Génération efficace d'origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites humaines avec le virus Sendai. Ceci est accompli en préparant et en plaquant d’abord les cellules de fibroblastes à transduire. L’étape suivante de la procédure consiste à infecter les cellules avec le virus Sendai.

Ensuite, les cellules de fibroblastes infectées sont transférées sur des cellules embryonnaires fraîches de souris qui se nourrissent de fibroblastes. La dernière étape consiste à choisir manuellement le reprogrammé. Aujourd’hui, les cellules souches pluripotentes, c’est-à-dire la reprogrammation des cellules fibroblastiques en I PSC, sans l’utilisation de gènes trans, peuvent être mises en évidence par immunomarquage et R-T-P-C-R.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante est qu’elle améliore l’efficacité de la reprogrammation sans rester transactive et de manière rentable. Pour ce protocole, avoir des fibroblastes humains prêts à être cultivés dans DMEM. Avec FBS, transférez ces cellules sur des plaques à 24 puits pour la plaque d’expérience, les cellules en six dilutions en série pour déterminer la meilleure densité pour la fixation des cellules. Chaque rangée de la plaque à 24 puits peut accueillir une série de cellules de dilution.

Ainsi, quatre types de cellules peuvent être testés sur une seule plaque, incuber la dilution pendant 24 heures. Le lendemain, choisissez des puits à trois niveaux de confluence pour la transduction. L’un à un niveau élevé de 80 à 90 % de confluence, l’autre à environ 60 % de confluence et le troisième à environ 30 % de confluence une heure ou plus avant la transduction.

Remplacez le média par 300 microlitres de média de fibroblastes frais pour la décongélation par transduction. Un ensemble de tubes de virus Sendai à 37 degrés Celsius pendant quelques secondes, puis terminez. Décongelez-les à température ambiante.

Centrifugez les virus décongelés à 6 000 G pendant 10 secondes et stockez-les sur de la glace dans un microtube de centrifugation. Faites un mélange des virus calculé en fonction du nombre de cellules à transduire. Les détails du calcul se trouvent dans le protocole texte.

Mélangez bien les virus avec un pipetage doux. Maintenant, aux cellules les plus denses, ajoutez deux volumes de virus. Ajoutez un volume de virus aux cellules de densité moyenne et ajoutez un demi-volume de virus à la sélection la moins dense.

Retournez l’assiette et laissez-la incuber toute la nuit pour que la réaction ait lieu le lendemain. Remplacez le média par 500 microlitres de média fibroblaste frais. Refaites cela deux jours plus tard, trois jours après le deuxième changement de média effectué sur les cellules transduites.

Préparez des cellules de méthamphétamine dans des boîtes de 60 millimètres avec du DMEM contenant 10 % de plaque FBS 500 000 cellules par boîte et incubez-les pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu sur les cellules de méthamphétamine par un milieu frais, puis procédez à la mise en place de la coculture. Tout d’abord, retirez le milieu des fibroblastes transduits et lavez-les une fois avec du DPBS.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 0,25 % de trypsine EDTA dans chaque puits de cellules transduits dans les cinq minutes. Regroupez toutes les cellules qui se détachent dans un seul tube conique de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 1 350 G pendant quatre minutes.

Retirez ensuite le surnageant et lavez les cellules granulées avec environ cinq millilitres de milieu frais pour neutraliser le trippin. Maintenant, collectez les cellules avec un autre tour de quatre minutes à 1 plaque de 350 G. La plupart des cellules se présentent sous forme de six dilutions en série dans de la méthamphétamine.

La première et la dernière dilution peuvent ne pas être nécessaires en fonction du taux de mortalité des cellules. Conservez une partie des cellules pour une extraction d’ARN et incubez les plaques pendant la nuit. Le lendemain, remplacer le milieu par un milieu ES humain complété par 10 micromolaires d’inhibiteur de la kinase RO Y 2 7 6 3 2.

Pour améliorer la survie cellulaire au cours des jours suivants, changez le milieu pour un milieu ES humain normal non supplémenté. Après une semaine de culture, commencez à vérifier les boîtes tous les quelques jours pour la formation de colonies ES comme des amas de cellules. Une fois qu’ils apparaissent, surveillez la croissance.

Trois semaines après la transduction, les colonies d’amas de cellules ES devraient être prêtes pour l’expansion. Avoir préparé des cellules d’alimentation de méthamphétamine dans des plaques de 24 puits tout comme elles ont été préparées pour des plaques de 60 millimètres. Avant de choisir des colonies, remplacez le milieu des cellules de méthamphétamine par un milieu ES avec 10 microlitres de Y 2, 7, 6, 3, 2.

Choisissez une colonie à la fois dans les plats. Transférez la colonie dans un tube de 15 millilitres avec une solution. Briser la colonie à l’aide de la pipette.

Ensuite, couvrez-en un moi. Eh bien, avec la colonie brisée. En fin de compte, chargez chaque puits avec une colonie brisée et chargez autant de puits que possible.

Maintenez les cellules avec des changements de milieu quotidiens et étendez-les à six plaques de puits, puis à des paraboles de 60 millimètres. En règle générale, les fibroblastes infectés par le virus Sendai ne présentent aucun changement morphologique avant cinq jours. Ensuite, les cellules prennent une forme ronde avec un noyau plus grand et un cytoplasme plus petit.

Ce protocole à petite échelle comprend plusieurs paramètres qui peuvent être optimisés, tels que la densité des fibroblastes, le titre du virus et la densité de placage au mes. La transduction de cellules à différentes co-fluidités montrées dans différentes couleurs peut également être optimisée. Après une semaine de co-culture avec des cellules nourricières de méthamphétamine, les fibroblastes partiellement reprogrammés ont une forme lâche et sont facilement cueillis au lieu d’être collectés à l’aide de trypsine.

Entièrement reprogrammées, les CSP I sont clairement identifiables à partir de cellules partiellement reprogrammées. Les cellules entièrement reprogrammées sont serrées et les colonies peuvent avoir des limites claires. Les cellules partiellement reprogrammées forment des grappes lâches qui se détachent facilement.

Après avoir élargi les clones IPSC pendant plusieurs semaines, la coloration des marqueurs de cellules souches est justifiée par rapport aux cellules H neuf. Les IPC sont positifs pour plusieurs anticorps attendus, y compris SSEA quatre, OCT quatre, TRA 81 et nano G, soutenant leur qualité pluripotente. L’utilisation du transgène R-T-P-C-R n’a pas été observée chez les clones IPSC humains.

Après 10 amorces pour OCT exogène quatre, SOX deux, klf quatre et Cmic ont été utilisés avec des échantillons de contrôle positifs qui ont montré de forts niveaux d’expression transgénique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reprogrammer les cellules somatiques pour induire les cellules souches polypotentes et comment les sélectionner, reprogrammer complètement les cellules des autres cellules.