Suivi d'activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

Les défenses innées contre les infections virales sont déclenchées par des récepteurs de reconnaissance de motifs, ou RRM, présents dans les cellules du système immunitaire inné lors d'une infection. Les RRM cytoplasmiques, RIG-I et PKR, se lient aux ARN caractéristiques viraux, modifient leur conformation à la suite de la liaison à leurs ligands et activent des voies de signalisation antivirales. Afin de surveiller les changements conformationnels de RIG-I et de PKR ainsi que leur ligandisation in vitro, des cellules humaines A549 sont infectées par le virus de la fièvre de la vallée du Rift.

Cloner 13 afin de stimuler l'activation des RPR. Des lysats cellulaires de cellules témoins et infectées sont ensuite préparés pour analyser les changements conformationnels de Rig-I et de la PKR. Une digestion limitée à la trypsine est réalisée.

Si des modifications conformationnelles dans la structure de la protéine se sont produites, la protéine est plus résistante à la digestion et des bandes seront visibles lors de l'analyse par immunotransfert. Pour analyser la formation de la protéine native, une électrophorèse native est réalisée, suivie d'une analyse par immunotransfert. Si une totalité de ligandisation s'est produite, des complexes alliga rig eye et PKR plus élevés sont observés. Le principal avantage de la digestion limitée par protéase et de l'électrophorèse native est que ces techniques permettent la mesure directe de l'activation de rega et de PKR.

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunité innée, comme quelle est la nature exacte et l'origine des espèces d'ARN pertinentes pour l'activation de rig eye et de PKR. Ces méthodes peuvent fournir des informations sur les agonistes de rig eye et de PKR. Elles peuvent également être appliquées à d'autres protéines capteurs cytoplasmiques telles que MDA cinq, illustrant ainsi que la procédure sera réalisée par Mila Viva, étudiante en doctorat de mon laboratoire, avant le début de cette procédure.

Veuillez noter que le virus de la fièvre de la vallée du Rift, clone 13, désigné ci-après par CL 13, est un mutant viral atténué, qui doit être manipulé en Allemagne selon les conditions de niveau de sécurité biologique 2 (BSL-2), afin de préchauffer le milieu PBS sans sérum et le milieu de culture cellulaire contenant 5 % de FCS. Placez-les dans un bain-marie dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Préparez une concentration de 1,25 fois 10 à la puissance 7 PFU par millilitre de CL 13 dans un milieu sans sérum afin d'infester 2,5 fois 10 à la puissance 6 cellules.

Des cellules A 5 49 avec une multiplicité d'infection ou MOI de cinq préparent environ 10 % de plus que nécessaire pour tenir compte des erreurs de pipetage. Retirer les cellules A 5 49 de l'incubateur, aspirer le milieu et ajouter 10 millilitres de PBS ; tourner ou incliner le flacon de culture pour laver les cellules, puis éliminer le PBS. Ensuite, ajouter un millilitre du CL 13 dilué ou, pour le témoin non infecté, une infection factice.

Ajoutez un millilitre de milieu sans sérum et incubez pendant une heure toutes les 15 minutes. Inclinez délicatement le flacon pour assurer une répartition uniforme du milieu. Après une heure d'incubation, retirez l'inoculum.

Ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cellulaire préchauffé contenant 5 % de FCS, puis incubez pendant cinq heures. Préparez du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 et placez-le à quatre degrés Celsius. N'ajoutez pas d'inhibiteurs de protéase syriens.

Ensuite, lavez les cellules avec du PBS froid et ajoutez 10 millilitres de PBS frais. Puis, à l’aide d’un grattoir à cellules, détachez les cellules de la boîte. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 800 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, retirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans 30 microlitres de PBS contenant 0,5 % de Triton X-100. Transférez le lysat dans un tube neuf de 1,5 millilitre et incubez pendant au moins 10 minutes sur de la glace. Centrifugez le lysat à 10 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, transférez le lysat cellulaire clarifié dans un tube neuf. Réalisez un dosage de Bradford afin de déterminer la concentration en protéines du lysat cellulaire clarifié. Conservez à moins 20 degrés Celsius ou procédez immédiatement à la trypsine ou au PAGE natif pour analyser les modifications conformationnelles des récepteurs de reconnaissance de motifs. Diluez d'abord la trypsine traitée au chlorométhylcétone ou TPCK dans le PBS à une concentration finale de travail de deux microgrammes par millilitre dans deux nouveaux tubes pour chaque condition. Ajustez la concentration finale en protéines des lysats protéiques CL13 et des témoins non infectés à 25 microgrammes dans un volume final de neuf microlitres avec du PBS. Un jeu de lysats servira de témoin d'entrée, l'autre sera traité avec la trypsine TPCK, tandis que les deux tubes témoins restants seront ajoutés à un microlitre de PBS.

Ajouter un microlitre de trypsine TPCK à deux microgrammes par microlitre afin d'obtenir une concentration finale de 0,2 microgramme par microlitre. Mélanger les réactions à l’aide d’une pipette. Incuber les lysats à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.

Arrêter la réaction en ajoutant un tampon d'échantillonnage dénaturant cinq fois (5x) puis en portant à ébullition pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius. Il est important de ne pas prolonger le temps d'incubation avec la trypsine. Remarque : le respect précis du temps de digestion par la trypsine est essentiel pour détecter les fragments résistants sans fond parasite ; si les protéines résistantes ne sont pas détectées ou si leur nombre est excessif, ajuster la durée de digestion en conséquence.

Après ébullition, conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius ou charger les échantillons sur deux gels de dodécylsulfate de sodium polyacrylamide composés d'un gel de concentration à 5 % placé au-dessus d'un gel de séparation à 12 %. Séparer les protéines à 25 milliampères par gel jusqu'à ce que le bleu de bromophénol sorte du gel.

Après la migration sur gel, transférez les protéines d'un gel vers une membrane de fluorure de polyvinyle et analysez-les par immunobuvardage avec des anticorps dirigés contre rig eye et PKR ; coloriez l'autre gel avec le bleu brillant de Coomassie G-250. Ensuite, conservez le gel à 4 °C dans une solution contenant 25 % d'éthanol, 8 % d'acide acétique et 4 % de glycérol, ou procédez directement à l'acquisition d'images et à l'analyse. Pour analyser les états oligomériques des récepteurs de reconnaissance de motifs, préparez 50 microgrammes de lysat cellulaire dans un volume final de 10 microlitres avec du PBS et ajoutez du tampon d'échantillonnage 5 x pour obtenir une concentration finale de 1 x.

Chargez immédiatement les échantillons sur un gel natif de polyacrylamide comportant un gel de concentration à 5 % et un gel de séparation à 8 %. Tout retard entraînera une perte des complexes natifs. Faites migrer le gel à 20 milliampères par gel à quatre degrés Celsius.

Arrêter l'électrophorèse 45 minutes après que la bande de bleu de bromophénol ait quitté le gel, après un temps total d'environ 1,5 à deux heures, avant de procéder au transfert Western blot en utilisant des anticorps dirigés contre RIG-I et PKR, comme décrit dans le document accompagnant. L'essai de commutation conformationnelle et d'oligomérisation induite par la reconnaissance d'un agoniste viral par RIG-I ou PKR a été réalisé selon la méthode décrite dans cette vidéo. Des digestions protéolytiques limitées et des électrophorèses natives ont été effectuées comme indiqué. La digestion par la trypsine de lysats cellulaires non infectés a entraîné une dégradation rapide de RIG-I, tandis que l'infection par le clone 13 a conduit à la formation d'un fragment de RIG-I résistant de 30 kilodaltons. PKR présente également une résistance partielle à la digestion par la trypsine dans les échantillons infectés, ce qui coïncide avec sa phosphorylation. Afin de contrôler l'efficacité et la spécificité de la digestion par la trypsine, les gels ont été colorés au bleu de Kumasi brillant G 250. Les échantillons non traités montrent des quantités équivalentes de protéines chargées. La soumission de lysats cellulaires non infectés et de lysats de cellules C13 à la digestion par la trypsine conduit à une diminution comparable des quantités globales de protéines.

Ceci démontre que le traitement par la tripsine présente la même efficacité pour les échantillons témoins et infectés par le CL 13 dans les cellules non infectées. Seuls les monomères de R EYE et de PKR ont été détectés comme contrôle supplémentaire. Le facteur de transcription IRF trois a été inclus, présent sous forme de monomère, mais connu pour former un dimère lors de son activation via R Eye.

L'infection par le clone 13 entraîne une forte accumulation de complexes oligomériques de RIG-I sous forme d'un smearing, ainsi que de dimères ou oligomères de PKR et d'IRF3 sous forme de bandes protéiques définies. Ces résultats démontrent que les digestions limitées suivies d'électrophorèses nativessont des outils utiles pour surveiller les changements conformationnels et la formation d'oligomères de RIG-I et de PKR au cours de l'infection. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment surveiller le changement de conformation et l'oligomérisation de RIG-I et de PKR une fois cette technique maîtrisée.

Cette technique peut être réalisée en deux jours en suivant cette procédure. Des méthodes comme les dosages pro peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la présence d'une interaction stable avec le ligand stimulateur après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunité innée pour explorer l'état d'activation des récepteurs de reconnaissance de motifs dans des cellules stimulées par un virus.