Human neutrophiles Chambre flux Essai d'adhésion

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'adhérence ferme des neutrophiles à l'aide d'un test de chambre à écoulement permettant l'adhérence des neutrophiles humains en présence d'un stress de cisaillement. Cela est réalisé en premier lieu en préparant un substrat composé de molécules d'adhérence purifiées ou d'une surface cellulaire endothéliale, telle que des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ou ve. La deuxième étape consiste à isoler les neutrophiles à partir de sang périphérique humain en utilisant une méthode de centrifugation sur couche de PHI à deux niveaux.

Ensuite, la chambre à écoulement est assemblée afin de permettre l'injection des neutrophiles humains isolés sous contrainte de cisaillement sur un substrat d'adhésion, de ligands ou de ve. L'étape finale consiste à enregistrer les événements d'adhésion des neutrophiles dans la chambre à écoulement, suivie d'une quantification minutieuse de l'adhésion ferme. En définitive, le test en chambre à écoulement sert à démontrer l'adhésion ferme des neutrophiles vis-à-vis de molécules d'adhésion purifiées et d'une surface HX.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'auto-immunité, notamment l'importance fonctionnelle des variations génétiques dans des molécules tissulaires connues pour être associées au développement de l'auto-immunité. Des études génétiques menées chez des patients atteints de lupus érythémateux systémique ont révélé une association forte avec des variants de l'intégrine Abeta deux, une protéine impliquée dans l'adhésion ferme des neutrophiles. Nous avons mis au point ce système de dosage afin d'évaluer les conséquences fonctionnelles des variations génétiques dans cette endocrine bêta deux appelée Mac-1, sur l'adhésion ferme. Préparer les boîtes de culture pour utilisation dans la chambre d'écoulement.

Ajoutez un millilitre d'une solution de fibrine et de gélatine dans chaque boîte de culture tissulaire de 35 millimètres et pipetez plusieurs fois pour vous assurer que toute la surface de la plaque est recouverte. Éliminez l'excès de solution de fibronectine et de gélatine et laissez sécher les plaques à l'air pendant au moins 30 minutes. Pour optimiser la formation de la matrice protéique, récoltez des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ou des qve cultivées jusqu'à une confluence de 80 à 90 % à l'aide de trypsine-EDTA, puis ensemencez 500 000 cellules dans chaque boîte de culture recouverte.

Ajoutez deux millilitres de milieu de croissance dans chaque boîte et incubez à 37 degrés Celsius. Les cellules en 5 % CO2 doivent être inspectées visuellement chaque jour, avec un renouvellement du milieu tous les deux jours. Laissez les cellules croître jusqu'à une confluence de 80 à 90 %.

Pour commencer cette procédure, utilisez un marqueur ou un stylo pour dessiner un cercle de 0,5 centimètre de diamètre au centre d'une plaque de 35 millimètres pour culture tissulaire. Déposez 20 microlitres d'une solution de la protéine A à 20 microgrammes par millilitre dans la zone marquée. Utilisez la pointe de pipette pour étaler la solution de la protéine A afin de recouvrir entièrement la surface comprise dans le cercle de 0,5 centimètre de diamètre.

Il est important de ne pas toucher ni gratter la surface de la boîte. Incuber les boîtes de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, laver chaque plaque recouverte de protéine a trois fois avec un millilitre de PBS.

Après avoir retiré le PBS du troisième plateau de lavage, ajouter 50 microlitres de BSA à 1 % dans la zone marquée afin de bloquer les liaisons non spécifiques sur la plaque. Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures.

Lavez la plaque bloquée trois fois avec un millilitre de PBS. Préparez les solutions de protéines chimériques de ligands des récepteurs d'adhésion FC pour le revêtement et cette expérience : ICAM-1 FC Kyra à 25 microgrammes par millilitre et P-sélectine FC Kyra à 0,5 microgramme par millilitre seront utilisées. Recouvrez la zone marquée de 50 microlitres de substrat, puis incubez les boîtes de culture tissulaire toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Les boîtes doivent être utilisées dans les deux jours et la zone revêtue ne doit pas être laissée sécher. Si nécessaire, ajouter du PBS pour maintenir un volume de 50 microlitres de solution sur la plaque.

Les neutrophiles utilisés dans cette étude sont isolés à partir du sang de participants ayant donné leur consentement éclairé par écrit. Après prélèvement du sang par phlébotomie dans un tube de collecte contenant un anticoagulant ou un vacutainer, diluez le sang au ratio un pour un avec du PBS en effectuant toutes les étapes de cette procédure. À température ambiante, préparez un gradient de phy à deux couches pour séparer les cellules mononucléées du sang périphérique ou PBMCs et les neutrophiles dans des tubes de centrifugeuse de 50 millilitres.

Tout d'abord, ajoutez 15 millilitres de solution dense de PHI, puis superposez soigneusement 10 millilitres de solution légère de fi sur la solution dense de fi. Une limite nette doit apparaître entre les couches de solution légère et dense de fi. Enfin, superposez soigneusement 25 millilitres de l'échantillon sanguin dilué sur la solution légère de fi sans perturber le gradient de PHI.

Appeler la centrifugation en couche : centrifuger les tubes pendant 30 minutes à température ambiante ; après la centrifugation, plusieurs couches doivent être visibles. La couche de neutrophiles, contenant peu de globules rouges, se situe entre le milieu léger et le milieu dense. Appeler à l’aide d’une pipette de transfert pour récolter et transférer la couche de neutrophiles dans un nouveau tube de 50 millilitres, puis ajouter du PBS jusqu’à un volume final de 50 millilitres.

Centrifuger à 225 ×g pendant 10 minutes. À température ambiante après la centrifugation, des globules rouges peuvent encore être mélangés aux neutrophiles. Aspirer le surnageant jusqu'au volume de 10 millilitres.

Marquez Resus. Suspendez le culot de globules rouges et de neutrophiles en vortexant brièvement à faible vitesse, puis effectuez un nouveau lavage avec 50 millilitres de PBS. Aspirez le surnageant afin d’éliminer les globules rouges contaminants. Resuspendez les cellules en culot dans le PBS résiduel par un vortexage bref à faible vitesse.

Ajoutez 25 millilitres d'eau et vortexez doucement pendant 10 secondes. Aux poux. Ajoutez aux globules rouges 25 millilitres de chlorure de sodium à 1,8 % et mélangez immédiatement par centrifugation à 225 × g pendant 10 minutes.

Les globules rouges contaminants doivent maintenant être lysés, laissant un culot de cellules blanches de neutrophiles. Lavez le culot de neutrophiles avec du PBS, jetez le surnageant et remettez en suspension les neutrophiles isolés dans du milieu RPMI contenant 10 % de FBS. Après avoir déterminé la concentration cellulaire au microscope optique à l’aide d’un hémocytomètre, ajustez la densité cellulaire à 500 000 cellules par millilitre avec le milieu RPMI complet contenant 10 % de FBS.

Avant de commencer le test d'adhérence en chambre à écoulement, préparer les cellules endothéliales (VE) en les traitant avec 20 nanogrammes par millilitre de TNF alpha humain pendant quatre à six heures afin de stimuler et d'up-réguler l'expression des molécules d'adhésion. Lorsque les cellules endothéliales sont prêtes, monter la chambre à écoulement. Placer la boîte de 35 millimètres contenant les cellules endothéliales confluentes sur la platine du microscope.

Pour les besoins de cette vidéo, seule l'adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales VE sera examinée, mais la même procédure s'applique à l'étude de l'adhésion des neutrophiles aux molécules d'adhésion purifiées. Connectez la chambre d'écoulement à plaque parallèle à la pompe à seringue et au système de vide, et laissez une ligne ouverte pour l'entrée des neutrophiles. Insérez la chambre d'écoulement au-dessus de la plaque et fixez l'ensemble de la chambre d'écoulement. Lancez le programme d'enregistrement vidéo sur l'ordinateur connecté au microscope.

Réglez le champ et la mise au point du microscope jusqu'à l'obtention d'un champ clair présentant un VE complètement développé. À l'aide de la pompe à seringue, rincez la chambre d'écoulement avec du milieu RPMI. Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans la chambre ou dans la ligne d'entrée des neutrophiles.

Utilisez la pompe à seringue pour injecter les neutrophiles dans la chambre d'écoulement à des vitesses définies. Enregistrez la vidéo, car l'adhésion des neutrophiles peut survenir rapidement ; une vidéo de quatre à cinq minutes est généralement suffisante pour quantifier les événements d'adhésion en vue de l'analyse. Ce clip vidéo montre un exemple de neutrophiles se liant à une chambre d'écoulement revêtue de HU E.

Une cellule adhérente est définie comme une cellule qui se déplace de moins d'un diamètre cellulaire en cinq secondes. Sur la surface revêtue de HU e. Ci-dessous sont montrées des captures d'écran à différents moments à partir de vidéos échantillons de neutrophiles adhérant à une surface revêtue d'ICAM un P-sélectine, ou à une surface revêtue de uve.

Dans les deux expériences, la vitesse d'écoulement des neutrophiles est de 350 microlitres par minute, avec une densité de 500 000 cellules par millilitre. Dans des conditions typiques, on a observé que 50 à 70 neutrophiles humains adhéraient fermement à la surface revêtue de ligand ou de VE pendant une période d'enregistrement de quatre minutes. Toutefois, des variants alléliques des molécules d'adhérence des neutrophiles ou des variants alléliques du substrat pourraient modifier de façon importante l'adhérence quantitative des neutrophiles en enregistrant des vidéos de durée similaire avec différents donneurs.

Les neutrophiles, le nombre de cellules adhérentes par minute peut être calculé afin de comparer les propriétés d'adhérence entre différents donneurs. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de vérifier visuellement les neutrophiles quant à l'agrégation cellulaire provoquée par une activation des cellules induite lors de l'isolement. En outre, une évaluation parallèle de l'activation cellulaire par cytométrie en flux peut être réalisée afin de s'assurer que l'état d'activation des cellules est comparable entre les donneurs et entre les expériences.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'auto-immunité pour explorer l'adhésion cellulaire dans des cellules humaines primaires provenant de donneurs de génotype ayant différents allèles de la région codante de la chaîne CD 11 B de l'intégrine bêta deux, MAC 1. Ces études ont permis une évaluation minutieuse et quantitative de l'impact fonctionnel de ces variants alléliques dans le système humain.