Name: Suivi dactivation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Découvrez comment surveiller l'activation des récepteurs RIG-I et PKR par digestion protéasique limitée et PAGE native. Cette méthode permet d'analyser les changements conformationnels et l'oligomérisation lors des infections virales.

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Nous remercions Alejandro Brun de CISA-INIA pour fournir anti-fièvre de la vallée du Rift Virus sérums. Travail dans nos laboratoires est soutenu par Forschungsförderung bijou. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, la Graduate School Leibniz pour les maladies virales émergentes (Eidis), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, et la DFG Schwerpunktprogramm (PSP) 1596.

1. L&#39;ensemencement des cellules A549 pour infection <ol><li> Cultiver un flacon T75 de cellules A549 à 37 ° C et 5% de CO2 dans du milieu de culture cellulaire (DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 526,6 mg / l de L-glutamine, 50.000 U / l de pénicilline et 50 mg / l de streptomycine). </li><li> Avant de commencer à récolter les cellules, réchauffer le milieu de culture cellulaire, du PBS et 0,05% de trypsine-EDTA dans un bain-marie chauffé à 37 ° C. </li><li> Retirez le support et laver les cellules avec 10 ml de PBS. Retirer à nouveau la PBS. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA et répartir également dans le ballon. Transférer le ballon dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Lorsque toutes les cellules sont décollées, ajouter 7 ml de milieu de culture cellulaire, de remettre en suspension les cellules, et transférer la suspension de cellules dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 800 xg pendant 5 min à température ambiante, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu de culture cellulaire frais. </li><li> Compter les cellules avec une chambre de comptage. </li><li> Ajouter 2,5 x 10 6 cellules dans 5 ml de milieu de culture cellulaire dans deux flacons T25 chacune. Incuber pendant 16 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Un flacon sert pour le contrôle maquette et une pour infection Cl 13. </li></ol> 2. L&#39;infection par le virus de la Rift Valley Fever Clone 13 (Cl 13) <ol><li> REMARQUE: Cl 13 est un mutant du virus atténué qui en Allemagne peut être manipulé dans BSL-2 conditions. S&#39;il vous plaît se référer aux directives nationales pertinentes. D&#39;autres inducteurs d&#39;IFN typiques seraient virus Sendai (souche Cantell) ou le virus de la maladie de Newcastle. </li><li> , Un milieu exempt de sérum pré-PBS chaud, et un milieu de culture cellulaire contenant 5% de FCS. </li><li> Préparer 1,25 x 10 7 UFP / ml de Cl 13 dans du milieu sans sérum pour infecter 2,5 x 10 6 cellules A549 avec une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 5. Préparer une quantité légèrement (environ 10%) plus grand que nécessaire pour tenir compte de les erreurs de pipetage. </li><li> Laver les cellules avec du PBS comme décrit sous 1.3. </li><li> Ajouter 1 ml de la dilution 13 Cl oude milieu sans sérum (témoin non infecté, mock) aux cellules et incuber pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO 2. Déplacer le ballon soigneusement toutes les 15 min pour assurer une distribution égale de Cl et 13 dilution du milieu sans sérum, respectivement. </li><li> Après 1 h d&#39;infection, les inoculums supprimer, ajouter 5 ml de milieu préchauffé de culture de cellules avec 5% de FCS, et incuber pendant 5 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Préparation des lysats cellulaires <ol><li> Préparer du PBS / 0,5% de Triton X-100 à 4 ° C. Ne pas ajouter des inhibiteurs de protease à serine. </li><li> Laver les cellules avec du PBS froid et ajouter 10 ml de PBS frais. </li><li> Grattez les cellules off, transférer la suspension de cellules dans un tube de faucon, et centrifuger à 800 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 ul de PBS / 0,5% de Triton X-100. Transférer le lysat dans un nouveau tube de 1,5 ml et incuber pendant au moins 10 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le lysat à 10h000 x g pendant 10 min à 4 ° C et à transférer le lysat cellulaire clarifié (surnageant) dans un tube frais. </li><li> Déterminer la concentration en protéine par dosage de Bradford comme décrit par ailleurs 33. </li><li> Conserver à -20 ° C ou procéder à la digestion de la trypsine (4.1) ou PAGE native (5.1). </li></ol> 4. Détermination des changements conformationnels de Pattern Recognition Receptors <ol><li> Traitement TPCK-trypsine de Lysats de cellules <ol><li> Diluer L-1-tosylamido-2-phényléthyl-chlorométhyl cétone traitée (TPCK) de la trypsine dans du PBS à une concentration de travail finale de 2 ug / ul. </li><li> Régler dans deux nouveaux tubes une concentration finale en protéine de 25 ug de chaque lysat de protéine (mock ou Cl. 13) dans un volume final de 9 pl avec du PBS. Par conséquent, il devrait être de quatre tubes avec 25 ng de chaque lysat, deux fois simulés et deux fois 13 Cl infection. Un jeu comme le contrôle d&#39;entrée (non traité) et un ensemble de traitement avec TPCK-trypsine. </li><li> Ajouter 1 pl de PBS (non traité)ou 1 ul de 2 ug / ul TPCK-trypsine (concentration finale: 0,2 pg / pl) pour les lysats cellulaires et les réactions mélanger par pipetage. NE PAS congeler et décongeler aliquotes de TPCK-trypsine, car il risque de compromettre l&#39;efficacité de la digestion. </li><li> Incuber les lysats à 37 ° C pendant 25 min. Arrêter la réaction en ajoutant de 5x tampon de dénaturation de l&#39;échantillon (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% glycerol, 25% β-mercaptoéthanol, 0,5% de bleu de bromophénol) et en faisant bouillir pendant 5 min à 95 ° C. Il est important de ne pas prolonger le temps d&#39;incubation de la trypsine. Dans le cas où aucun des fragments d&#39;résistante aux protéases sont détectables, au moment de la digestion par la trypsine doit être raccourcie. </li><li> Après l&#39;ébullition, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C. </li></ol></li><li> SDS sur gel de polyacrylamide (PAGE) et Western Blot <ol><li> Charger les échantillons sur un dodécylsulfate de sodium (SDS) gel de polyacrylamide contenant un empilement de 5% sur un gel de résolution à 12%. Séparer les protéines à 25 mA par gel jusqu&#39;àle bleu de bromophénol s&#39;épuise. </li><li> Activer un polyfluorure de vinylidène (PVDF) pendant 30 secondes avec du methanol et le mettre dans un tampon de transfert (Tris 48 mM, glycine 39 mM, 1,3 mM de SDS, 20% de methanol). </li><li> Préparer le blot avec un système de blotting semi-sec et de permettre le transfert des protéines à 10 V pendant 1 h. Prenez la membrane, rincez brièvement avec de l&#39;eau, et laisser sécher. </li><li> Réactiver la membrane en transférant peu en méthanol. Laver pendant 5 min avec du TBS. Bloc avec 10% de lait écrémé dans du TBS pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° CO / N. Laver 3x de membrane pendant 5 min chacun avec le SCT. </li><li> Préparation de l&#39;anticorps en tant que la dilution recommandée dans le tableau 1 et incuber la membrane pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° CO / N. </li><li> Laver 3x de membrane pendant 10 minutes chacune avec TBS-T. Ajouter l&#39;anticorps secondaire approprié couplé à la peroxydase de raifort à une dilution de 1:20,000 dans 1% de lait écrémé dans du TBS. Incuber 45 minutes à température ambiante. </li><li> Laver 3x de membrane pendant 10 minutes chacune avec TBS-T, et oun délai supplémentaire ne SCT. </li><li> Pour la détection du signal utiliser un kit de chimioluminescence commercial et un système d&#39;imagerie numérique de gel. </li></ol></li><li> Coloration au bleu de Coomassie G-250 <ol><li> Effectuer SDS-PAGE comme décrit au point 4.2.1. Charger les échantillons sur un gel de polyacrylamide SDS et courent le gel à 25 mA par gel jusqu&#39;à bleu de bromophénol s&#39;épuise. </li><li> Effectuer Coomassie coloration bleu G-250 à TA. Faire toutes les incubations sous agitation constante. </li><li> Transférer le gel dans la solution de fixation contenant 40% de méthanol et d&#39;acide acétique à 10% pendant 30 min. </li><li> Échanger le tampon de la solution de décoloration (25% d&#39;éthanol et d&#39;acide acétique à 8%) et incuber pendant 5 min. </li><li> Colorer le gel avec 0,2% de bleu de Coomassie Brillant G-250 dans 40% de methanol et d&#39;acide acétique à 10% pendant 1 heure. </li><li> Décolorer le gel avec la solution de décoloration et échanger le tampon après 10 min, 30 min et 60 min. </li><li> Stocker le gel à 25% d&#39;éthanol, de l&#39;acide acétique à 8%, et de 4% de glycerol à 4 ° C. </li&gt; <li> Effectuez l&#39;imagerie et l&#39;analyse comme décrit sous 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. Analyse des oligomères Unis d&#39;Pattern Recognition Receptors <ol><li> PAGE natif <ol><li> Préparer 50 pg de lysat de cellules dans un volume final de 10 pl avec du PBS et ajouter 5 x tampon native de l&#39;échantillon (250 mM Tris-HCl pH 6,8, du désoxycholate de sodium à 1%, 50% de glycerol, 0,5% bleu de bromophénol) à une concentration finale de 1x. </li><li> Charger les échantillons immédiatement sur un gel de polyacrylamide natif avec 5% d&#39;empilage et de 8% en gel de résolution. Tout retard entraînera une perte de complexes indigènes 34. </li><li> Exécuter le gel à 20 mA par gel à 4 ° C avec 50 mM de Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM de glycine comme anode et comme 50 mM de Tris pH 8,3, 384 mM glycine, le désoxycholate de sodium à 1% comme tampon de cathode. Après 1,5-2 h (bande bleu de bromophénol a quitté le gel d&#39;environ 45 min plus tôt) l&#39;électrophorèse est terminée. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Activer une polyvinylidene fluorure (PVDF) pendant 30 secondes avec du méthanol et mettre en mémoire tampon Towbin (Tris 25 mM, glycine 192 mM, 0,1% de SDS, 20% de methanol). </li><li> Monter une chambre de transfert humide selon les instructions du fabricant et remplir le réservoir avec du tampon Towin. </li><li> Effectuer le blot avec 250 mA pendant 1,5 h à 4 ° C. </li><li> Lorsque buvard est terminé, procédez comme décrit à partir de 4.2.3. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Détecter la présence de virus et l&#39;activation du type antiviral système I IFN sont cruciales pour les réponses immunitaires innées succès 22. La détection des virus est donc médiatisée par la reconnaissance des agents pathogènes récepteurs (PRR) comme RIG-I et PKR, ce qui permet une réponse rapide et l&#39;activation des mécanismes de défense antivirale. Ici, nous décrivons deux méthodes pour évaluer directement l&#39;état d&#39;activation de RIG-I et de PKR. Digestion de prot...

Un événement crucial dans la défense antivirale de l&#39;hôte est la détection rapide de l&#39;agent pathogène par les soi-disant récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) 1,2. La détection intracellulaire de l&#39;infection par le virus à ARN est dépendante de deux hélicases d&#39;ARN cytoplasmique, RIG-I (gène inductible par l&#39;acide rétinoïque I) et MDA5 (différenciation des mélanomes protéine associée 5) 3-5. RIG-I est composée de deux domaines N-terminaux recrutement de caspase (CARDS), un domaine ARN hélicase de type DECH-caisson central, et un domaine C-terminal (CTD) 4,6. Considérant que le CTD et le domaine hélicase sont nécessaires pour la reconnaissance de la non-autonomes (ARN viraux), les cartes médiation signalisation en aval conduisant à l&#39;établissement d&#39;un statut d&#39;hôte antiviral. Si RIG-I est à l&#39;état silencieux, c&#39;est à dire en l&#39;absence d&#39;un ligand d&#39;ARN spécifique, la deuxième carte interagit avec le domaine hélicase central et maintient RIG-I dans une conformation d&#39;auto-inhibition de 7-11. RIG-I se lie à court doublebrin (ds) ARN portant un 5&#39;-triphosphate (5&#39;PPP), à long ARN double brin et l&#39;ARN polyU / UC-riche, structures de signature classiques qui sont présents sur les génomes de nombreux virus à ARN de 12-16. Deux caractéristiques majeures de RIG-I activation sont un commutateur à une conformation fermée 6,17 et l&#39;homo-oligomérisation 6,18,19. L&#39;interrupteur conformationnel améliore liaison à l&#39;ARN, expose les cartes pour la signalisation en aval, et reconstitue un site ATPase actif 8,9,11,20. La formation de complexes oligomères RIG-I conduit à accroître le recrutement de molécules d&#39;adaptateurs en aval de la signalisation pour former une plate-forme pour la transduction du signal 11 antiviral. La chaîne de signalisation RIG-I-régulé éventuellement active le facteur de transcription IRF-3, pour la régulation de l&#39;interféron (IFN-alpha/beta) gènes et par conséquent l&#39;expression génique de gènes stimulés par l&#39;interféron (ISG) pour une réponse antivirale complète 21,22 . L&#39;un des meilleurs ISGs caractérisé est le protei ARN activén kinase (PKR) 23. PKR appartient à la famille du facteur d&#39;initiation de traduction eucaryote alpha 2 (eIF2α) kinases et est composé d&#39;un domaine de liaison à N-terminal de l&#39;ARN double brin et un domaine de kinase C-terminal. Le domaine de kinase constitue l&#39;interface de dimérisation cruciale pour l&#39;activation de PKR et réalise les fonctions catalytiques de la protéine. Reliure de PKR à l&#39;ARN double brin viral conduit à son changement de conformation permettant la dimérisation et l&#39;auto-phosphorylation sur Thr 446 entre autres résidus. PKR produit ensuite la phosphorylation de eIF2α, bloquant ainsi la traduction des ARNm viral 23-27. Les deux RIG-I et PKR objet d&#39;importants réaménagements structurels, former des complexes oligomères et sont modifications post-traductionnelles par phosphorylation / déphosphorylation et ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Pour une meilleure compréhension de laquelle les structures d&#39;ARN viral activent RIG-I et PKR (et à quel stade antagonistes virales pourraient binterférant e), il est important de déterminer avec précision l&#39;état d&#39;activation. Pour les deux PRRs il a été précédemment décrit que l&#39;activation conduit à l&#39;apparition de fragments de protéine résistant à la trypsine 6,17,30 et oligomères d&#39;ordre supérieur 6,18,19. Toutefois, compte tenu de la richesse de la littérature sur les facteurs clés de la réponse antivirale de l&#39;hôte 1,2,24, l&#39;application de méthodes directes semble relativement rare. Dans l&#39;espoir de stimuler l&#39;utilisation plus large, nous fournissons des protocoles pratiques et sensibles pour analyser robuste les états d&#39;activation de RIG-I et PKR. Le compétente A549 de lignée cellulaire humaine IFN est infecté par un activateur établi de RIG-I et de PKR, le virus de la fièvre de la Vallée du Rift atténué clone mutant 13 (Cl 13) 31,32. Après une procédure de lyse simple, les extraits de cellules infectées sont testés par digestion à la trypsine / ouest analyse limitée blot pour évaluer commutation de conformation, et par le bleu natif gel de polyacrylamide (PAGE) / analys Western blotest de mesurer la formation d&#39;oligomères.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>Culture cellulaire</fort></td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-RIG-I de souris (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB : 1:500 dans du lait écrémé à 1 % chez la souris TBS</td></tr><tr><td> anti-PKR monoclonal (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB : 1:500 dans le lait écrémé à 1 % dans le TBS</td></tr><tr><td>Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB : 1:1 000 dans 5 % BSA dans le TBS</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-IRF-3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB : 1:500 dans le lait écrémé à 1 % dans le TBS</td></tr><tr><td>Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB : 1:100 dans le lait écrémé à 1 % dans le TBS</td></tr><tr><td>Sérum hyper-immun anti-RVFV de lapin « C2 » (MP-12)</td><td>Aimablement fourni par Alejandro Brun CISA-INIA</td><td></td><td>WB : 1:2 000 dans du lait écrémé à 1 % dans le TBS</td></tr><tr><td>Anti-bêta-actine monoclonal de souris (8H10D10)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>3700</td><td>WB : 1:1 000 dans le lait écrémé à 1 % dans le TBS</td></tr><tr><td>Chèvre polyclonale conjuguée à la peroxydase anti-lapin</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB : 1:20 000 dans le lait écrémé à 1 % dans le TBS</td></tr><tr><td>Chèvre polyclonale conjuguée à la peroxydase anti-souris</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB : 1:20 000 dans du lait écrémé à 1 % en TBS</td></tr></tbody></table>

suivi d&#39;activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs rig-i et par pkr limitée protéase digestion et page native

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Défenses de l&#39;hôte à l&#39;infection par le virus dépendent d&#39;une détection rapide par les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) du système immunitaire inné. Dans le cytoplasme, les PRR RIG-I et de PKR se lient à des ligands spécifiques d&#39;ARN viral. Cette première commutation assure la médiation de conformation et l&#39;oligomérisation, et permet ensuite l&#39;activation d&#39;une réponse antivirale de l&#39;interféron. Bien que les méthodes de mesure de l&#39;expression des gènes de l&#39;hôte antiviral sont bien établis, des méthodes pour surveiller directement les états d&#39;activation de RIG-I et PKR ne sont que partiellement et moins bien établis. Ici, nous décrivons deux méthodes pour surveiller RIG-I et PKR stimulation lors de l&#39;infection avec un inducteur d&#39;interféron établie, le virus vallée du Rift clone mutant 13 (Cl 13). Digestion de la trypsine limité permet d&#39;analyser les modifications de la sensibilité de la protéase, indiquant des changements de conformation des PRR. Digestion par la trypsine de lysats de maquettes résultats cellules infectées à une dégradation rapide de RIG-I et PKR, whereas Cl 13 infection conduit à l&#39;émergence d&#39;un RIG-I fragment résistant aux protéases. Aussi PKR présente une résistance partielle induite par le virus de la digestion de la trypsine, qui coïncide avec sa marque de fabrique de la phosphorylation au niveau de Thr 446. La formation de RIG-I et oligomères PKR a été validé par électrophorèse native sur gel de polyacrylamide (PAGE). Lors de l&#39;infection, il existe une forte accumulation de complexes d&#39;oligomères PKR RIG-I et, alors que ces protéines sont restés en tant que monomères dans des échantillons infectés simulés. Digestion de protéase Limited et PAGE native, à la fois couplées à une analyse Western blot, permet une mesure sensible et directe de deux différentes étapes de RIG-I et l&#39;activation de PKR. Ces techniques sont relativement faciles et rapides à réaliser et ne nécessitent pas un équipement coûteux.

La reconnaissance d&#39;un agoniste virale par RIG-I ou PKR déclenche commutation conformationnelle 6,17,30 et oligomérisation 6,18,27. Nous avons mesuré ces deux marqueurs d&#39;activation par digestion de protéase native limitée et électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), respectivement. Les cellules A549 humaines ont été infectées avec le virus de la fièvre du Rift Valley clone 13 (Cl 13), qui est caractérisée par une mutation de l&#39;antagoniste de l&#39;IF...

Défenses innées à des infections virales sont déclenchés par des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). Les deux PRR cytoplasmiques RIG-I et PKR se lient aux ARN viraux de signature, le changement de conformation, oligomérisation, et activer la signalisation antiviral. Les méthodes sont décrites qui permettent de surveiller facilement la commutation de conformation et l&#39;oligomérisation de ces PRR cytoplasmiques.

Suivi d&#39;activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Les défenses innées contre les infections virales sont déclenchées par des récepteurs de reconnaissance de motifs, ou RRM, présents dans les cellules du système immunitaire inné lors d'une infection. Les RRM cytoplasmiques, RIG-I et PKR, se lient aux ARN caractéristiques viraux, modifient leur conformation à la suite de la liaison à leurs ligands et activent des voies de signalisation antivirales. Afin de surveiller les changements conformationnels de RIG-I et de PKR ainsi que leur ligandisation in vitro, des cellules humaines A549 sont infectées par le virus de la fièvre de la vallée du Rift.Cloner 13 afin de stimuler l'activation des RPR. Des lysats cellulaires de cellules témoins et infectées sont ensuite préparés pour analyser les changements conformationnels de Rig-I et de la PKR. Une digestion limitée à la trypsine est réalisée.Si des modifications conformationnelles dans la structure de la protéine se sont produites, la protéine est plus résistante à la digestion et des bandes seront visibles lors de l'analyse par immunotransfert. Pour analyser la formation de la protéine native, une électrophorèse native est réalisée, suivie d'une analyse par immunotransfert. Si une totalit

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez les souris infectées par un virus de l'herpès modèle murin gamma herpèsvirus 68 (γ HV68) qui est étroitement liée à associé au sarcome de virus de l'herpès de Kaposi humain (KSHV) et le virus d'Epstein-Barr (EBV). L'utilisation de souches de souris génétiquement modifiées et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons évalué la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

Nous décrivons ici une procédure permettant une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps phosphospécifiques.

A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.

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Nous présentons des approches expérimentales pour étudier RNA-Interactiens de bicaténaire RNA binding protéine kinase activée par RNA (PKR) durant le cycle cellulaire chez les mammifères, à l’aide de cellules HeLa. Cette méthode utilise le formaldéhyde pour crosslink RNA-PKR complexes et immunoprécipitation pour enrichir PKR lié aux ARN. Ces ARN peut être davantage analysé par séquençage haut-débit ou qRT-PCR.

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Une méthode occidentale indigène de tache pour analyser le facteur réglementaire endogène d'interféron 5 dimerization dans la ligne de cellules dendritiques plasmacytoid de CAL-1 est décrite. Ce protocole peut également être appliqué à d'autres lignées cellulaires.

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Nous présentons un protocole général pour identifier de courtes étendues des séquences homologues de protéine d'hôte-pathogène (SSHHPS) incorporées dans la polyprotéine virale. Le SSHHPS est reconnu par les protéases virales et dirige la destruction ciblée de protéines hôtes spécifiques par plusieurs virus du groupe IV.

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Ce protocole décrit une méthode complète d’évaluation de l’activation des caspases (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 et caspase-11) en réponse à des modèles in vitro et in vivo (chez la souris) d’infection, d’agressions stériles et de cancer pour déterminer l’initiation des voies de mort cellulaire, telles que la pyroptose, l’apoptose, la nécroptose et la panoptose.

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L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.

Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines

Découvrez comment surveiller l'activation des récepteurs RIG-I et PKR par digestion protéasique limitée et PAGE native. Cette méthode permet d'analyser les changements conformationnels et l'oligomérisation lors des infections virales.

Suivi d'activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

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