Suivi d'activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

Les défenses innées contre les infections virales sont déclenchées par les récepteurs de reconnaissance de formes ou SDRP. Présent dans les cellules du système immunitaire inné lors d’une infection. Le SDRP cytoplasmique, l’œil et la PKR se lient à la signature virale, les ARN modifient la confirmation de tous les liga oculaires et activent la signalisation antivirale pour surveiller les changements de confirmation de l’œil et de la PKR et toutes les ligamentisations in vitro des cellules humaines A 5 49 sont infectées par le virus de la fièvre de la vallée du Rift.

Clonez 13 pour stimuler l’activation du PRR. Les lysats cellulaires des cellules témoins et infectées sont ensuite préparés pour être analysés afin de détecter les changements de confirmation de l’œil et de la PKR. Une digestion à base d’tryine limitée est effectuée.

Si des changements confirmés dans la structure de la protéine se sont produits, la protéine est plus résistante à la digestion et des bandes seront observées avec l’analyse par transfert Western pour analyser la formation de la page native allgas est effectuée suivie d’une analyse par transfert Western. Si toute la ligamentisation s’est produite plus haut, tous les complexes liga rig eye et PKR sont observés. Le principal avantage de la digestion limitée des protéases et de la page native est que ces techniques facilitent la mesure directe de l’activation de la rega et de la PKR.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunité innée, telles que la nature et l’origine exactes des espèces d’ARN pertinentes pour l’activation de l’œil et de la PKR. Ces méthodes peuvent donner un aperçu des agonistes de l’œil de forage et de la PKR. Ils peuvent également être appliqués à d’autres protéines de capteurs cytoplasmiques telles que MDA cinq, démontrant que la procédure sera par Mila Viva, une étudiante au doctorat de mon laboratoire.

Veuillez noter que le clone 13 du virus de la fièvre de la vallée du Rift, ci-après dénommé CL 13, est un mutant viral atténué qui, en Allemagne, doit être manipulé dans deux conditions BSL pour préchauffer le milieu libre de sérum PBS et le milieu de culture cellulaire contenant 5 % de FCS. Placez-les dans un bain-marie dans un micro-tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Préparer 1,25 fois 10 à la septième PFU par millilitre de CL 13 dans un milieu libre sérique pour infecter 2,5 fois 10 à la sixième.

5 cellules de 49 avec une multiplicité d’infection ou un moment d’inertie de cinq préparent environ 10 % de plus que nécessaire pour tenir compte des erreurs de pipetage. Retirez les cellules A 5 49 de l’incubateur, aspirez le milieu et ajoutez 10 millilitres de tourbillon de PBS ou inclinez le ballon de culture pour laver les cellules, puis retirez le PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre de CL 13 dilué ou pour le contrôle non infecté ou l’infection simulée.

Ajoutez un millilitre de milieu sans sérum et incubez pendant une heure toutes les 15 minutes. Inclinez délicatement le ballon pour assurer une répartition uniforme du fluide. Après une heure d’infection, retirez l’oculaire.

Ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cellulaire préchauffé avec 5 % de FCS et incubez pendant cinq heures. Préparez du PBS avec 0,5 % de tritton X 100 et placez-le à quatre degrés Celsius. N’ajoutez pas d’inhibiteurs de la protéase syrienne.

Ensuite, lavez les cellules avec du PBS froid et ajoutez 10 millilitres de PBS frais. Ensuite, à l’aide d’un grattoir à cellules, détachez les cellules de la parabole. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 800 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.

Après l’essorage, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 30 microlitres de PBS avec 0,5 % Triton X 100. Transférez le lysat dans un tube frais de 1,5 millilitre et incubez pendant au moins 10 minutes sur de la glace. Centrifugez le lysat à 10 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, transférez le lysat cellulaire clarifié dans un tube frais. Effectuer un test Bradford pour déterminer la concentration en protéines dans le lysat cellulaire clarifié Stocker à moins 20 degrés Celsius ou procéder immédiatement à l’essai de digestion ou de test natif pour détecter les changements de confirmation des récepteurs de reconnaissance de formes diluer d’abord L un tosto chloro, méthyl cétone traité ou TPCK trypsine dans PBS à une concentration de travail finale de deux microgrammes par millilitre dans deux nouveaux tubes pour chaque condition, ajuster la concentration finale en protéines du CL 13 et des lysats de protéines témoins non infectées à 25 microgrammes dans un volume final de neuf microlitres avec du PBS, un ensemble de lysats sera utilisé comme témoin d’entrée et l’autre sera traité avec de la trypsine TPCK dans les tubes témoins non traités. Ajoutez un microlitre de PBS dans les deux tubes restants.

Ajoutez un microlitre de deux microgrammes par microlitre de trypsine TPCK pour porter la concentration finale à 0,2 microgramme par microlitre. Mélanger les réactions par pipetage. Incuber les lysats à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.

Arrêtez la réaction en ajoutant cinq tampons d’échantillon dénaturants, puis en les faisant bouillir pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius. Il est important de ne pas prolonger le temps d’incubation de la trypsine. Notez que le moment précis de la digestion de la trypsine est essentiel pour la détection de fragments résistants sans aucun bruit de fond si des protéines résistantes ne sont pas détectées ou si trop de protéines sont détectées, la durée de la digestion est ajustée. En conséquence.

Après ébullition, conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius ou chargez-les sur deux docal sulfate de sodium. Gels de polyacrylamide composés d’un gel empilable à 5 % sur un gel résolutif à 12 %. Séparez les protéines à 25 milliampères par gel jusqu’à ce que le bleu de bromo phénol soit épuisé.

Après avoir exécuté les gels, transférez les protéines d’un gel à une membrane de fluorure de poly vine et analysées par western blot avec des anticorps dirigés contre l’œil rig et PKR colorez l’autre gel avec kumasi brilliant blue G two 50. Ensuite, stockez le gel dans de l’éthanol à 25 %, de l’acide acétique à 8 % et du glycérol à 4 % à quatre degrés Celsius ou procédez à l’imagerie et à l’analyse. Pour analyser les états oligomères des récepteurs de reconnaissance de formes, préparez 50 microgrammes de lysat cellulaire dans un volume final de 10 microlitres avec du PBS et ajoutez cinq tampons d’échantillon x à une concentration finale de un x.

Chargez immédiatement les échantillons sur un gel de polyacrylamide natif avec un gel d’empilement de 5 % et un gel de résolution de 8 %. Tout retard entraînera une perte de complexes natifs. Faites fonctionner le gel à 20 milliampères par gel à quatre degrés Celsius.

Arrêter l’électrophorèse 45 minutes après que la bande bleue de Bromo phénol a quitté le gel après un total d’environ 1,5 à deux heures par exécution Un transfert Western à l’aide d’anticorps dirigés contre l’œil du rig et la PKR comme décrit dans le document d’accompagnement pour le dosage de la commutation de confirmation et l’oligo induit par la reconnaissance d’un agoniste viral par l’œil du rig ou la digestion limitée de la protéase PKR et la digestion de la protéase native ont été effectuées comme décrit dans cette vidéo, La digestion à la trypsine des lysats cellulaires infectés simulés a entraîné une dégradation rapide de l’œil de RIG, tandis que l’infection par le clone 13 a conduit à la génération d’un fragment d’œil de RIG résistant de 30 kilodaltons. PKR montre également une résistance partielle à la digestion de la tripsine dans les échantillons infectés, ce qui coïncide avec sa phosphorylation pour surveiller l’efficacité et la spécificité des gels de digestion de la tripsine ont été colorés au bleu brillant kumasi G deux 50. Les échantillons non traités montrent des quantités égales de protéines chargées, soumettant les lysats de cellules C13 à des tripsdans la digestion conduit à une diminution comparable des quantités globales de protéines.

Cela démontre que le traitement par tripsine a la même efficacité pour les échantillons fictifs et infectés par le CL 13 dans des cellules non infectées. Seuls les monomères de R, EYE et PKR ont été détectés comme contrôle supplémentaire. Le facteur de transcription IRF three a été inclus, qui est présent sous forme de monomère, mais connu pour se dimériser lors de l’activation via R Eye.

L’infection par le clone 13 conduit à une forte accumulation de complexes oligomériques oculaires sous la forme d’un frottis et de trois dimères ou oligomères PKR et IRF sous la forme d’une bande protéique définie. Ces résultats démontrent que des voyages limités dans la digestion et la page native sont des outils utiles pour surveiller les changements de confirmation et la formation d’oligo de l’œil de rig et de la PKR lors de l’infection. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller la commutation et l’isation de confirmation WIC eye et PKR une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée dans les deux jours suivant cette procédure. Des méthodes telles que les tests professionnels peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’existence d’une interaction stable avec le ligand stimulant après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunité innée pour explorer l’état d’activation des récepteurs de reconnaissance de formes dans les cellules stimulées par le virus.