Name: Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez le profilage de l'expression génique à cellule unique dans les cellules souches embryonnaires humaines par RT-PCR quantitative. Cette méthode révèle l'hétérogénéité des populations et améliore la compréhension de la biologie des cellules souches.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lee pour des discussions utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire Lee a été soutenue par des subventions de Robertson Investigator Award de New York Fondation des cellules souches et du Maryland souches Fonds de recherche sur les cellules (TEDCO).

1. Préparation d&#39;une plaque de 96 puits <ol><li> Mélanger 1 pl de Single Cell DNase1 à 9 pi Single Cell Lysis Solution. </li><li> Mettez le 10 ul solution mixte dans chaque puits de plaque de 96 puits PCR. </li></ol> 2. Retrait CSEh pour FACS Purification <ol><li> Détachez OCT4 :: lignée cellulaire EGFP ES à partir de la boîte de 60 mm avec 1 ml Accutase pendant 20 min, à 37 ° C, qui ont été neutralisés avec les médias ES humaine. </li><li> Préparer population de cellules dans 1 ml de tampon FACS et ajuster la cellule à 1 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Passez l&#39;échantillon de cellules à travers un tamis cellulaire tube à bouchon de 35 um. </li><li> Stocker le tube dans la glace avant tri cellulaire. </li></ol> 3. Lysis de FACS purifié cellule unique dans chaque puits de la plaque de 96 puits <ol><li> Trier l&#39;échantillon pour les cellules positives à l&#39;EGFP sur un trieur de cellules avec un opérateur qualifié. Mettez la cellule unique dans une solution Lysis/DNase1 Single Cell dans la plaque PCR 96 puits. Si nécessaire, le 9Plaque à 6 puits à échantillon peut être stocké à -80 ° C un congélateur inférieur à un mois. </li><li> Incuber les échantillons 5 min à température ambiante pendant la lyse des cellules. </li><li> Ajouter 1 ul de solution d&#39;arrêt pour arrêter la réaction de lyse. </li><li> Incuber 2 min à température ambiante. </li></ol> 4. Transcription inverse <ol><li> Ajouter à chacun une aliquote de 0,5 ul de 20 uM SMA-T15, SMA-A. </li><li> Ajouter 4 ul de tampon 5X, 2 yl de DTT, 1 pi de transcriptase inverse, et 1 ul de dNTP à chaque puits. </li><li> Effectuer une transcription inverse dans un thermocycleur. <ol><li> Réglez le programme thermique à 42 ° C × 90 min et inactiver la transcriptase inverse à 85 ° C × 5 min. </li></ol></li></ol> 5. Amplification <ol><li> Ajouter 4 pi de réactif ExoSAP-IT pour chaque échantillon transcrit inverse. <ol><li> Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min et 80 ° C pendant 15 min pour inactiver le réactif ExoSAP-IT. </li></ol></li><li> Préparer mélange réactionnel PCR wvec SMA-p2 (2 nM) </li><li> Ajouter 10 ul de mélange réactionnel de PCR pour chaque échantillon transcription inverse. </li><li> Effectuer l&#39;amplification, constitué de 20 cycles de dénaturation (94 ° C pendant 30 sec), annelage (57 ° C pendant 30 s) et extension (68 ° C pendant 10 min). </li></ol> 6. Performance qRT-PCR <ol><li> Ajouter 10 ul de 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul d&#39;ADNc amplifié, 2 nM d&#39;amorces, et 7 ul de l&#39;eau dans chaque puits. <ol><li> Régler le programme suivi par 95 ° C pendant 3 sec, 60 ° C pendant 30 sec x 40 cycles. </li></ol></li><li> Effectuer en double pour des erreurs techniques. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Seul gène cellulaire profilage pourrait être un outil important pour prédire la fonctionnalité d&#39;une seule cellule ou une population entière. En raison de limitations techniques, toute l&#39;analyse de profilage génétique a été limitée aux moyennes de la population. Variations dans les modes et les niveaux entre les cellules individuelles et les sous-populations expression génique ont été proposés pour entraîner une interprétation erronée. Ces aspects cellulaires diverses peuvent être trouvés dans les CSEh et leur h...

Populations eucaryotes plus élevés sont hétérogènes donc à l&#39;analyse de la population mis en commun, il est souvent difficile d&#39;interpréter leurs fonctions cellulaires. Les cellules individuelles au sein d&#39;une population peut être légèrement différente, et ces différences peuvent avoir des conséquences importantes pour la propriété et la fonction de l&#39;ensemble de la population 1, 2. Surtout, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont connus pour être hétérogène, ce qui entraîne différents niveaux de la pluripotence et potentiels divers aux spécifications de la lignée dans délicatement façons distinctes 3, 4. Par exemple, les différents antigènes de surface cellulaire peuvent être utilisées pour classer les cellules souches pluripotentes indifférenciées, 5 et le groupe Austin Smith a proposé différents niveaux de la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris, en fonction de leur morphologie, la différenciation propension et la dépendance de la voie 6 de signalisation. Ce phénomène a émis l&#39;hypothèse d&#39;un embryon humaincellules souches nic 7. Considérant que les études globales ont été effectuées entre les différentes lignées de cellules souches, et non pas des cellules souches simples particuliers, il pourrait être très intéressant d&#39;analyser les différents niveaux de la pluripotence au niveau d&#39;une seule cellule, ce qui affecte potentiellement leurs capacités de différenciation vers toutes les lignées de cellules somatiques. Hétérogénéité cellulaire et moléculaire pourrait être dicté par profilage de transcription, qui est appelé le «transcriptome d&#39;une cellule unique» et met l&#39;accent sur ​​de nouvelles approches pour quantifier les niveaux d&#39;expression des gènes 8-10. Pour l&#39;analyse des niveaux d&#39;expression de gènes dans des cellules individuelles, nous avons développé un protocole simple mais robuste de la cellule unique de RT-PCR quantitative. Nous avons confirmé l&#39;efficacité et la faisabilité de notre protocole en comparant chaque moitié de lysats de cellules individuelles ainsi que ARN totaux dilués en série de CSEh, résultant des variations techniques minimales et les différences. En outre, nous avons utilisé une ligne de reporter génétique pour isoler p homogèneopulation de CSEh à l&#39;aide de système de ciblage de gène. Le vecteur donneur pour cibler OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construire) et une paire de plasmides ont été utilisés Talen 11. Le vecteur donneur et une paire de plasmides Talen ont été introduits dans les CSEh (H9, WA09) à l&#39;aide de notre nucléofection et protocole de sélection clonale et l&#39;entretien des CSEh a été réalisée sur la base de notre protocole de routine 12. Nous avons confirmé cette ligne de reporter génétique exprimer EGFP pour l&#39;expression de OCT4 dans OCT4 :: EGFP CSEh. Notre résultat démontre que les CSEh individuelles (classés par OCT4 :: cellules fortement positives à l&#39;EGFP) détiennent des niveaux élevés d&#39;expression de OCT4, mais différents niveaux d&#39;expression de NANOG. Ainsi, notre analyse de l&#39;expression des gènes de la cellule unique devrait être utile d&#39;étudier les hétérogénéités de la population de cellules souches pluripotentes.

<table><tbody><tr><td>Plaque PCR 96 puits</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Cell Lysis Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Transcriptase inverse</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polymérase Haute fidélité</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, PCR Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu ; l DNase, filtre stérilisé</td></tr><tr><td>35 &mu ; Tubes de capuchon de crépine de cellule m</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage individuel embryonnaires humaines cellules souches par rt-pcr quantitative

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

L&#39;hétérogénéité de la population des cellules souches entrave compréhension détaillée de la biologie des cellules souches, telles que leur propension de différenciation vers les différentes lignées. Une analyse du transcriptome d&#39;une cellule unique peut être une nouvelle approche pour disséquer la variation individuelle. Nous avons développé la méthode qRT-PCR seule cellule, et a confirmé que cette méthode fonctionne bien dans plusieurs profils d&#39;expression génique. En niveau de la cellule unique, chaque cellule souche embryonnaire humaine, triées par OCT4 :: cellules positives à l&#39;EGFP, a une forte expression dans OCT4, mais un niveau d&#39;expression de NANOG différente. Notre analyse de l&#39;expression des gènes de la cellule unique devrait être utile pour interroger des hétérogénéités de la population.

Efficace et robuste simple amplification de l&#39;ARN cellulaire Pour minimiser la variation de la transcription chez les CSEh, nous avons utilisé OCT4 :: EGFP CSEh clone pour la purification FACS. Après le tri oct4 :: cellules positives à l&#39;EGFP dans une plaque de 96 puits, chaque cellule est lysée dans un tampon de lyse et converti poly (A) + ARN à ADNc pleine longueur à l&#39;aide SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) amorce et d&#39;ancrage av...

Un seul dosage de l&#39;expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser les niveaux d'expression génique de cellules souches embryonnaires humaines individuelles à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel après transcription inverse en une cellule unique, ou R-T-P-C-R. Cette analyse est réalisée en premier lieu par tri cellulaire activé par fluorescence afin de séparer des cellules individuelles dans chaque puits d'une plaque 96 puits contenant un tampon de lyse cellulaire. La deuxième étape consiste à rétrotranscrire l'ARN afin de générer de l'ADNc à partir de lysats cellulaires uniques.Ensuite, l'ADNc est amplifié par réaction en chaîne par polymérase. La dernière étape consiste à effectuer une RT-PCR quantitative sur l'ADNc amplifié. En définitive, ce dosage est utile pour l'étude de l'expression génique dans des populations hétérogènes telles que les cellules souches embryonnaires humaines.Le principal avantage de cette technique par rapport aux systèmes artificiels quantitatifs unicellulaires existants réside dans le fait que cette méthode est plus robuste que l'EEG avant la purification par fax. Les cellules souches embryonnaires humaines OCT4-EGFP ou Hess sont détachées de la boîte de 60 millimètres. Éliminer tout le milieu, ajouter un millilitre d'Accutase et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.Neutralisez l'Accutane avec un millilitre de milieu ES humain centrifugé pour former un culot cellulaire, puis après avoir éliminé le surnageant, resuspendez les cellules dans un tampon fax et ajustez la concentration à 1 × 10⁶ cellules par millilitre. Ensuite, faites passer l'échantillon cellulaire à travers un tube conique muni d'un tamis cellulaire de 35 µm. Conservez le tube sur de la glace avant le tri cellulaire.Commencez cette procédure en préparant un mélange maître contenant un microlitre de D Ns unicellulaire et neuf microlitres de solution de lyse unicellulaire. Pour chaque puits, transférez 10 microlitres du mélange dans chaque puits d'une plaque PCR 96 puits destinée au programme d'analyse par fax. Utilisez le trieur cellulaire pour trier les cellules EGFP positives uniques dans les puits de la plaque PCR 96 puits. Après le tri cellulaire, incubez les échantillons cinq minutes à température ambiante pour permettre la lyse cellulaire. Pour arrêter la réaction de lyse, ajoutez un microlitre de solution d'arrêt et incubez deux minutes à température ambiante.Pour commencer cette procédure, ajouter d'abord dans chaque puits de la plaque de 96 puits 0,5 microlitre d'Eloqua contenant des amorces SMAT 15 et SMAA à 20 micromolaire. Chauffer les échantillons à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis ajouter quatre microlitres de tampon 5 x, deux microlitres de DTT, un microlitre de transcriptase inverse et un microlitre de D et tps.Effectuer la transcription inverse dans chaque puits à l’aide d’un thermocycleur. Régler le programme thermique à 42 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour inactiver la transcriptase inverse une fois la transcription inverse terminée, ajouter quatre microlitres de réactif exo à chaque échantillon d’ADNc, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes afin de digérer les excès d’oligonucléotides, suivi d’une étape à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes.Pour inactiver le réactif exo, préparez le mélange de réaction PCR avec deux nanomolaires du primaire SMAP2. Ajoutez 10 microlitres du mélange de réaction PCR à chaque échantillon ayant fait l'objet d'une transcription inverse.Réalisez l'amplification en effectuant 20 cycles de dénaturation, d'hybridation et d'extension. Après l'amplification des échantillons, réalisez deux séries de réactions de RT-PCR quantitative sur des plaques séparées afin de confirmer les résultats de RT-PCR. Dans chaque puits des deux plaques de 96 puits, ajoutez 10 microlitres de Green Cyber à 2 x, 1 microlitre d'ADNc amplifié, deux amorces et 7 microlitres d'eau. Réglez le programme sur 95 degrés Celsius pendant trois secondes, suivi de 60 degrés Celsius pendant 30 secondes.Pendant 40 cycles, une étape de préincubation est supprimée afin de réduire l'erreur liée à l'amorce. Dans cette étude, des quantités en microgrammes d'ARN total de Hess ont été diluées jusqu'à des niveaux de nanogrammes et de picogrammes afin d'évaluer la variabilité technique et la détection de différences pour de faibles quantités d'ARN total. Une RT-PCR quantitative du gène G-A-P-D-H a été réalisée à l'aide d'ARNm provenant de tiges regroupées, diluées en série de 10 nanogrammes par microlitre à 0,1 picogramme par microlitre. Chaque point représente la valeur de CT d'ARNm dilué en série et d'ARNm de cellule unique trié par FACS.Une corrélation a été observée entre chaque échantillon et les résultats de la PCR en temps réel, plusieurs cellules uniques présentant des valeurs de CT similaires. La FACS a été utilisée pour trier et sélectionner les cellules fortement positives à l'EEG FP à partir d'une lignée de CSH rapporteur OCT4-EGFP. Les résultats montrent une population positive à l'EGFP d'environ 60 % par rapport à la population négative, permettant de valider la cohérence entre différents lots de réactions de transcription inverse et d'amplification.Des lysats cellulaires simples purifiés par Fax ont été divisés en deux moitiés, et le protocole a été appliqué à chaque moitié pour des comparaisons par lots. Une corrélation significative entre la valeur de CT d’OCT quatre de chaque moitié des lysats cellulaires simples a été observée. Une représentation sous forme de carte thermique de l'expression génique dans une enveloppe unique montre un niveau constant et robuste d'expression d’OCT quatre, mais des niveaux variables d’un autre gène marqueur de cellules souches, NAN og. Dans leur ensemble, nos résultats démontrent que cet essai d'expression génique au niveau de la cellule unique est utile pour l'étude des hétérogénéités au sein des populations de cellules souches pluripotentes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser correctement le QITP pour le transcriptome unicellulaire.

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