Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

L’objectif global de cette procédure est de profiler les niveaux d’expression génique de cellules souches embryonnaires humaines individuelles à l’aide de la transcription inverse quantitative en chaîne (R-T-P-C-R). Pour ce faire, on utilise d’abord le tri cellulaire activé par fluorescence pour trier les cellules individuelles dans chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant un tampon de lyse cellulaire. La deuxième étape consiste à inverser la transcription de l’ARN pour générer de l’ADNC à partir de lysats de cellules uniques.

Ensuite, l’ADNC est amplifié par la réaction en chaîne par polymérase. La dernière étape consiste à effectuer un R-T-P-C-R quantitatif sur l’ARNC amplifié. En fin de compte, ce test est utile pour étudier l’expression des gènes dans des populations hétérogènes telles que les cellules souches embryonnaires humaines.

Le principal avantage de cette technique par rapport au vaisseau artificiel quantitatif unicellulaire existant est que cette méthode, EEG et plus robuste avant la purification par fax. Les quatre cellules souches embryonnaires humaines OCT EGFP ou Hess sont détachées de la boîte de 60 millimètres. Retirer tout le milieu, ajouter un millilitre d’Accutane et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Neutralisez Accutane avec un millilitre de centrifugeuse de média ES humain pour granuler les cellules après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans le tampon de télécopie et ajustez la concentration à une fois 10 à six cellules par millilitre. Ensuite, faites passer l’échantillon de cellule à travers un tube de capuchon de crépine de 35 micromètres. Conservez le tube sur de la glace avant de trier les cellules.

Commencez cette procédure en préparant un mélange maître contenant un microlitre de D Ns unicellulaire et neuf microlitres de solution de lyse unicellulaire. Pour chaque puits, transférez 10 microlitres de la solution mélangée dans chaque puits d’une plaque PCR à 96 puits pour le programme d’analyse par télécopie, le trieur de cellules pour trier les cellules EGFP positives uniques dans les puits de la plaque PCR à 96 puits après le tri cellulaire, incubez les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante pour la lyse cellulaire. Pour arrêter la réaction de lyse, ajoutez un microlitre de solution d’arrêt et incubez à température ambiante pendant deux minutes.

Pour commencer cette procédure, ajoutez d’abord à chaque puits de la plaque à 96 puits un Eloqua de 0,5 microlitre de 20 amorces SMAT 15 micromolaires et SMAA. Chauffez les échantillons à 80 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite quatre microlitres de tampon cinq x, deux microlitres de DTT, un microlitre de transcriptase inverse et un microlitre de D et tps.

Pour chaque puits effectuer la transcription inverse dans un thermocycleur. Réglez le programme thermique à 42 degrés Celsius pendant 90 minutes, suivi de 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour inactiver la transcriptase inverse lorsque la transcription inverse est terminée, ajoutez quatre microlitres de réactif exo à chaque échantillon d’ADNC incubé à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour digérer les glissements d’oligonucléotides en excès, suivi de 80 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Pour inactiver le réactif exo, préparez le mélange réactionnel PCR avec deux nanomolaires de l’amorce SMAP deux. Ajouter 10 microlitres de mélange de réaction PCR. À chaque échantillon transcrit à l’envers.

Effectuez l’amplification composée de 20 cycles de dénaturation, d’un agenouillement et d’une extension après amplification des échantillons effectués deux séries de réactions quantitatives R-T-P-C-R dans des plaques séparées pour confirmer les résultats R-T-P-C-R à chaque puits des 2 plaques de 96 puits ajouter 10 microlitres de deux x cyber vert. Master Mix PCR : un microlitre de CDNA amplifié, deux amorces et sept microlitres d’eau. Réglez le programme sur 95 degrés Celsius pendant trois secondes, suivi de 60 degrés Celsius pendant 30 secondes.

Pendant 40 cycles, le pas d’agenouillement est supprimé pour réduire l’erreur d’amorçage. Dans cette étude, des quantités de microgrammes d’ARN total de Hess ont été diluées à des niveaux nanométriques et picogrammes pour évaluer la variabilité technique et la détection de différences sur de faibles quantités d’ARN total R-T-P-C-R quantitatif du gène G-A-P-D-H a été réalisé à l’aide de l’IRM. NA des enveloppes regroupées diluées en série de 10 nanogrammes par microlitre à 0,1 picogramme par microlitre. Chaque point indique la valeur CT de l’ARNm dilué en série et de l’ARNm unicellulaire triés par télécopieur.

Une corrélation a été observée entre chaque échantillon et les résultats du QR TPCR, plusieurs cellules uniques présentant des valeurs CT similaires. La télécopie a été utilisée pour trier et sélectionner les cellules positives à l’EEG FP à partir d’une ligne HESC rapporteuse EGFP à quatre OCT. Les résultats montrent une population EGFP positive d’environ 60 % par rapport à la population négative pour valider la cohérence entre différents lots de réactions de transcription inverse et d’amplification.

Les lysats unicellulaires purifiés par télécopieur ont été divisés en deux moitiés et le protocole a été appliqué à chaque moitié pour les comparaisons de lots. Une corrélation significative entre la valeur CT de l’OCT quatre de chaque moitié de lysats unicellulaires a été observée. Une présentation de la carte thermique de l’expression du gène de l’enveloppe unique montre un niveau cohérent et robuste d’expression de l’OCT quatre, mais des niveaux variables d’un autre gène marqueur de cellules souches, NAN og pris ensemble, nos résultats démontrent que ce test d’expression génique unicellulaire est utile pour étudier les hétérogénéités de population de cellules souches pluripotentes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer correctement le QITP pour le transcriptome de cellule unique.