Human neutrophiles Chambre flux Essai d'adhésion

L’objectif global de cette procédure est de mesurer l’adhérence ferme des neutrophiles à l’aide d’un test en chambre d’écoulement qui permet l’adhésion des neutrophiles humains en présence d’une contrainte de cisaillement. Ceci est accompli en préparant d’abord un substrat de molécules d’adhésion purifiées ou une surface de cellule endothéliale, telle que la veine ombilicale humaine, les cellules endothéliales, ou ve. La deuxième étape consiste à séparer les neutrophiles du sang périphérique humain à l’aide d’une méthode de centrifugation à deux couches d’appel PHI.

Ensuite, la chambre d’écoulement est assemblée pour permettre l’injection des neutrophiles humains isolés sous contrainte de cisaillement sur le substrat d’adhésion, de ligands ou de ve. La dernière étape consiste à enregistrer les événements d’adhésion des neutrophiles dans la chambre d’écoulement, suivis d’une quantification minutieuse de l’adhésion ferme. En fin de compte, le test de la chambre d’écoulement est utilisé pour montrer une adhésion ferme des neutrophiles vers des molécules d’adhésion purifiées et une surface HX.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’auto-immunité, telles que l’importance fonctionnelle des variations génétiques dans un tissu, des molécules connues pour être associées au développement de l’auto-immunité. Des études génétiques chez des patients atteints de lupus érythème disséminé ont mis en évidence une forte association avec des variants et l’intégrine Abeta two, une protéine impliquée dans l’adhésion ferme des neutrophiles. Nous avons développé ce système de test pour évaluer les conséquences fonctionnelles de la variation génétique chez ce bêta deux endocrinien appelé Mac un sur l’adhésion ferme pour préparer les plats de culture à utiliser dans la chambre d’écoulement.

Ajoutez un millilitre d’une solution de fibrine et de gélatine dans chaque plat de culture tissulaire de 35 millimètres et pipetez plusieurs fois pour vous assurer que toute la surface de la plaque est recouverte. Retirez l’excès de solution de fibronectine et de gélatine et faites sécher les plaques à l’air libre pendant au moins 30 minutes. Pour optimiser la formation de la matrice protéique, récoltez des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ou qve qui ont été cultivées à 80 à 90 % de confluence à l’aide de trypsine EDTA et grainez 500 000 cellules dans chaque boîte de culture de tissus enrobée.

Ajoutez deux millilitres de milieu de croissance dans chaque plat et incubez à 37 degrés Celsius. Les cellules de CO2 à 5 % doivent être inspectées visuellement quotidiennement avec des changements de milieu tous les deux jours. Laissez les cellules croître jusqu’à 80 à 90 % de confluence.

Pour commencer cette procédure, utilisez un marqueur ou un stylo pour dessiner un cercle de 0,5 centimètre de diamètre au centre d’une plaque de culture tissulaire de 35 millimètres. 20 microlitres d’une protéine de 20 microgrammes par millilitre, une solution dans la zone marquée. Utilisez la pointe de la pipette pour étaler la protéine, une solution pour couvrir toute la zone à l’intérieur du cercle de 0,5 centimètre de diamètre.

Il est important de ne pas toucher ou rayer la surface du plat. Incuber les boîtes de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lavez chaque protéine une plaque enrobée trois fois avec un millilitre de PBS.

Après avoir retiré le PBS de la troisième plaque de lavage, 50 microlitres de 1 % BSA dans la zone marquée pour bloquer la liaison non spécifique sur la plaque. Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Au bout de deux heures.

Lavez la plaque bloquée trois fois avec un millilitre de PBS. Préparez les solutions de protéines chimériques du ligand du récepteur d’adhésion FC pour l’enrobage et cette expérience et ICAM un FC Kyra à 25 microgrammes par millilitre et un P selectin FC Kyra à 0,5 microgrammes par millilitre seront utilisés. Enduire la zone marquée de 50 microlitres de substrat, incuber les boîtes de culture tissulaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

La vaisselle doit être utilisée dans les deux jours et la zone enduite ne doit pas se dessécher. Si besoin est. Ajouter du PBS pour maintenir les 50 microlitres de solution sur la plaque.

Pour cette étude, les neutrophiles sont isolés dans le sang des participants qui ont donné un consentement éclairé écrit. Après avoir prélevé du sang par phlébotomie dans un tube de prélèvement sanguin anticoagulant ou un vacutainer, diluez le sang un à un avec PBS effectuez toutes les étapes de cette procédure. À température ambiante, préparez un appel phy à deux couches pour séparer les cellules mononucléées du sang périphérique ou p BMC et les neutrophiles dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres.

Tout d’abord, ajoutez 15 millilitres d’appel PHI lourd, puis superposez soigneusement 10 millilitres d’appel fi léger sur l’appel fi lourd. Il doit y avoir une frontière nette entre les couches d’appel fi léger et d’appel fi lourd. Enfin, superposez soigneusement 25 millilitres de l’échantillon de sang dilué sur l’appel de lumière sans perturber le DAIS.

Appelez la couche centrifuger les tubes pendant 30 minutes à température ambiante après la centrifugation, plusieurs couches doivent être présentes. La couche de neutrophiles avec peu de globules rouges se situe entre le phi léger et lourd. Appelez à l’aide d’une pipette de transfert pour prélever et transférez la couche de neutrophiles dans un nouveau tube de 50 millilitres et ajoutez du PBS à un volume final de 50 millilitres.

Centrifuger à 225 fois G pendant 10 minutes. À température ambiante après la centrifugation, il peut encore y avoir des globules rouges mélangés aux neutrophiles. Aspirez le surnageant jusqu’à 10 millilitres.

Mark Resus. Suspendez brièvement la pastille de globule rouge neutrophile en tourbillonnant à basse vitesse, puis lavez-la à nouveau avec 50 millilitres de PBS pour aspirer le surnageant afin d’éliminer les globules rouges contaminants. Remettre en suspension les cellules granulées dans le PBS résiduel par un bref vortex à basse vitesse.

Ajouter 25 millilitres d’eau et agiter doucement pendant 10 secondes. Aux poux. Les globules rouges ajoutent 25 millilitres de chlorure de sodium à 1,8 % et se mélangent immédiatement par centrifugation à 225 fois G pendant 10 minutes.

Les globules rouges contaminants doivent maintenant être allongés, laissant une pastille de cellules neutrophiles blanches. Lavez la pastille de cellules neutrophiles avec du PBS, jetez le surnageant et remettez en suspension les neutrophiles isolés dans un milieu RPMI avec 10 % FBS. Après avoir déterminé la concentration cellulaire au microscope optique à l’aide d’un hémocytomètre, ajustez la densité cellulaire à 500 000 cellules par millilitre avec un milieu RPMI 10 % FBS complet.

Avant de commencer le test d’adhésion en chambre d’écoulement, amorcez l’EV avec 20 nanogrammes par millilitre de TNF alpha humain pendant quatre à six heures pour réguler à la hausse et stimuler l’expression des molécules d’adhésion. Lorsque les VE sont prêts, assemblez la chambre d’écoulement. Placez la parabole de 35 millimètres contenant l’EV confluent sur la table du microscope.

Pour les besoins de cette vidéo, seule l’adhésion des neutrophiles à l’EV sera examinée, mais la même procédure s’applique à l’étude de l’adhésion des neutrophiles aux molécules d’adhésion purifiées, relie la chambre d’écoulement à plaques parallèles à la pompe à seringue et au système de vide et laisse une ligne ouverte pour l’entrée des neutrophiles. Insérez la chambre d’écoulement sur le dessus de la plaque et fixez l’ensemble de la chambre d’écoulement. Démarrez le programme d’enregistrement vidéo sur l’ordinateur connecté au microscope.

Ajustez le champ et la mise au point du microscope jusqu’à ce qu’un champ clair avec une EV complètement développée soit visible. À l’aide de la pompe à seringue, rincez la chambre d’écoulement avec un fluide RPMI. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur de la chambre ou de la ligne d’entrée des neutrophiles.

À l’aide de l’exhoche-seringue, injectez les neutrophiles dans la chambre d’écoulement à des vitesses définies. Enregistrer la vidéo Parce que l’adhésion des neutrophiles peut se produire rapidement, une vidéo de quatre à cinq minutes est généralement suffisante pour quantifier les événements d’adhésion à des fins d’analyse. Ce clip vidéo montre un exemple de liaison de neutrophiles à une chambre d’écoulement revêtue de HU E.

Une cellule adhérente est définie comme une cellule qui se déplace de moins d’un diamètre de cellule en cinq secondes. Sur la surface revêtue HU e. Voici des captures d’écran à différents moments d’exemples de vidéos d’échantillons de neutrophiles adhérant à une surface revêtue d’un sélectin ICAM ou d’une surface revêtue d’UVE.

Dans les deux expériences, la vitesse d’écoulement des neutrophiles est de 350 microlitres par minute avec une densité de neutrophiles de 500 000 cellules par millilitre. Dans des conditions typiques, il a été observé que 50 à 70 neutrophiles humains adhéraient fermement à la surface recouverte d’un ligand ou d’une EV pendant une période d’enregistrement de quatre minutes. Cependant, les variants alléliques des molécules d’adhésion des neutrophiles ou les variants alléliques dans le substrat pourraient modifier considérablement l’adhésion quantitative des neutrophiles en enregistrant des vidéos de longueur similaire avec différents donneurs.

Neutrophiles, le nombre de cellules d’adhérence par minute peut être calculé pour comparer les propriétés d’adhésion entre différents donneurs. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier visuellement les neutrophiles pour le clampage cellulaire causé par l’activation cellulaire induite par l’isolement. De plus, une évaluation cytométrique en flux parallèle de l’activation cellulaire peut être effectuée pour s’assurer que l’état d’activation des cellules correspond entre les donneurs et entre les expériences.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’auto-immunité pour explorer l’adhésion cellulaire dans les cellules humaines primaires à partir de donneurs de génotypes qui ont différents allèles de la région codante de la chaîne CD 11 B de l’intégrine bêta deux, MAC un. Ces études ont permis une évaluation minutieuse et quantitative de l’impact fonctionnel de ces variantes alléliques dans le système humain.