace jusqu&#39;à utilisation. Ne pas réutiliser gel et de dégel du virus depuis les titres ne seront pas maintenir. </li><li> Ajouter les volumes de chacun des quatre tubes de virus Sendai (Oct-4, Klf-4, c-Myc et Sox-2) indiquées au tube de micro-centrifugeuse. Assurez-vous que la solution est bien mélangée par pipetage. Par exemple, si 50K cellules / un puits de 24 puits plaque lookwell pour la transduction: (Titre basé sur le certificat d&#39;analyse de Life Technologies, peut être différent d&#39;un lot à) Tube hOct-4 = 6,0 x 10 7 SDI, 3 MOI = 5 pi Tube hSox-2 = 6,5 x 10 7 SDI, 3 MOI = 4,6 μ; L Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 7 SDI, 3 MOI = 4,8 pi Tube hc-Myc = 7,8 x 10 7 SDI, 3 MOI = 3,8 pi Total = 18.2 pi de quatre facteurs de virus mélange / un puits (50K cellules) de la plaque de 24 puits </li><li> Selon les densités cellulaires; ajouter 2X, 1X, 0,5 X et le volume du mélange de virus dans le puits. Secouer doucement le devant de la plaque à l&#39;arrière, à gauche et à droite (2X: 36,4 pi de mélange de virus, 1X: 18,2 pi et 0.5X: 9,1 pi). </li><li> Placer les cellules dans un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur et incuber pendant une nuit. </li></ol> 3. Remplacement du milieu de culture (Jour 3 &amp; Jour 5) <ol><li> 24 heures après la transduction, remplacer le milieu avec 500 moyen de fibroblastes ul frais. </li><li> Le jour 5, changement de milieu avec les médias des fibroblastes frais. </li></ol> 4. Préparer des plats du MEF pour la co-culture (Jour 8) <ol><li> Préparer les cellules MEF dans 60 boîtes de culture mm avec 10% de FBS contenait un milieu DMEM day repiquer avant le fibroblaste transduit sur cellules nourricières du MEF. Remarque: Nous utilisons 5 x 10 5 MEF dans chaque boîte de 60 mm. </li></ol> 5. Démarrer co-culture de cellules transduites avec des cellules nourricières du MEF (Jour 9) <ol><li> Avant étalement des cellules transduites, aspirer 10% de FBS contenait milieu DMEM de plats d&#39;alimentation du MEF et ajouter frais 10% de FBS contenait milieu DMEM. </li><li> Supprimer le milieu à partir des fibroblastes qui sont transduites dans la plaque à 24 puits et laver les cellules une fois avec du D-PBS. Ajouter 200 ul de 0,25% de trypsine / EDTA dans les cellules de fibroblastes inThe plaque de 24 puits. Après moins de 5 minutes d&#39;incubation avec de la trypsine / EDTA, lorsque les cellules commencent à se détacher de la plaque, de recueillir les cellules avec un milieu de croissance dans 15 ml de tube conique. Puis centrifuger les dans 6000 g pendant 4 min. REMARQUE: La mise en commun 2X, 1X, 0.5X et virus fibroblastes transduction est recommandé. </li><li> Retirez le milieu surnageant et laver à remettre en suspensionle culot cellulaire avec 5.4 ml de milieu de fibroblastes frais pour la neutralisation de la trypsine. Puis centrifuger à 135 xg les pendant 4 min. </li><li> Cellules de la plaque que la densité de dilution en série et commencer à co-culture avec des milieux de fibroblastes sur MEF: telle que 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 et 1/128 par 60 plat mm. Selon le taux de mort cellulaire au cours de la première semaine de la transduction, on ne peut pas besoin de diluer à 1/2 ou 1/128 densité. Mettez de côté les cellules restantes pour extraire l&#39;ARN total comme un contrôle positif pour Transgene RT-PCR. </li><li> Placer des boîtes de 60 mm à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur pendant une nuit. </li></ol> 6. Flux cellules souches embryonnaires humaines à moyen et surveiller les cellules (Jour 10) <ol><li> Le lendemain, changer de support fibroblastes aux médias ES humain avec 10 uM Y-27632. Après cela, changer moyen quotidien avec le milieu ES humain: 800 ml de DMEM/F12 + 200 ml Sérum de remplacement Knockout + 10 ml de L-Glutamine + 10 ml de 10 mM de MEM acides aminés non essentiels minimaux+ 1 ml de 2-mercaptoéthanol + 10 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes. </li><li> Faire un changement quotidien des médias avec les médias de nouvelles souches embryonnaires humaines. Après une semaine, vérifiez les plats une fois par 2 ~ 3 jours sous un microscope pour la formation d&#39;amas de cellules ES colonies comme. Selon le type de cellule, la culture aura plus ou moins de temps avant colonies se trouvent. </li></ol> 7. Cueillette de la souches pluripotentes induites colonies cellulaires et Développer les cellules (Jour 20 ~) <ol><li> Trois semaines après la transduction, les colonies doivent apparaître grandi bien pour la cueillette. </li><li> La veille de la cueillette des colonies, préparer MEF alimentation en plaque de 24 puits. NOTE: Nous utilisons 12,5 x 10 5 MEF dans une plaque de 24 puits. </li><li> Le lendemain, changement de milieu de plats MEF de médias de fibroblastes de médias ES humain avec 10 uM Y-27632. Choisir manuellement une colonie à chaque fois sous le microscope dans la cueillette de capot et faire des petits bouquets de pipetage et de les transférersur fraîchement préparée MEF dishes.Try de choisir plusieurs clones. </li><li> Passage et développer chaque puits d&#39;une plaque de 24 puits à une plaque à 6 puits initialement. Ensuite, à partir d&#39;une plaque à 6 puits à une boîtes de 60 mm avant la propagation ultérieure. </li></ol> 8. Caractérisation des iPSCs humain (après 10 passages) <ol><li> Immunofluorescence <ol><li> Plaque CSPi humaines dans la plaque et de la culture de 24 puits pendant 4-5 jours avec changement de support quotidienne. </li><li> Pour commencer immunofluorescence, laver la plaque avec le D-PBS fois. Puis fixer les cellules immédiatement dans 0,4% de paraformaldéhyde pendant 30 min. Après que les laver trois fois dans du D-PBS pendant 5 min. </li><li> Traiter les cellules fixées avec 0,1% de Triton X-100 solution dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution de permeablization (0,1% triton X-100 solution), puis ajouter une solution à 0,5% de blocage de BSA pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Effectuer une détection de Nanog, Oct-4, l&#39;AESS (Antig embryonnaire spécifique au stadefr) et TRA-1-81 (antigène de rejet tumoral) en utilisant un anticorps anti-humain dans une solution de BSA à 0,5% (consulter le tableau matière de taux de dilution d&#39;anticorps). Incuber l&#39;anticorps primaire pendant 2 heures à température ambiante. Puis laver trois fois dans D-PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Vérifier en utilisant la microscopie de fluorescence, après 1 h d&#39;incubation avec Alexa Fluor 488 anticorps IgG de chèvre anti-souris comme 2 ème anticorps, qui sont dilué 1:2000 dans une solution de BSA à 0,5% à la température ambiante. Colorer tous les noyaux de chacune des cellules nourricières du MEF et hiPSCs avec DAPI. </li></ol></li><li> RT-PCR de Transgene Confirmation <ol><li> Extrait ARNm total de culot cellulaire en utilisant des réactifs d&#39;extraction d&#39;ARN. </li><li> Faire une transcription inverse sur aliquotes (1 pg) de l&#39;ARN total et l&#39;ADNc résultant pour l&#39;amplification PCR par transcriptase inverse. </li><li> Préparer les mélanges de PCR pour contenir 2 pi de matrice d&#39;ADNc, 10 pi de 2X PCR Master Mix, 2 pi de 2 pmol d&#39;amorces(Avant: 1 pl et inverser: 1 pi) et 6 pi de DW. Pour détecter l&#39;expression des gènes, faire la RT-PCR avec les amorces énumérées dans le tableau 1. </li><li> Effectuer la RT-PCR avec le gène de la GAPDH comme contrôle pour l&#39;efficacité des réactions d&#39;amplification. Visualiser et analyser le produit de PCR par électrophorèse sur agarose-gel 1%. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines à hiPSCs détient promesses sans précédent dans la biologie fondamentale, la médecine personnelle, et la transplantation 12. Auparavant, les générations iPSC humaines requises virus à ADN qui a un risque d&#39;intégration dans le génome de l&#39;hôte, ce qui peut créer des mutations génétiques indésirables qui limitent d&#39;autres applications cliniques telles que le développement de médicaments et de thérapies de transplantation 13. Avec cette raiso...

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité d&#39;auto-renouvellement in vitro et ont pluripotence, qui pourrait être potentiellement utile pour la modélisation de la maladie, pour le criblage de médicaments, et de développer des thérapies à base de cellules pour traiter les maladies et les blessures des tissus. Toutefois, les CSEh ont une limitation pour la thérapie de remplacement de la cellule en raison de barrières immunologiques, oncologiques et éthiques, et à étudier les gènes liés à la maladie, les CSEh spécifiques à la maladie ont pu être isolés par diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) des approches, mais il est encore techniquement difficile et les dons d&#39;embryons sont assez rares. Ces problèmes sont liés au progrès de la biologie des cellules souches, ce qui a conduit à la mise au point de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs). CSPi humaines sont génétiquement reprogrammées à partir de cellules somatiques humaines adultes et abritent souches caractéristiques de cellules pluripotentes comme similaires à CSEh, qui les rend une source utile pour la médecine régénérative, comme ddécouverte de tapis, la modélisation des maladies et de thérapie cellulaire chez un patient spécifique de manière 1,2. Jusqu&#39;à présent, il existe plusieurs méthodes pour générer des CSPi humaines, y compris le virus médiation (rétrovirus et adénovirus) 3, non-virus médiation (système de BAC et les vecteurs de transfection) 4 transductions de gènes et de protéines système de livraison 5-7. Même si une livraison de gènes du virus médiée peut assurer un certain niveau d&#39;efficacité, des vecteurs viraux peuvent laisser l&#39;empreinte génétique, car ils s&#39;intègrent dans les chromosomes de l&#39;hôte pour exprimer des gènes de reprogrammation d&#39;une manière incontrôlée. Même lorsque l&#39;intégration virale de facteurs de transcription peut activer ou inactiver les gènes de l&#39;hôte 8, il peut provoquer une aberration génétique inattendu et le risque de tumorigenèse 5,9. D&#39;autre part, l&#39;introduction directe de protéines ou d&#39;ARN dans les cellules somatiques ont été rapportés, mais ils ont quelques inconvénients tels que main-d&#39;œuvre, transf répétéeection, et le faible niveau de la reprogrammation de 7,10. Même adénovirus épisomique et sans intégration, virus adéno-associés, et les vecteurs plasmidiques sont encore relativement moins efficace 11. Pour ces raisons, il est plausible de choisir non-intégration des méthodes de reprogrammation avec une grande efficacité de la production iPSC et moins d&#39;anomalies génétiques. Dans cette étude, nous utilisons une reprogrammation base Sendai-virus. Ce procédé est connu pour être non-intégrés dans le génome de l&#39;hôte et produit constamment iPSCs humains sans intégration du transgène.

<table><tbody><tr><td>Kit de reprogrammation CytoTune-iPS</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6, MEF, résistant à la néomycine, traité à la mitomycine C</td><td>Tige globale</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm ou 12,5 x 105/24 puits</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA 0,25 % Trypsine avec EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 moyen</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 24 puits, à fond plat avec couvercle</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956 ; M (Stock : 10 mM)</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes basiques</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Stock : 100 ug)</td></tr><tr><td>Sérum de remplacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039 ; s Medium Eagle modifié (D-MEM, DMEM) (1X), liquide (haute teneur en glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), liquide</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol (1 000X), liquide</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1 000</td></tr><tr><td>Hausser Hémacytomètres à contraste de phase</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1 % solution de gélatine</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anticorps monoclonal Oct4 de souris</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1 000</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R& D</td><td>AF1997</td><td>1/1 000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 chèvre anti-souris</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2 000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039 ; s Saline tamponnée au phosphate), 1X sans calcium et magnésium</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Kit de Transcription Inverse</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trap de prélèvement</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>lunette de dissection&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Il ya quelques années, la mise en place de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) a inauguré une nouvelle ère dans le domaine biomédical. Les usages potentiels des CSPi humaines comprennent la modélisation pathogenèse des maladies génétiques humaines, la thérapie cellulaire autologue après la correction de gène, et le dépistage des drogues personnalisé en fournissant une source de cellules pertinentes et des symptômes spécifiques du patient. Cependant, il existe de nombreux obstacles à surmonter, par exemple en éliminant le facteur de reprogrammation expression transgène qui reste après la production de iPSCs humains. Plus important encore, l&#39;expression du transgène résiduelle dans CSPi humaines indifférenciées pourrait entraver différenciations propres et égarer l&#39;interprétation de la maladie pertinents dans les phénotypes in vitro. Avec cette raison, sans l&#39;intégration et / ou CSPi humaines libre transgènes ont été développés en utilisant plusieurs méthodes, telles que l&#39;adénovirus, le système de piggyBac, vecteur minicercle, vecteurs épisomiques, la livraison directe des protéines et la synthèse de l&#39;ARNm. Cependant, l&#39;efficacité de reprogramming utilisant des méthodes sans rapprochement est très faible dans la plupart des cas. Ici, nous présentons une méthode pour isoler CSPi humaines en utilisant Sendai-virus (virus à ARN) du système de reprogrammation base. Cette méthode de reprogrammation montre des résultats cohérents et de haute efficacité de manière rentable.

Habituellement fibroblastes infectés ne présentent pas de changements morphologiques dans plusieurs jours après la transduction du virus Sendai, mais cinq jours plus tard, ils commencent à avoir des formes différentes (Figure 1). Comme décrit dans un panneau de droite de la figure 1, les cellules n&#39;ont pas la morphologie des fibroblastes typique plus. Ils ont une forme ronde et grand noyau de cytoplasme. Même lorsque la transduction est réalisée dans 80% de confluence cellulaire, on...

Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites humaines avec le virus Sendai. Ceci est accompli en préparant et en plaquant d’abord les cellules de fibroblastes à transduire. L’étape suivante de la procédure consiste à infecter les cellules avec le virus Sendai.Ensuite, les cellules de fibroblastes infectées sont transférées sur des cellules embryonnaires fraîches de souris qui se nourrissent de fibroblastes. La dernière étape consiste à choisir manuellement le reprogrammé. Aujourd’hui, les cellules souches pluripotentes, c’est-à-dire la reprogrammation des cellules fibroblastiques en I PSC, sans l’utilisation de gènes trans, peuvent être mises en évidence par immunomarquage et R-T-P-C-R.Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante est qu’elle améliore l’efficacité de la reprogrammation sans rester transactive et de manière rentable. Pour ce protocole, avoir des fibroblastes humains prêts à être cultivés dans DMEM. Avec FBS, transférez ces cellules sur des plaques à 24 puits pour la plaque d’expérience, les cellules en six dilutions en série pour déterminer la meilleure densité pour la fixation des cellules. Chaque rangée de la plaque à 24 puits peut accueillir une série de cellules de dilution.Ainsi, quatre types de cellules peuvent être testés sur une seule plaque, incuber la dilution pendant 24 heures. Le lendemain, choisissez des puits à trois niveaux de confluence pour la transduction. L’un à un niveau élevé de 80 à 90 % de confluence, l’autre à environ 60 % de confluence et le troisième à environ 30 % de confluence une heure ou plus avant la transduction.Remplacez le média par 300 microlitres de média de fibroblastes frais pour la décongélation par transduction. Un ensemble de tubes de virus Sendai à 37 degrés Celsius pendant quelques secondes, puis terminez. Décongelez-les à température ambiante.Centrifugez les virus décongelés à 6 000 G pendant 10 secondes et stockez-les sur de la glace dans un microtube de centrifugation. Faites un mélange des virus calculé en fonction du nombre de cellules à transduire. Les détails du calcul se trouvent dans le protocole texte.Mélangez bien les virus avec un pipetage doux. Maintenant, aux cellules les plus denses, ajoutez deux volumes de virus. Ajoutez un volume de virus aux cellules de densité moyenne et ajoutez un demi-volume de virus à la sélection la moins dense.Retournez l’assiette et laissez-la incuber toute la nuit pour que la réaction ait lieu le lendemain. Remplacez le média par 500 microlitres de média fibroblaste frais. Refaites cela deux jours plus tard, trois jours après le deuxième changement de média effectué sur les cellules transduites.Préparez des cellules de méthamphétamine dans des boîtes de 60 millimètres avec du DMEM contenant 10 % de plaque FBS 500 000 cellules par boîte et incubez-les pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu sur les cellules de méthamphétamine par un milieu frais, puis procédez à la mise en place de la coculture. Tout d’abord, retirez le milieu des fibroblastes transduits et lavez-les une fois avec du DPBS.Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 0,25 % de trypsine EDTA dans chaque puits de cellules transduits dans les cinq minutes. Regroupez toutes les cellules qui se détachent dans un seul tube conique de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 1 350 G pendant quatre minutes.Retirez ensuite le surnageant et lavez les cellules granulées avec environ cinq millilitres de milieu frais pour neutraliser le trippin. Maintenant, collectez les cellules avec un autre tour de quatre minutes à 1 plaque de 350 G. La plupart des cellules se présentent sous forme de six dilutions en série dans de la méthamphétamine.La première et la dernière dilution peuvent ne pas être nécessaires en fonction du taux de mortalité des cellules. Conservez une partie des cellules pour une extraction d’ARN et incubez les plaques pendant la nuit. Le lendemain, remplacer le milieu par un milieu ES humain complété par 10 micromolaires d’inhibiteur de la kinase RO Y 2 7 6 3 2.Pour améliorer la survie cellulaire au cours des jours suivants, changez le milieu pour un milieu ES humain normal non supplémenté. Après une semaine de culture, commencez à vérifier les boîtes tous les quelques jours pour la formation de colonies ES comme des amas de cellules. Une fois qu’ils apparaissent, surveillez la croissance.Trois semaines après la transduction, les colonies d’amas de cellules ES devraient être prêtes pour l’expansion. Avoir préparé des cellules d’alimentation de méthamphétamine dans des plaques de 24 puits tout comme elles ont été préparées pour des plaques de 60 millimètres. Avant de choisir des colonies, remplacez le milieu des cellules de méthamphétamine par un milieu ES avec 10 microlitres de Y 2, 7, 6, 3, 2.Choisissez une colonie à la fois dans les plats. Transférez la colonie dans un tube de 15 millilitres avec une solution. Briser la colonie à l’aide de la pipette.Ensuite, couvrez-en un moi. Eh bien, avec la colonie brisée. En fin de compte, chargez chaque puits avec une colonie brisée et chargez autant de puits que possible.Maintenez les cellules avec des changements de milieu quotidiens et étendez-les à six plaques de puits, puis à des paraboles de 60 millimètres. En règle générale, les fibroblastes infectés par le virus Sendai ne présentent aucun changement morphologique avant cinq jours. Ensuite, les cellules prennent une forme ronde avec un noyau plus grand et un cytoplasme plus petit.Ce protocole à petite échelle comprend plusieurs paramètres qui peuvent être optimisés, tels que la densité des fibroblastes, le titre du virus et la densité de placage au mes. La transduction de cellules à différentes co-fluidités montrées dans différentes couleurs peut également être optimisée. Après une semaine de co-culture avec des cellules nourricières de méthamphétamine, les fibroblastes partiellement reprogrammés ont une forme lâche et sont facilement cueillis au lieu d’être collectés à l’aide de trypsine.Entièrement reprogrammées, les CSP I sont clairement identifiables à partir de cellules partiellement reprogrammées. Les cellules entièrement reprogrammées sont serrées et les colonies peuvent avoir des limites claires. Les cellules partiellement reprogrammées forment des grappes lâches qui se détachent facilement.Après avoir élargi les clones IPSC pendant plusieurs semaines, la coloration des marqueurs de cellules souches est justifiée par rapport aux cellules H neuf. Les IPC sont positifs pour plusieurs anticorps attendus, y compris SSEA quatre, OCT quatre, TRA 81 et nano G, soutenant leur qualité pluripotente. L’utilisation du transgène R-T-P-C-R n’a pas été observée chez les clones IPSC humains.Après 10 amorces pour OCT exogène quatre, SOX deux, klf quatre et Cmic ont été utilisés avec des échantillons de contrôle positifs qui ont montré de forts niveaux d’expression transgénique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reprogrammer les cellules somatiques pour induire les cellules souches polypotentes et comment les sélectionner, reprogrammer complètement les cellules des autres cellules.

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