Name: Suivi juxtacellulaire et localisation des neurones unique au sein de structures cérébrales sous-corticales dalerte, Head-Rats retenu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez l'enregistrement juxtacellulaire pour l'étude de l'activité neuronale chez les rats éveillés retenus par la tête. Cette méthode permet d'isoler des neurones uniques et de localiser précisément les sites d'enregistrement dans les structures sous-corticales.

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Nous sommes reconnaissants envers les Instituts de recherche en santé du Canada (subvention MT-5877), les National Institutes of Health (subventions NS058668 et NS066664) et la Fondation binationale israélo-américaine (subvention 2003222) pour le financement de ces études.

Les protocoles expérimentaux ont été réalisés sur des rats femelles Long Evans (250-350 g) conformément aux soins des animaux et de l&#39;utilisation des lignes directrices prescrites par le fédéral et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle à l&#39;Université de Californie à San Diego. 1. Acclimatation Rat Body retenue REMARQUE: Placez le rat sur un régime restreint. Nourrir le rat une fois par jour immédiatement après chaque séance quotidienne de manutention se acclimater le rat à la retenue (décrit ci-dessous). Fournir suffisamment de nourriture pour maintenir l&#39;animal à 80% de son poids initial. Ce montant est d&#39;environ 6 grammes de nourriture par jour pour une femme de 250 g Long Evans rat. <ol><li> Acclimater le rat à être manipulés par les humains. Freiner doucement le rat à la main pour des périodes d&#39;environ 5 secondes toutes les 30 secondes. Pour ce faire, pendant 15 min par jour sur deux jours consécutifs. Surveiller les rats quotidiennement les signes de stress pendant la période de formation. Les signes comprennent mal in réponse à la retenue, la vocalisation, et la dent-bavardage. </li><li> Sur le 3 ème jour, placez le rat dans un corps-contraignante chaussette en tissu (Figure 1) pendant 15 minutes par jour pendant deux jours consécutifs. </li><li> Sur la 5 ème jour, placer le rat à l&#39;intérieur de la chaussette, et placer la chaussette à l&#39;intérieur d&#39;un tube rigide sur le gabarit expérimental (Figure 4). Laissez le rat dans le tube pendant 15 min par jour sur deux jours consécutifs. </li><li> Nourrir le rat immédiatement après chaque session de formation. A la fin de la session précédente (6 ème jour) donner libre accès à la nourriture. Sélectionnez pour l&#39;implantation que les rats qui ne présentent pas de signes de stress excessif sur la dernière journée de formation. REMARQUE: Bien que la sélection de rats pour l&#39;implantation est subjective, dans nos mains plus de 90% des rats ont été trouvés pour être sensible à l&#39;accoutumance et capable de subir l&#39;implantation. </li></ol> 2. Implanter le Mécanisme chambre d&#39;enregistrement et d&#39;appui-tête <ol><li> Faire un reConférence fil par soudure fil d&#39;acier inoxydable nu à un connecteur à broches. Coupez le fil de telle sorte que 3-5 mm vestiges découverts par la broche. Autoclave le fil de référence, avec tous les outils chirurgicaux. </li><li> Administrer la kétamine / xylazine. Administrer 95 mg / kg de kétamine mélangée avec 5 mg / kg de xylazine par voie intraperitoneale. La dose initiale dure 1½ à 2 heures. Compléter l&#39;anesthésie tous les 30 à 45 min par la suite, au besoin. Lubrifier les yeux de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique. </li><li> Vérifier le réflexe de retrait de pointe pour déterminer le plan de l&#39;anesthésie, et de maintenir l&#39;anesthésie nécessaire. </li><li> Placez le rat dans un cadre de maintien stéréotaxique avec des barres d&#39;oreilles (Figure 3A). Raser les cheveux sur la tête et désinfecter la plaie avec de la povidone-iode (solution à 10%). Prenez soin d&#39;insérer les barres d&#39;oreilles de manière appropriée afin qu&#39;ils ne endommagent pas le tympan. barres d&#39;oreille avec bouts arrondis sont préférables. </li><li> Faire une incision avec un envi de scalpelmativement le long de la ligne médiane du crâne par rapport au niveau rostro-caudale des yeux à l&#39;arrière de l&#39;oreille. Utilisez des ciseaux pour couper et enlever une bande de 2-3 mm de la peau de chaque côté de l&#39;incision. </li><li> Grattez le périoste pour exposer la surface du crâne sur les crêtes latérales. Couvrir le crâne exposé avec fine couche de colle. </li><li> Percez un petit trou, avec un diamètre légèrement inférieur à 0-80 vis, en utilisant une perceuse bavure ½ mm de diamètre (voir la section Matériaux). Percer le trou postérieur immédiatement à l&#39;endroit où le fil de suture conforme à la bregma arête latérale, et à un angle de 30-45 ° dans le crâne, de sorte que la vis peut entrer avec le plus haut latérale de la partie inférieure. </li><li> Visser une vis 0-80 de la machine à fond plat dans le trou (environ 3 tours), à 30-45 °. Veillez à ne pas visser trop profondément pour éviter d&#39;endommager le tissu cérébral sous-jacent. </li><li> Répétez cette procédure pour 6 vis supplémentaires dans la configuration représentée <strong&gt; (Figure 3B). Appliquer colle à la base de toutes les vis. </li><li> Placer une aiguille de seringue dans le manipulateur de stereotax. Mesurez à partir de la suture de bregma, et faire une brèche dans le crâne avec l&#39;aiguille près, mais en dehors de l&#39;emplacement de craniotomie souhaité, comme une marque de référence. NOTE: Dans cette démonstration, les coordonnées stéréotaxiques de la marque sont de 3 mm et 1 mm postérieure latérales à la suture de bregma. </li><li> Marquer la dent avec un marqueur permanent. Notez les coordonnées stéréotaxiques de la marque, car il servira de point de référence stéréotaxique (Figure 3B). </li><li> Faire une craniotomie centrée sur les coordonnées désirées (3 mm et 3 mm postérieur au bregma latérales dans cet exemple). Laissez la dure-mère intacte. Couvrir avec la craniotomie liquide céphalo-rachidien artificiel modifiée (NaCl 125 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM de CaCl2, 1,3 mM de MgCl2, pH 7,4) 13 (figure 3C). </li&gt; <li> Couper un tube de 0,2 ml de centrifugeuse à 4-5 mm de longueur, et couper le capuchon. Placer le tube sur le crâne et centrer sur la craniotomie. </li><li> Appliquer le ciment dentaire autour de la partie inférieure du tube pour sceller le fond du tube au crâne. Veillez à ne pas fuir ciment dans la craniotomie exposée (Figure 3D). </li><li> Percez un autre petit trou (environ ½ mm de diamètre) dans la plaque crânienne controlatéral et insérez soigneusement le fil de référence. Construire le fil de référence en soudant une broche qui se interface avec l&#39;amplificateur d&#39;enregistrement à l&#39;extrémité du fil (voir la section de l&#39;équipement). Ne déplacez pas le fil de référence une fois qu&#39;il est dans le cerveau, car cela pourrait causer des dommages. </li><li> Appliquer colle au trou dans lequel le fil a été inséré. Ce sera le sceau de la broche et le fil en place temporairement. </li><li> Mélanger les deux parties du kit de gel de silicone (voir la section Matériaux) en parties à peu près égales. Attendez deux minutes pour mélanger et fill le tube de centrifugeuse environ ⅓ complète avec gel. </li><li> Joindre un angle droit après pince (voir la section Matériaux) à la barre de retenue de la tête. Attacher la plaque de tête (figure 2A) à la barre de retenue (figure 2B) à un angle de 45 ° en tangage afin que le fond de la plaque est du côté du nez de l&#39;animal. Il est utile d&#39;utiliser un inclinomètre pour régler l&#39;angle de tangage pour correspondre à celle du gabarit expérimental (Figure 4). </li><li> Fixer la barre de maintien au bras stereotax manipulateur pour que la barre est parallèle aux barres d&#39;oreilles. Abaisser la barre et la plaque de sorte que la plaque est postérieure de la suture lambda et en avant de la vis la plus caudale. </li><li> Saisissez la tête-boulon avant (un plot 8-32 ou à vis, voir la section des matériaux) à environ 45 ° avec un mains bras aider et pince, de sorte que la tête de la vis orientée vers le bas et vers la queue de l&#39;animal. Abaisser la vis jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche la fourmierior 0-80 vis (Figure 3F, G). </li><li> Fixez le boulon et la plaque en place avec de l&#39;acrylique dentaire. Appliquer acrylique dentaire autour des têtes de vis à os, broche de référence, et autour des côtés du tube de centrifugation. Attendez environ 10 min pour le acrylique dentaire pour sécher (Figure 3H). </li><li> Appliquer une couche de ciment dentaire autour des bords de l&#39;acrylique dentaire, la cimentation peau à l&#39;implant. Attendre que le béton sécher. </li><li> Poke plusieurs trous dans le bouchon du tube de centrifugeuse, et placer le bouchon sur le tube. </li><li> Retirez la main pince aider. Puis retirez délicatement la barre de la stereotax maintien de tête, puis retirer la plaque de la tête de la barre (figure 3I). </li><li> Retirer l&#39;animal de la stereotax et administrer les soins et le suivi post-opératoire conformément à toutes les règles applicables, les règlements et les lois (par exemple, buprénorphine 0,02 mg / kg, tous les 8-12 h pour un minimum de 24h). Si l&#39;inflammation se développe autour des bords de l&#39;implant, appliquer une fine couche de pommade antibiotique au site affecté tous les jours jusqu&#39;à résolu. </li></ol> 3. Suivi juxtacellulaire d&#39;unités neuronales <ol><li> Tirer quartz tube capillaire sur un dioxyde de carbone micropipette extracteur laser (voir la section Matériel) avec des diamètres inférieurs à 1 um (figure 5A) d&#39;extrémité. Remarque: Les paramètres de chauffage varient en fonction de l&#39;appareil particulier, et que le diamètre du col requis variera en fonction de la structure du cerveau d&#39;intérêt. Pour les enregistrements dans le thalamus de rat, micropipettes ont cou allant de 5 à 7 mm. </li><li> Fixez la pipette en place sous un microscope contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) équipé d&#39;objectifs de longue distance de travail. Utilisez la pâte à modeler pour maintenir la pipette en place sur la scène du microscope. </li><li> Lentement, déplacez un bloc de verre (de 0,5 à 1 cm d&#39;épaisseur; un morceau de verre utilisé pour making couteaux ultra-microtome est pratique) dans le champ de vue avec la pointe de la pipette. Utilisation du micromanipulateur stade, toucher doucement la pointe de la pipette sur le verre, et la casser. Répéter au besoin jusqu&#39;à ce que le diamètre extérieur de la pointe de la pipette est entre 1-3 pm (Figure 5B, C). Assurez-vous que ces micropipettes ont des impédances entre environ 5-15 MQ. </li><li> Préparer une solution saline extracellulaire (NaCl 135 mM, KCl 5,4 mM, 1,8 mM de CaCl2, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,2 avec NaOH) et ajouter 2 8% (p / v) de bleu de ciel Chicago. En utilisant une seringue avec une aiguille de 30 G ou plus petit, remplir la partie arrière de la pipette avec la solution. Sinon, pour une seule cellule étiquetage juxtacellulaire ajouter 2% (p / v) Neurobiotin ou amine dextran biotinylé (BDA-3000 ou BDA-10000) à la solution saline en place de Chicago Blue Sky. </li><li> Placez le rat intérieur de la chaussette en tissu à l&#39;intérieur du tube rigide sur un gabarit expérimental approprié ( <strong&gt; Figure 4) .wait un minimum de 72 heures après la chirurgie avant de placer l&#39;animal sur le gabarit appuie-tête. Serrer le cordon autour du sternum supérieur, plutôt que le col, afin d&#39;éviter l&#39;obstruction des voies aériennes. Si la respiration semble être laborieuse ou obstruée, desserrer le cordon ou le déplacer en arrière. Effectuer cette procédure tandis que le rat est alerte. </li><li> Fixez la plaque de tête retenue sur le rat à la pièce correspondante sur le gabarit. Pour ce faire, la broche d&#39;abord la plaque appuie-tête en place, puis le fixer avec une vis 4-40. Assurez-vous d&#39;attendre jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est calme afin d&#39;éviter l&#39;application d&#39;un couple excessif à la tête. Ensuite, placez un écrou 8-32 sur le boulon à tête de retenue de qui est implantée sur le rat. Visser ensuite une tige filetée en acier inoxydable à la tête boulon. Fixer la tige sur le dispositif expérimental de telle manière (Figure 4) qui peut être serré en place. REMARQUE: Sécurisation de l&#39;animal avec tête-vis ainsi que l&#39;appui-tête plaque minimizes flexion de l&#39;appareil d&#39;enregistrement et améliore la stabilité. Dans la plupart des cas d&#39;enregistrement peut commencer le premier jour de l&#39;animal est le chef-retenu. Toutefois, si l&#39;animal se agite excessivement ou vocalise, offrir une journée de formation d&#39;habituation appuie-tête avant de commencer tout enregistrement. Dans ce cas, laissez l&#39;animal sur le gabarit pendant 15 min, puis le replacer dans sa cage. Répétez cette étape le lendemain et continuer avec le protocole. </li><li> Ouvrir la chambre d&#39;enregistrement et enlever le gel de silicone. Nettoyez la craniotomie en utilisant une pince fine si le tissu a ré-augmenté dans la craniotomie. </li><li> Fixez la pipette à l&#39;micromanipulateur motorisé, et branchez le préamplificateur headstage. NOTE: Dans la présente démonstration, un petit circuit de relais sur le headstage permet de basculer entre les fils amplificateur de plomb et une source de courant externe avec niveau élevé de conformité (figure 6A-C). Notez que certains amplificateurs ont une appropriée source intégrée élevé de conformité(Voir les sections de discussion et des matériaux). </li><li> Utilisez le micromanipulateur motorisé pour se déplacer la pointe de la pipette à la marque stéréotaxique identifié dans la chambre d&#39;enregistrement. Notez les coordonnées de cet emplacement. Veillez à ne pas briser la pointe de la pipette sur le crâne. </li><li> Déplacer la pipette à l&#39;emplacement d&#39;enregistrement souhaité dans les axes antérieur-postérieur et médio-latérales. Puis avancer la pipette ventralement à travers la dure-mère jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit environ 500 um dorsale à l&#39;emplacement d&#39;enregistrement prévue. </li><li> Avancer lentement la pipette tout en écoutant pour enrichir les événements sur un moniteur audio de la tension amplifiée enregistré entre la pointe de pipette et le fil de référence. Une fois les événements de dopage sont identifiés, continuent à déplacer le 0-100 um pipette jusqu&#39;à déviations de tension allant positifs supérieurs à environ 500 mV sont observées. NOTE: La résistance de l&#39;électrode va augmenter par un facteur d&#39;environ 1,5 à 10 WHen ce cas. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement une fois par unité a été isolé que selon l&#39;étape 3.11, avec toutes les autres mesures comportementales et physiologiques d&#39;intérêt. Dans la présente démonstration, mouvements de vibrisses auto-générés sont surveillés avec vidéographie haute vitesse (voir la section des matériaux). </li><li> Pour marquer le site d&#39;enregistrement, passer l&#39;électrode conduit à se connecter à la source de courant. Il ya plusieurs façons de le faire, en utilisant soit un circuit de relais (figure 6A - C), un haut-source de courant de l&#39;amplificateur, ou manuellement (Figure 6D, voir l&#39;étape 3.8 et discussion). Passez -4 uA avec 2 impulsions sec au cycle de service de 50% pour 4 min pour injecter iontophorèse Chicago Blue Sky à travers la pipette. </li><li> Tuer et perfuser l&#39;animal après plusieurs procédures d&#39;étiquetage selon la pratique standard. Section du cerveau et de contraste que nécessaire pour identifier la localisation anatomique de l&#39;enregistrement se asseoire. Counterstain le tissu pour la cytochrome oxydase réactivité selon 14. Sinon, identifier les dépôts de Chicago ciel bleu en utilisant la microscopie de fluorescence. NOTE: Pour différencier précisément entre les différentes unités marquées il est important que toutes les étiquettes sont fabriquées avec la même pipette sur le même jour, sans desserrer la pipette entre les étiquettes. Dans ce cas, les sites d&#39;enregistrement peuvent être différenciés par leurs positions relatives en histologie post-hoc avec les coordonnées du manipulateur relevées de chaque site (voir l&#39;étape 3.9). Pour une identification non ambiguë, marquer les étiquettes au moins 200 pm les unes des autres, et pas plus de 05/03 étiquettes par région du cerveau. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Construction du gabarit expérimentale La description des éléments mécaniques utilisés pour construire le gabarit expérimental (figure 4) est omis dans le protocole, car il peut être construit de différentes manières. Dans la présente norme de démonstration opto-mécanique pièces et colliers de fixation sont utilisés pour monter la barre d&#39;appuie-tête et le tube de retenue de corps (voir la section des matériaux). Des parties...

Suivi de l&#39;activité neuronale chez un animal d&#39;alerte activement engagé dans une tâche comportementale est essentiel pour comprendre la fonction et l&#39;organisation du système nerveux. Enregistrement extracellulaire de l&#39;activité électrique des unités neuronales simples a longtemps été un outil de base des systèmes neurosciences et est encore largement en usage à l&#39;heure actuelle. Une variété de types et de configurations électrodes sont disponibles selon les exigences scientifiques et techniques d&#39;une expérience particulière. Chroniquement implanté Microdrive ou réseaux d&#39;électrodes sont souvent utilisés chez les animaux se déplacent librement, y compris les oiseaux, les rongeurs et les primates non humains 1-4. Alternativement, pénétrations aigus avec métal ou en verre microélectrodes via un micromanipulateur externe sont souvent utilisés pour enregistrer à partir d&#39;animaux anesthésiés ou tête-retenu. Verre électrodes de micropipette ont l&#39;avantage qu&#39;ils peuvent être utilisés dans la juxtacellulaire ou &quot;cellule attachés&quot; configuration à isoler sans ambiguïté laactivité de neurones individuels sans les complications de pic post-hoc de tri 5. Ces électrodes permettent en outre l&#39;enregistrement à partir de cellules ou les emplacements identifiés anatomiquement, car ils peuvent être utilisés pour injecter des petits dépôts de colorants traceurs ou neuro-anatomiques, ou même de remplir la cellule individuelle enregistrée. Cette configuration a été appliquée avec succès dans les rats, les souris et les oiseaux 6-10. La technique décrite ici se concentre sur le suivi juxtacellulaire et des dépôts de colorant extracellulaires en alerte, les rats de tête-retenu. Notez que contrairement à cellule unique juxtacellulaire remplit, ces dépôts de colorants ne fournissent pas d&#39;informations sur la morphologie cellulaire ou projections axonales 11, mais ils permettront localisation anatomique exacte à environ 50 um et, surtout, avoir un rendement significativement plus élevé chez les animaux d&#39;alerte. Les informations concernant une seule cellule remplit juxtacellulaire est néanmoins fourni comme une stratégie alternative pour l&#39;étiquetage anatomique. En bref, leprotocole se compose de trois grandes phases. Dans la première phase, le rat est acclimaté à la retenue du corps dans une chaussette de tissu (Figure 1) sur une période de 6 jours. Dans la deuxième phase, un dispositif de retenue de la tête (Figure 2) et la chambre d&#39;enregistrement sont implantés chirurgicalement tels que le rat peut être maintenue dans le plan stéréotaxique au cours de plusieurs sessions d&#39;enregistrement suivantes (figure 3); cette procédure permet à l&#39;expérimentateur de cibler des régions sous-corticales du cerveau pour l&#39;étude électrophysiologique basée sur coordonne référence standard 12. La troisième phase consiste à placer le rat dans un gabarit approprié pour effectuer les expériences comportementales et électrophysiologiques (figure 4), la construction de l&#39;électrode à partir d&#39;un tube capillaire en quartz (Figure 5), la réalisation d&#39;enregistrements de neurones qui isolent juxtacellulaire sans ambiguïté les unités individuelles 6-9, et marquant les Locati anatomiquessur le site d&#39;enregistrement avec Chicago Sky colorant bleu (figures 6 et 7). Les enregistrements ont été effectués avec la surveillance comportementale simultanée; Cependant, les détails techniques du comportement dépendront des objectifs scientifiques de chaque expérience et sont donc au-delà de la portée d&#39;un protocole unique. Après achèvement de la procédure expérimentale, qui peut être répétée sur plusieurs jours, l&#39;animal est euthanasie. Le cerveau est extrait et traitées selon la norme neuroanatomiques techniques utilisant soit lumineux champ ou microscopie à fluorescence.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Kétamine HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (solution de xylazine)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (Povidone-Iode)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cyanoacrylate</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td></td><td>3M 1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Grip Cement poudre</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>Pour la base de la chambre d’enregistrement</td></tr><tr><td>Grip ciment liquide</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>Pour la base de la chambre d’enregistrement</td></tr><tr><td>Gel de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet denture réparatrice poudre acrylique</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Pour fixer l’appuie-tête au crâne</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Résine acrylique orthodontique liquide à polymérisation rapide</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Pour fixer l’appuie-tête au crâne</td></tr><tr><td>Chicago sky blue</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Pour la perfusion et la fixation tissulaire</td></tr><tr><td>Saline</td><td>tamponnée au phosphate Sigma</td><td>P3813</td><td>Pour la perfusion et la fixation tissulaire</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>Pour la coloration de la cytochrome-oxydase, <forte>Figure 7</td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>Pour la coloration de la cytochrome-oxydase, Figure 7</td></tr><tr><td>Rat sock</td><td>Sew Elegant (San Diego, CA)</td><td>N/A</td><td>Sur mesure, Figures 1, 4</td></tr><tr><td>PVC tube 2 &frac12 ; "</td><td>U.S. Plastic Co.</td><td>34108</td><td>Figure 4</td></tr><tr><td>Broches et prises D subminiatures</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Fil à musique en acier inoxydable de 0,010" de diamètre</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Cadre de maintien stéréotaxique</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modèle 900</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Barres d’oreille stéréotaxiques</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 957</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Manipulateur stéréotaxique</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modèle 960</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>&frac12 ; meule de foret MM</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Foret dentaire Quiet-Air</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Acier inoxydable 0-80 & frac18 ; &rdquo; vis</td><td>Fixation superstore</td><td>247438</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>0.2 ml tube à centrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>Figure 3</td></tr><tr><td>Barre de maintien de tête personnalisée</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Custom made, Figures 2 - 4</td></tr><tr><td>Plaque de maintien de tête personnalisée</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Des pièces optomécaniques standard Figures 2 - 4</td></tr> <tr><td>Pince à angle droit</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>Figures 3, 4 ; standard pour le gabarit expérimental (Figure 4) proviennent également de Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 et frac34 ; &rdquo; vis</td><td>Fixation Superstore</td><td>240181</td><td>Pour appuie-tête, Figure 3</td></tr><tr><td>4-40 &frac14 ; &rdquo; </td><td>vis Fixation Superstore</td><td>239958</td><td>Pour appuie-tête, Figures 3, 4</td></tr><tr><td>Tube capillaire en quartz</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>Figure 5</td></tr><tr><td>Extracteur laser à dioxyde de carbone</td><td>Sutter instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur motorisé</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur à microélectrodes</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Autre pièce : Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Amplificateur à microélectrodes étage de tête</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Autre pièce : HS-9Ax10 avec Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Stimulateur d’impulsions isolé</td><td>A-M Systems</td><td>Modèle 2100</td><td>Autre pièce : HS-9Ax10 avec Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Moniteur audio</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>Porte-pipette</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Pièces alternatives : voir Discussion, Figure 6A</td></tr><tr><td>Fil conducteur d’électrode</td><td>Fil de cooner</td><td>NEF34-1646</td> <td>(en option), Figure 6D</td></tr><tr><td>Relais pour étage de tête d’amplificateur COTO</td><td>Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(facultatif) Utilisé avec une carte de circuit imprimé sur mesure (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-CCaméra</td></tr> <tr><td>vidéo numérique</td><td>Basler</td><td>A602fm</td> <td>(en option) Pour la surveillance comportementale, Figure 7</td></tr><tr><td>Puralube vetment ointment</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

suivi juxtacellulaire et localisation des neurones unique au sein de structures cérébrales sous-corticales d&#39;alerte, head-rats retenu

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Il existe une variété de techniques pour surveiller l’activité extracellulaire d’unités neuronales uniques. Cependant, la surveillance de cette activité à partir des structures cérébrales profondes chez les animaux au comportement reste un défi technique, surtout si les structures doivent être ciblées de manière stéréotaxique. Ce protocole décrit des techniques chirurgicales et électrophysiologiques pratiques qui maintiennent la tête de l’animal dans le plan stéréotaxique et isolent sans ambiguïté l’activité de pointe des neurones uniques. Le protocole combine l’appuie-tête des rongeurs alertes, la surveillance juxtacellulaire avec des électrodes de micropipette et l’injection de colorant iontophorétique pour identifier l’emplacement des neurones dans l’histologie post-hoc. Bien que chacune de ces techniques soit en soi bien établie, le protocole se concentre sur les spécificités de leur utilisation combinée dans une seule expérience. Ces techniques neurophysiologiques et neuroanatomiques sont associées à un suivi comportemental. Dans le présent exemple, les techniques combinées sont utilisées pour déterminer comment les mouvements de vibrissa auto-générés sont codés dans l’activité des neurones à l’intérieur du thalamus somatosensoriel. Plus généralement, il est simple d’adapter ce protocole pour surveiller l’activité neuronale en conjonction avec une variété de tâches comportementales chez les rats, les souris et d’autres animaux. De manière critique, la combinaison de ces méthodes permet à l’expérimentateur de relier directement des signaux neurophysiologiques anatomiquement identifiés au comportement.

<html> Unités neuronales dans ventrale médiale postérieure (VPM) du thalamus encodage la phase de mouvement de vibrisses pendant l&#39;auto-généré fouettant 15,16. Figure 7A montre échantillon activité de dopage d&#39;une unité thalamique VPM comme un rat est fouettant activement. Figure 7B montre un histogramme de pic fois alignées sur la phase instantanée du mouvement vibrisses 17. Il ya plus de pointes pendant la phase de rétraction de fouettant. Après l&#39;enre...

Ce protocole décrit la conception et l’implantation chirurgicale d’un mécanisme de retenue de la tête pour surveiller l’activité neuronale dans les structures cérébrales sous-corticales chez des rats alertes. Il décrit des procédures permettant d’isoler des neurones uniques dans la configuration juxtacellulaire et d’identifier efficacement leurs emplacements anatomiques.

Suivi juxtacellulaire et localisation des neurones unique au sein de structures cérébrales sous-corticales d&#39;alerte, Head-Rats retenu

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

L'objectif général de cette procédure est de surveiller et de localiser l'activité de neurones individuels au sein des structures cérébrales sous-corticales de rats éveillés maintenus par la tête. Cela est réalisé en habituant d'abord le rat au maintien du corps à l'aide d'une chaussette en tissu. La deuxième étape consiste à implanter chirurgicalement un dispositif de maintien de la tête et une chambre d'enregistrement afin que le rat puisse être maintenu dans le plan stéréotaxique pendant plusieurs séances d'enregistrement ultérieures.Ensuite, le rat est placé dans un berceau approprié pour réaliser les expériences comportementales et électrophysiologiques, et des enregistrements neuronaux juxta-cellulaires sont effectués. Ce processus permet l'isolement sans ambiguïté d'unités individuelles. La dernière étape consiste à marquer l'emplacement anatomique du site d'enregistrement à l'aide du colorant Chicago Sky blue afin de pouvoir le visualiser lors d'une histologie post hoc.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes couramment utilisées, comme l'enregistrement extracellulaire avec des microélectrodes métalliques, est que les potentiels d'action provenant d'unités uniques peuvent être isolés sans ambiguïté et que le site d'enregistrement peut être révélé par histologie post mortem. Pour commencer cette procédure, anesthésiez l'animal à l'aide d'une injection de kétamine et de xylazine. Vérifiez le réflexe de retrait du orteil afin de déterminer le niveau d'anesthésie et maintenez l'anesthésie par des administrations supplémentaires d'anesthésique.Si nécessaire, rasez la tête et désinfectez le site chirurgical avec de l'iodure de povidone. Ensuite, placez le rat dans un cadre stéréotaxique et fixez sa tête à l'aide de barres auriculaires. Pratiquez une incision au scalpel le long de la ligne médiane du crâne, du point médian entre les yeux jusqu'à l'arrière des oreilles.Ensuite, retirez une bande de peau de deux à trois millimètres de large de chaque côté de l'incision. Grattez le périoste pour exposer le crâne jusqu'aux crêtes latérales. Recouvrez ensuite le crâne exposé d'une fine couche de colle cyanoacrylate.Ensuite, percer un petit trou immédiatement postérieur au point où la suture bgma rejoint la crête latérale, selon un angle de 30 à 45 degrés par rapport au crâne. Puis visser une vis machine zéro 80 à fond plat dans le trou selon un angle de 30 à 45 degrés, en prenant soin de ne pas visser trop profondément afin d'éviter d'endommager le tissu cérébral sous-jacent.Répétez cette procédure pour six vis supplémentaires dans cette configuration. Ensuite, appliquez de la colle cyanoacrylate à la base de toutes les vis. Placez maintenant l'aiguille de la seringue dans le manipulateur stéréotaxique.Effectuez une petite indentation dans le crâne à l’aide de l’aiguille afin de marquer un emplacement de référence approprié. Marquez ensuite l’indentation avec un feutre indélébile. Procédez ensuite à une craniotomie centrée sur la coordonnée souhaitée et laissez la dure-mère intacte.Couvrez la craniotomie avec du liquide céphalo-rachidien artificiel modifié. Ensuite, découpez un tube de centrifugation de 0,2 millilitre en un segment de quatre à cinq millimètres de longueur et retirez le bouchon. Placez le tube sur le crâne et centrez-le au-dessus de la craniotomie.Appliquez ensuite du ciment dentaire autour de la base du tube pour sceller le fond du tube au crâne. Veillez à ne pas laisser s'écouler de ciment dans la craniotomie exposée. Percez maintenant un autre petit trou dans la plaque crânienne controlatérale.Insérez soigneusement le fil de référence qui a été soudé à un connecteur à broches. Ensuite, appliquez de la colle super glue dans le trou où le fil a été inséré afin de maintenir la broche et le fil en place. Puis mélangez les deux composants du kit de gel de silicone en quantités égales.Attendre deux minutes et remplir le tube de centrifugeuse avec le gel. Lorsque le tube est environ au tiers de sa capacité, fixer la plaque de maintien à la barre de retenue. Ici, la barre est fixée à une pince de montage en angle droit avec un angle d'inclinaison de 45 degrés.Ensuite, fixez la barre de maintien au bras du manipulateur stéréotaxique à l’aide de la pince de fixation de manière à ce que la barre soit parallèle aux barres auriculaires, puis abaissez la barre et la plaque de sorte que la plaque se situe en arrière de la suture lambda et en avant de la vis coddle mos. Puis saisissez le boulon frontal de la tête selon un angle d’environ 45 degrés à l’aide d’une pince, de façon à ce que la tête de la vis soit orientée vers le bas et vers la queue de l’animal. Abaissez ensuite la vis jusqu’à ce qu’elle touche le crâne.Ensuite, fixez le boulon et la plaque en place à l'aide d'acrylique dentaire. Appliquez une couche de ciment dentaire autour des bords de l'acrylique dentaire afin de cimenter la peau à l'implant. Une fois le ciment sec, percez plusieurs trous dans le bouchon du tube à centrifuger et placez le bouchon sur le tube.Retirez maintenant le clamp. Retirez soigneusement la barre de maintien de la tête du stéréotaxique. Ensuite, retirez la plaque cranienne de la barre.À la fin, retirer l'animal des attaques stéréotaxiques et administrer des soins postopératoires ainsi qu'une surveillance appropriée. Dans cette procédure, utiliser une pipette polo munie d'un tube capillaire en quartz sur une micropipetteuse laser au dioxyde de carbone. Ensuite, fixer la pipette en place sous un microscope à contraste interférentiel différentiel équipé d'un objectif à longue distance de travail.Déplacez lentement un bloc de verre dans le champ de vision à l’aide d’une micropipette. À l’aide du micromanipulateur de la platine, cassez l’extrémité de la pipette en la touchant doucement au verre. Répétez la procédure jusqu’à ce que l’extrémité de la pipette.Le diamètre extérieur est compris entre un et trois micromètres. Ensuite, préparez la solution saline extracellulaire et ajoutez 2 % de Chicago sky blue. À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 30, remplissez l’extrémité arrière de la pipette avec une solution.Ensuite, placez le rat dans la chaussette en tissu et transférez la chaussette en tissu dans un tube rigide sur un dispositif expérimental approprié. Fixez la plaque de contention de la tête du rat à la pièce correspondante du dispositif. Placez ensuite un écrou 8 32 sur le boulon de contention crânienne implanté sur le rat.Ensuite, vissez une tige filetée en acier inoxydable sur le boulon de fixation. Puis, ouvrez la chambre d'enregistrement et retirez le gel de silicone. Nettoyez la craniotomie à l'aide de pinces fines.Si un tissu a régénéré dans la craniotomie, utilisez une anesthésie à l'isoflurane pendant ce processus si nécessaire. Ensuite, fixez la pipette au micromanipulateur motorisé. Déplacez la pipette à l'emplacement d'enregistrement souhaité selon les axes antérieur, postérieur et latéral médian.Ensuite, avancer la pipette vers l'avant à travers la dure-mère jusqu'à ce qu'elle se trouve à environ 500 micromètres au-dessus du site d'enregistrement prévu. Faire progresser lentement la pipette tout en écoutant les événements de décharge sur un moniteur audio du voltage amplifié enregistré. Une fois les événements de décharge identifiés, continuer à déplacer la pipette d'environ zéro à 100 micromètres jusqu'à ce que les déflexions de voltage positives dépassent environ 500 microvolts.Pour marquer le site d'enregistrement, réglez la source de courant à moins quatre microampères avec des impulsions de deux secondes à un cycle de service de 50 %, puis appliquez le courant pendant quatre minutes pour effectuer l'ionophorèse, en injectant du bleu Chicago sky blue à travers la pipette. Après l'expérience, perfusez l'animal selon les pratiques habituelles. Ensuite, sectionnez le cerveau et réalisez une contre-coloration si nécessaire afin d'identifier l'emplacement anatomique du site d'enregistrement indiqué.Voici l'activité de décharge d'une unité thalamique VPM pendant qu'un rat effectue activement un mouvement de vibrisses. Voici un histogramme des temps de décharge alignés sur la phase instantanée du mouvement de vibration. On observe davantage de décharges pendant la phase de rétraction du mouvement de vibrisses.Après l'enregistrement, l'emplacement de cette unité a été marqué par l'aphorèse du colorant Chicago sky blue. Comme indiqué ici, le tissu est contre-coloré pour l'activité de la cytochrome oxydase afin de révéler les limites neuroanatomiques du thalamus VPM. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des techniques chirurgicales et électrophysiologiques permettant de maintenir la tête de l'animal dans le plan stéréotaxique et d'isoler sans ambiguïté l'activité potentielle de neurones individuels.

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Neurosciences

La surveillance des niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire dans les régions cérébrales distinctes d'animaux se déplaçant librement offre un aperçu sur le lien entre la libération des neurotransmetteurs et des comportements. En microdialyse in vivo couplée à une détection électrochimique fournit anatomiques et une résolution excellentes chimiques et des informations sur la façon dont la neurotransmission basale est altérée par des manipulations pharmacologiques ou physiologiques.

Survivable chirurgie stéréotaxique chez les rongeurs

Enregistrements extracellulaires de l'activité neuronale en utilisant des sondes de silicium chez le rat anesthésié seront décrites. Cette technique permet d'obtenir des informations à travers de multiples zones du cerveau de plus de 100 neurones simultanément. Il fournit des informations avec une résolution cellule unique sur la dynamique des ensembles neuronaux dans de multiples circuits locaux.

Enregistrement à grande échelle ensembles neuronaux avec des sondes en silicone chez le rat anesthésié

Cette vidéo montre la procédure détaillée de préparation d’un rat anesthésié pour les enregistrements électrophysiologiques de l’activité cérébrale à partir de plusieurs sites. Le cuir chevelu est disséqué pour accéder au crâne, et des trous sont percés à des endroits précis pour installer et fixer les électrodes. Des électrodes à microfils de tungstène sont ensuite insérées à l’endroit ciblé pour enregistrer les données.

Enregistrements électrophysiologiques in vivo d’activités cérébrales provenant de plusieurs sites chez le rat

Source : Maruoka, H., et. al.  Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez les souris éveillées. J. vis. exp..  (2022) Cette vidéo montre une procédure de microscopie à deux photons pour imager l’activité neuronale et la dynamique microgliale chez une souris éveillée pendant une stimulation visuelle, en mettant en évidence les transitoires calciques et les interactions cellulaires.

Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez une souris éveillée

Source : Moore, J. D., et al. Surveillance juxtacellulaire et localisation de neurones uniques au sein des structures cérébrales sous-corticales de rats alertes et retenus par la tête. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la méthode d’enregistrement et de coloration juxtacellulaire chez un rat atténué et éveillé. La procédure consiste à enregistrer les signaux des neurones et à injecter un colorant pour localiser précisément le site d’enregistrement. Cette technique permet une cartographie...

Enregistrement et coloration juxtacellulaires pour une cartographie précise de l’activité neuronale chez un rat éveillé 

Source : Lai, J., et al. Enregistrement électrophysiologique simultané et micro-injections d’agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre une technique basée sur la micro-injection pour l’enregistrement neuronal simultané et l’inhibition dans le colliculus supérieur du rat. La procédure implique un ciblage stéréotaxique, un forage du crâne et l’insertion d’un injectrode, qui délivre un neurotransmetteur inhibiteur tout en enregistrant l’activité...

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Suivi juxtacellulaire et localisation des neurones unique au sein de structures cérébrales sous-corticales dalerte, Head-Rats retenu (Vidéo) | JoVE Journal

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