Name: Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de lensemble du génome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Apprenez le fractionnement des polysomes pour analyser l'activité de traduction de l'ARNm à l'échelle du génome entier. Cette méthode isole les ribosomes actifs et évalue les changements de traduction dans les cellules.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été financée par les Instituts de recherche en santé (subvention des IRSC RdP-115195) et FRQ-S à l&#39;informatique, qui est également récipiendaire du Prix du jeune chercheur des IRSC; et le Conseil suédois de la recherche et de la Société suédoise du cancer pour OL

<ol><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li>
<li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li>
<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li>
<li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes%3A+a+systems+biology+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes%3A+mechanisms+and+biological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li>
<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li>
<li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li>
<li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li>
<li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li>
<li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li>
<li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer%3A+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li>
<li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li>
<li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+neurodegeneration%3A+role+and+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li>
<li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li>
<li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%3A+from+growth+signal+integration+to+cancer%2C+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li>
<li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li>
<li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1%2Fc-Jun+N-Terminal+Kinase%2FEukaryotic+Elongation+Factor+1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li>
<li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li>
<li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li>
<li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li>
<li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li>
<li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li>
<li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li>
<li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li>
<li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+translational+control+in+CD4%2B+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13(2013).</li>
<li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li>
<li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li>
<li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li>
<li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Cet article décrit un protocole polysome fractionnement bien établie suivie par une méthode d&#39;analyse développés en interne pour la capture des modifications qualitatives et quantitatives de l&#39;activité de traduction à l&#39;échelle du génome dans les cellules de mammifères. Pour la réussite de ce protocole une attention particulière devrait être accordée à 1) Cellule de confluence (comme les taux de prolifération et la disponibilité des éléments nutritifs en corrélation avec l&#39;activité de traduction de l&#39;ARNm et peuvent affecter la composition de la translatome, confluence cellulaire doit être homogène pour les répétitions et les conditions expérimentales), 2) la lyse cellulaire rapide (Malgré la présence de cycloheximide et les inhibiteurs de RNAse dans des tampons, lyse doit être rapide et extraits cellulaires doivent être superposées sur des gradients de saccharose, immédiatement après la lyse de prévenir la dégradation de l&#39;ARN et la dissociation des polysomes), 3) la préparation de gradient (pour s&#39;assurer grande reproductibilité des données, des gradients de saccharose doivent être préparés en utilisant la machine à gradient et spésoins sociale devrait être prise lors de leur manipulation). En plus d&#39;étudier les changements dans l&#39;activité de traduction, ce protocole peut être utilisé pour isoler des complexes protéiques ribosomes associés et établir leurs fonctions physiologiques. A cet effet, les niveaux et l&#39;état de phosphorylation de diverses protéines de ribosomes associés peuvent être déterminés par précipitation au TCA, suivis par transfert de Western, tandis que les complexes protéiques ribosomes associés peuvent être immunoprécipités à partir de fractions de gradient et analysées par Western blot ou spectrométrie de masse. Un inconvénient de cette technique est que la méthode de fraction de gradient lent pourrait entraîner la dissociation des protéines même étroitement liées dont la cinétique de liaison sont en rapide association / dissociation. Les facteurs associés à des polypeptides nouvellement synthétisés sont des exemples typiques. Des polypeptides nouvellement synthétisés émergents former les ribosomes peuvent être immobilisés sur des complexes protéiques associés à des ribosomes à l&#39;aide des agents de reticulation chimiques tels que le 3, 3&#39;-dithiobis [suifosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Cette approche a révélé que le récepteur pour C activée Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / facteur eucaryote d&#39;élongation traduction 1A2 (eEF1A2) complexe régule la dégradation des polypeptides nouvellement synthétisés en réponse au stress 27. En outre, la méthodologie similaire a été utilisée dans des études montrant que la protéine kinase C BII (PKCbII) est recruté pour ribosomes par RACK1 32 et que l&#39;activation du complexe mTOR 2 (mTORC2) se produit sur ​​les ribosomes où elle phosphoryle polypeptides AKT nouvellement synthétisées et réglemente leur stabilité 33,34. Les principales limites de la méthode polysomes de fractionnement, suivi par une analyse de Anota sont les suivants: 1) l&#39;exigence d&#39;un nombre relativement élevé de cellules (~ 15 x 10 6 cellules), 2) l&#39;absence d&#39;une information de position en ce qui concerne la localisation du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné, et 3 ) les questions liées à hétéro cellulaire et moléculairenéité de tissus normaux et tumoraux. Les questions liées au nombre de cellules nécessaires peuvent être résolus par l&#39;alignement des pics des spectres d&#39;absorbance correspondant à monosomes (80S) de cellules dont les montants sont de limiter à ceux obtenus à partir de cellules de haute abondance (par exemple des cellules HeLa) 35. Technique de profilage ribosome (voir ci-dessous) peut être utilisé pour déterminer la position exacte du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné, tandis que les questions liées aux effets de confusion de l&#39;hétérogénéité des tissus sur l&#39;interprétation des changements dans l&#39;expression des gènes obtenus à partir de systèmes complexes tels que les tissus humains sont discutés en détail dans une publication de poireaux et Storey 36. Récemment, une nouvelle technique de profilage ribosome a été développé, dans lequel des fragments de ribosome protégées (PRSA) sont générés par le traitement RNase I et analysés par séquençage profond 22. Cette technique permet de déterminer la position du ribosome à une résolution d&#39;un seul nucléotide, fournissant ainsi jusqu&#39;à UNPRidées ecedented en biologie ribosome. Par exemple, le profilage ribosome peut être utilisé pour la détermination de la densité du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné ou l&#39;identification des éléments que les taux traduction de l&#39;influence d&#39;initiation tels que les sites d&#39;initiation alternatifs, initiation aux codons non-AUG et des éléments de régulation tels que uORFs. Cependant, il existe plusieurs limites méthodologiques qui limitent la capacité de profilage ribosome d&#39;estimer avec précision l&#39;efficacité de traduction de l&#39;ARNm. Il s&#39;agit notamment des biais indépendants introduites par fragmentation aléatoire et RNAse je digestion, les biais introduits par les inhibiteurs de la traduction (par exemple des inhibiteurs allongement tels que l&#39;émétine et cycloheximide sont susceptibles d&#39;induire une accumulation ribosome à des sites d&#39;initiation de la traduction), un grand nombre de faux résultats positifs et faux négatifs associés avec des scores TE ainsi que leur imprécision dans la prédiction du lit qui proviennent d&#39;ARNm codant la protéine 37. Peut-être le plus important, alors queprofilage ribosome permet l&#39;identification directe de la position du ribosome sur une molécule d&#39;ARNm donné, le nombre de ribosomes qui est associé à un ARNm donné est estimée indirectement par la normalisation des fréquences de lit dans RPF (ARNm au ribosome-associé) au-dessus de celles observées dans les ARNm de façon aléatoire fragmentés (total ARNm). Par exemple, dans un cadre simple où quatre molécules d&#39;ARNm «B» (Ba, Bb, Bc et Bd) sont occupés par quatre ribosomes dans les positions 1, 2, 3 et 4, une lacune inhérente à la technique de profilage de ribosome ne permettra pas une distinction entre un scénario où les 4 ribosomes associent uniquement avec un Ba ARNm dans les positions 1, 2, 3, et 4 et un scénario où Ba, Bb, Bc et Bd ARNm sont occupées chacune par un seul ribosome à la position 1, 2 , 3, et 4, respectivement. En revanche, au cours de polysomes fractionnement, polysomes intégrité est préservée, ce qui permet l&#39;isolement de pools d&#39;ARNm associées à un nombre défini de ribosomes (figure 1). Cette importationdistinction fourmi entre polysome fractionnement et le profilage ribosome suggère que tandis que la première méthode peut être utilisée pour comparer directement les ARNm dans mRNP, fractions légères et polysomes lourds, cette dernière méthode sera probablement pas à tenir compte des changements dans la translatome qui sont causées par des ARNm que la transition de s&#39;allume pour polysomes lourds, tout en surestimant la contribution de ceux qui passer de la fraction mRNP à polysomes lourds. La signification biologique de ces différences entre les méthodes mentionnées ci-dessus est mise en évidence par une grande partie des données montrant que l&#39;activation de la translation d&#39;un sous-ensemble d&#39;ARNm telles que celles qui sont eIF4E-sensible, de la transition du clair au polysomes lourds, tandis que d&#39;autres, tels que ceux abritant éléments 5&#39;TOP, sont recrutés pour polysomes lourds directement à partir de pools de libre ribosome-ARNm 6. Fait intéressant, la voie mTOR a été montré pour moduler de façon concomitante traduction pour &quot;eIF4E sensible&quot; et une 5&#39;TOP ARNm1. Par conséquent, les différences méthodologiques qui sont discutés ci-dessus peuvent expliquer la discordance apparente de la conclusion d&#39;une étude à l&#39;aide de ribosome profilage 38,39 et polysome fractionnement 24 pour évaluer les effets de l&#39;inhibition de mTOR sur la translatome. En conclusion, les polysomes fractionnement et le profilage ribosome sont des méthodes complémentaires qui fournissent principalement des informations concernant le nombre de ribosomes associés à l&#39;ARNm et de la position du ribosome sur l&#39;ARNm, respectivement. Surtout, malgré les insuffisances et les avantages de ces méthodes, il demeure essentiel que les données de l&#39;ensemble du génome obtenus par les deux procédures sont correctement analysés et fonctionnel et biochimique validés.

Les réseaux de régulation qui contrôlent l&#39;expression des gènes ont été étudiés dans les deux dernières décennies. La grande majorité de ces efforts de recherche axés sur la régulation transcriptionnelle, de sorte que des changements dans les niveaux d&#39;ARNm à l&#39;état stable à l&#39;échelle du génome entier ont été utilisés pour déterminer les profils dits «expression génique». Des études récentes révèlent que les niveaux d&#39;ARNm de l&#39;état d&#39;équilibre correspondent que faiblement à la composition du protéome 1,2, ce qui indique que les mécanismes post-transcriptionnels, y compris la traduction de l&#39;ARNm, jouent un rôle majeur dans la régulation de l&#39;expression génique 3,4. En effet, il a été estimé que ~ 50% des taux de protéines sont déterminés au niveau de la traduction de l&#39;ARNm dans des fibroblastes de souris immortalisées 5. traduction de l&#39;ARNm est un processus hautement régulé au cours de laquelle les ARNm sont traduits en protéines par une action orchestrée des ribosomes, les ARN de transfert (ARNt) et les facteurs accessoires commonly dénommé facteurs de traduction (TFS) 6. La synthèse des protéines est un processus qui consomme le plus d&#39;énergie dans les cellules de mammifères 7 et donc des taux de traduction de l&#39;ARNm globales sont ajustés pour tenir compte de la disponibilité des nutriments et des taux de prolifération des cellules 8. En plus de modifications dans les taux globaux de la traduction de l&#39;ARNm, divers stimuli extracellulaires (par exemple, les hormones et facteurs de croissance), des indices intracellulaires (par exemple les niveaux d&#39;acides aminés) et différents types de stress (par exemple ER-stress) induire des changements sélectifs dans les piscines d&#39;ARNm qui sont cours de traduction (translatome) 6. Selon le type de stimulus, l&#39;activité de traduction de certains, mais pas tous les ARNm sont considérablement affectées, ce qui conduit à des changements dans le protéome qui sont nécessaires pour monter une réponse cellulaire rapide 6. Ces changements qualitatifs et quantitatifs dans le translatome sont pensés pour être médiée par l&#39;interaction entre les facteurs agissant en trans (par exemple, </em&gt; composants de machinerie traductionnelle, les facteurs auxiliaires ou miARN) et cis-éléments (éléments d&#39;ARN ou caractéristiques) présents dans certains sous-ensembles d&#39;ARNm 6,9. Par exemple, des changements dans les niveaux et / ou l&#39;activité de limitation de vitesse initiation de la traduction eIF4E et facteurs eIF2 modulent sélectivement traduction des transcriptions sur la base des caractéristiques spécifiques 5&#39;UTR 6. eIF4E et eIF2 sont nécessaires pour le recrutement de l&#39;ARNm et l&#39;ARNt initiateur au ribosome, respectivement 6. Une augmentation de l&#39;activité de eIF4E renforce sélectivement la traduction des ARNm hébergeant 5&#39;UTR longues et très structurées, y compris ceux codant pour la prolifération et la survie stimule les protéines, y compris les cyclines, c-myc et Bcl-XL 10. À son tour, l&#39;inactivation de eIF2 conduit à la synthèse d&#39;une protéine arrêt global, tout en régulant de manière sélective jusqu&#39;à la traduction des ARNm contenant des inhibiteurs de courtes amont des cadres de lecture ouverts (uORFs) dans leurs 5&#39;UTR, tels que ceux codant maître trégulateurs ranscriptional de la réponse de la protéine dépliée (par exemple ATF4). En réponse à divers stimuli, y compris les nutriments, les facteurs de croissance et les hormones, la cible mécaniste / mammalienne de la rapamycine (mTOR) voie stimule l&#39;activité de eIF4E en inactivant la protéine 4E-liaison (4E-BP) de la famille des suppresseurs de la traduction, alors que la voie MAPK phosphorylé directement EIF4E 6,11. À leur tour, les kinases eIF2α (c.-à-PERK, PKR, HRI et GCN2) inhibent la phosphorylation de eIF2 par sa sous-unité régulatrice eIF2α en réponse à une carence en nutriments, ER-stress et infection par le virus 6,12. Les modifications de l&#39;activité et / ou l&#39;expression de facteurs de transcription, d&#39;autres composants de la machinerie de translation et de facteurs de régulation, y compris miARN ont été observées dans divers états pathologiques y compris le cancer, les syndromes métaboliques, les troubles neurologiques et psychiatriques, et les maladies cardio-vasculaires et rénales 13-19. Collectivement, ces données indiquent que translationnelle moicanismes jouent un rôle essentiel dans le maintien de l&#39;homéostasie de la cellule et que leur abrogation joue un rôle central dans l&#39;étiologie de diverses maladies humaines. Ici, un protocole pour le fractionnement des polysomes par centrifugation sur gradient de saccharose de densité dans des cellules de mammifère, qui est utilisé pour séparer les polysomes monosomes, à partir de sous-unités ribosomiques et messagers particules de ribonucléoprotéines (les mRNP) est décrite. Cela permet une discrimination entre traduit efficacement (associé à polysomes lourds) de mal traduits (associé à polysomes légers) ARNm. Dans ce dosage, les ribosomes sont immobilisés sur la traduction de l&#39;ARNm en utilisant des inhibiteurs d&#39;allongement tels que la cycloheximide 20 et des extraits cytosoliques sont séparés sur 5-50% de saccharose linéaire des gradients de densité par ultracentrifugation. Fractionnement ultérieur des gradients de saccharose permet l&#39;isolement d&#39;ARNm en fonction du nombre de ribosomes se lient à elles. ARN extrait à partir de chaque fraction peut être ensuite utilisée pour déterminerdes changements dans la distribution des ARNm à travers le gradient entre des conditions différentes, de sorte que l&#39;efficacité de translation augmente à partir du haut vers le bas de la pente. Northern blot ou transcription inverse polymérase quantitative de la chaîne (qRT-PCR) sont utilisées pour déterminer les niveaux d&#39;ARNm dans chaque fraction. Alternativement, les fractions contenant polysomes lourds (généralement plus de 3 ribosomes) sont regroupées et les taux d&#39;ARNm de polysomes associés génome entier sont déterminées à l&#39;aide microarray ou séquençage profond. Il est de la plus haute importance de souligner que les niveaux d&#39;ARNm de polysomes associés sont, en plus de la traduction, affecté par des mécanismes de transcription et de post-transcriptionnel qui influent sur ​​les niveaux de ARNm cytosolique 21. Par conséquent, afin de déterminer les différences de translation à l&#39;aide des données de l&#39;ensemble du génome à partir d&#39;ARNm de polysomes associée, il est nécessaire de corriger les effets des étapes de la voie de l&#39;expression des gènes qui sont en amont de traduction 21. Pour permettre une telle correction, ARN cytosolique est préparé en parallèle avec l&#39;ARN de polysome-associé de chaque échantillon et les taux d&#39;ARNm de l&#39;état d&#39;équilibre du génome sont déterminés 21. Actuellement, soi-disant «traduction-efficacité&quot; (TE) marque (c&#39;est à dire le journal de rapport entre les données d&#39;ARNm polysomes associés et les données d&#39;ARNm cytosolique) sont souvent employés pour corriger les effets des changements dans les niveaux d&#39;ARNm cytosolique sur la traduction efficacité d&#39;un compte tenu de l&#39;ARNm 22. Cependant, en utilisant les scores TE pour identifier traduction différentiel est associée à un nombre important de faux résultats positifs et faux négatifs en raison d&#39;une propriété mathématique des scores TE communément appelés corrélation comme faux 27. En effet, une enquête sur les ensembles de données provenant de plusieurs laboratoires indiqué que ces fausses corrélations semblent inévitables lors de l&#39;analyse des changements dans les translatomes 23. Cela a incité le développement de l &#39;«analyse de tr différentiel<html> anslation &quot;(Anota) algorithme, ce qui ne présente pas les inconvénients précités 23. Pendant Anota-analyse d&#39;un modèle de régression est utilisée pour dériver des mesures de l&#39;activité de translation indépendants des niveaux d&#39;ARN cytosoliques. Ces mesures sont ensuite comparées entre les conditions et une statistique est calculée. L&#39;utilisateur a la possibilité d&#39;application d&#39;un procédé de retrait de la variance, ce qui permet d&#39;améliorer la puissance statistique et réduit l&#39;apparition de résultats faussement positifs dans les études avec quelques répétitions 24. De manière significative, il a été récemment démontré que des perturbations dans la translatome capturés par Anota, mais pas les partitions TE, en corrélation avec les changements dans le protéome 25. Par conséquent, il est fortement recommandé d&#39;appliquer l&#39;analyse de Anota pour l&#39;identification des changements de traduction à l&#39;échelle du génome entier. Alors que les fondements théoriques de l&#39;algorithme de Anota ont été discutés en détail précédemment 21,23,26, ici l&#39;accent est mis sur la façon de l&#39;appliquer dans la pratique. ve_content &quot;&gt; En plus de l&#39;étude des changements dans l&#39;activité de traduction de l&#39;ARNm dans la cellule, ce protocole de fractionnement ribosome peut être utilisé pour isoler et biochimiquement et fonctionnellement caractériser-et ribosome complexes protéiques polysomes associés. Cette approche a bien été déployée dans le passé pour identifier complexes qui régissent la stabilité des polypeptides nouvellement synthétisés 27 et / ou sont impliquées dans la phosphorylation des composants de la machinerie traductionnelle. Cette application de la méthode de fractionnement polysome seront également brièvement discutées.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Biobasic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>CABDH4532</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Biobasic</td><td>DB0058</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biobasic</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>Support de précipitation d’ARN</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>04693132001</td><td>Comprimés (sans EDTA)</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>0,45 et micro ; m Système de filtration 150 ml</td><td>Corning</td><td>431155</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit de nettoyage&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Kit de nettoyage de l’ARN</td></tr><tr><td>Tubes à ultracentrifugeuse polyallomères à paroi mince.</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti Rotor Pack avec accessoires</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Optima L100 XP ultra centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-9340A</td><td></td></tr><tr><td>ISCO collecteur de fractions&nbsp ;</td><td>Brandel</td><td>FC-176-R1</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de type II avec enregistreur graphique</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>Détecteur UV</td></tr><tr><td>Perceur de tube avec cellule d’écoulement et pompe à seringue</td><td>Brandel</td><td>BR-A86-5</td><td></td></tr><tr><td>UA-6 Câble de détection</td><td>Brandel</td><td>60-1020-211</td><td></td></tr><tr><td>FC-176 Câble de communication</td><td>Brandel</td><td>FCC-176</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Master Base Unit</td><td>Biocomp</td><td>108-1</td><td>Gradient Maker</td></tr><tr><td>Accessoires de formation de gradient</td><td>Biocomp</td><td>105-914A-1R</td><td>Accessoire Gradient Maker</td></tr><tr><td>Calcul Appareil d’acquisition de données 8 canaux 50 kHz</td><td>MicroDAQ</td><td>USB-1208FS</td><td>Accessoire logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition de données de calcul de mesure Logiciel d’acquisition de données</td><td>MicroDAQ</td><td>TracerDAQ Pro</td><td>Logiciel d’analyse (téléchargement uniquement)</td></tr><tr><td>10x tampon pour gradients de saccharose :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM HEPES (pH7.6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; g/ml cycloheximide</td> 1x cocktail d’inhibiteurs de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>protéase (sans EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 unités/ml Inhibiteur</td><td></td><td></td><td></td>de RNase</tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td><td></td>de lyse</tr><tr><td>5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM KCl&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x cocktail d’inhibiteurs de protéase (sans EDTA)]</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ajoutez ensuite du cycloheximide (CHX), du DTT, un inhibiteur de RNAse, du Triton et du désoxycholate de sodium comme indiqué dans le texte</td><td></td><td></td><td></td> principal</tr></tbody></table>

polysome fractionnement et analyse des mammifères translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

traduction de l&#39;ARNm joue un rôle central dans la régulation de l&#39;expression génique et représente le processus de consommer de l&#39;énergie dans les cellules de mammifères plus. En conséquence, la dérégulation de la traduction des ARNm est considéré à jouer un rôle majeur dans une variété d&#39;états pathologiques dont le cancer. Ribosomes accueillent également les accompagnateurs, qui facilitent le pliage des polypeptides naissants, modulant ainsi la fonction et la stabilité des polypeptides nouvellement synthétisés. En outre, les données indiquent que les ribosomes émergents servent de plate-forme pour un répertoire de molécules de signalisation, qui sont impliqués dans une variété de modifications post-traductionnelles des polypeptides nouvellement synthétisés tels qu&#39;ils ressortent de la ribosome, et / ou des composants de la machinerie de translation. Ici, un procédé bien établi de fractionnement ribosome utilisant la centrifugation en gradient de densité de sucrose est décrite. En collaboration avec les pays développés &quot;Anota&quot; algorithme interne cette méthode permet la détermination directe de différentiel de traduction des ARNm individuels à l&#39;échelle du génome entier. De plus, ce protocole polyvalent peut être utilisé pour une variété d&#39;études biochimiques visant à disséquer la fonction des complexes protéiques associés au ribosome, y compris celles qui jouent un rôle central dans le repliement et la dégradation des polypeptides nouvellement synthétisés.

mTOR est un nœud important du réseau cellulaire qui coordonne les taux globaux de synthèse de protéines à la disponibilité des éléments nutritifs 19. traduction de l&#39;ARNm est régulée principalement à l&#39;initiation étape de limitation de vitesse 6. La proportion de ribosomes engagés dans les polysomes corrélation positive avec les taux d&#39;initiation de traduction 28. Un exemple d&#39;application de la méthode de fractionnement polysome pour étudier le rôle de la signalisation de mTOR dans la médiation des effets de l&#39;insuline sur la traduction de l&#39;ARNm est présenté. A cette fin, des cellules de cancer du sein humain MCF7 ont été maintenues dans du sérum bas et ensuite stimulées par l&#39;insuline seule ou en combinaison avec l&#39;inhibiteur de mTOR site actif Torin1. Les cellules non stimulées qui ont été constamment maintenus en bas sérum, ont servi de contrôle. mRNP, monosome (80S) et des fractions de polysomes ont été séparés en utilisant la méthode polysome de fractionnement. Par rapport aux cellules témoins, l&#39;insuline a induit une augmentation de l&#39;absorbance dans les fractions de gradient correspondantde polysomes, accompagnée d&#39;une diminution concomitante de l&#39;absorbance de la fraction d&#39;monosome (figure 1). Ces résultats montrent que la proportion de ribosomes engagés dans les polysomes l&#39;insuline est augmentée dans les traités par rapport aux cellules témoins, indiquant donc que, comme on s&#39;y attendait, l&#39;insuline stimule les taux globaux d&#39;initiation de traduction. Torin1 inversé les effets de l&#39;insuline sur les profils d&#39;absorbance (Figure 1), ce qui confirme les conclusions que la signalisation mTOR joue un rôle majeur dans la médiation des effets de l&#39;insuline sur la machinerie de traduction 19. Basé sur un principe que les incohérences dans la préparation gradient ne peuvent être évités, des questions ont été soulevées quant à la reproductibilité des données obtenues en utilisant la méthode de fractionnement polysome 22. Pour tester empiriquement cette question potentiellement délétère, cytosolique et ARN polysome associée lourd (ARNm associé à 4 et plus de ribosomes) ont été isolés<html> à partir de cellules MCF7 traitées par l&#39;insuline seule ou en combinaison avec de l&#39;insuline à partir de 4 répétitions Torin1 biologiques indépendants (figure 2). Les effets de l&#39;insuline et Torin1 sur la composition du cytosolique et lourd ARNm polysome associée à chaque répétition a été déterminée sur une échelle du génome entier en utilisant une approche de microarray. Afin de déterminer la reproductibilité de la méthode de fractionnement polysomes l&#39;analyse en composantes principales (ACP) a été appliquée. Cette analyse a montré que les échantillons appartenant à chaque état ​​ont été positionnés fermement dans les deux premiers composants, tandis que les différentes conditions ont été bien séparés (Figure 2). Ces résultats montrent que la méthode de fractionnement polysome comme décrit ici est hautement reproductible et donc d&#39;étudier les changements quantitatifs et qualitatifs de la traduction au niveau de l&#39;ensemble du génome. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Profils polysomal montrant les effets de la privation de sérum, de l&#39;insuline et mTOR signalisation sur la conversion global dans les cellules MCF7. Des cellules MCF7 ont été privées de nutriments (maintenues dans 0,1% de FBS) pendant 16 heures et traitées avec 5 nM d&#39;insuline (Ins), seul ou en combinaison avec 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) pendant 4 heures. Cellules non traitées qui ont été continuellement privés de nutriments (0,1% de FBS) ont été utilisés comme contrôle. Les extraits cytosoliques correspondants ont été sédimentées par centrifugation sur des gradients de 5 à 50% de saccharose. Sous-unités ribosomiques libres (40S et 60S), monosomes (80S) et le nombre de ribosomes dans les fractions de polysomes sont indiqués. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Figure 2. Données Genome-Wide obtenus en utilisant polysome profilage est hautement reproductible. des cellules MCF7 ont été traitées comme dans la figure 1. cytosolique et l&#39;ARN de polysomes-associés (&gt; 3 ribosomes) a été extrait à partir de 4 répétitions biologiques indépendants et leurs niveaux d&#39;ARNm de l&#39;ensemble du génome ont été déterminées en utilisant des tableaux GeneTitan (Affymetrix). PCA a été utilisé pour évaluer la reproductibilité des données résultantes. Présentés sont les deux premiers éléments de l&#39;APC pour tous les traitements (T1 = Torin 1; ctrl = contrôle; Ins = insuline), l&#39;origine de l&#39;ARN (C = cytosolique; P = polysome associé) et réplique. Les échantillons provenant de la même condition et l&#39;origine de l&#39;ARN sont étroitement positionnés indiquant une reproductibilité élevée.

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l&#39;efficacité de la traduction des ARNm individuels à l&#39;échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l&#39;analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler les polysomes ribosomaux en cours de traduction afin d'étudier les modifications de l'activité de traduction des ARNm dans la cellule. Cette opération s'effectue en ajoutant du cycloheximide au milieu de croissance afin de figer les ribosomes sur l'ARNm, empêchant ainsi la dissociation des ribosomes dans une deuxième étape. Les ribosomes sont extraits des cellules et séparés selon leur densité par centrifugation en gradient de saccharose afin de quantifier et d'isoler les sous-unités ribosomales libres (40S et 60S), les monosomes et les polysomes ribosomaux en cours de traduction.Ensuite, des ARN ou des protéines peuvent être extraits des fractions de saccharose afin d'analyser respectivement l'abondance des ARNm et des protéines dans les fractions pré- et polysomales. Les résultats montrent des changements quantitatifs et qualitatifs dans la traduction des ARNm, qui peuvent être examinés à l'échelle du génome entier à l'aide de puces à ADN ou de séquençage ARN de nouvelle génération, puis analysés à l'aide d'un algorithme NoDa. La méthode de profilage par empoisonnement peut être utilisée pour répondre à des questions majeures concernant la régulation de l'expression génique au niveau post-transcriptionnel, telles que le suivi des modifications de la traduction des ARNm à l'échelle du génome entier, ainsi que l'association des protéines avec le ribosome et les polysomes.Valentina Gand, chercheuse associée dans notre laboratoire, démontrera cette technique. Pour commencer, préparez 100 millilitres d'une solution de saccharose à 60 % poids par volume dans de l'eau distillée désionisée, puis filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 micromètre. Ensuite, diluez la solution de saccharose à 60 % dans un tampon pour gradient de saccharose 1 X afin d'obtenir 40 millilitres de solutions de saccharose à 5 % et à 50 %. Utilisez le bloc-marieur fourni avec l'unité de gradient pour marquer le point correspondant à la moitié de la hauteur sur six tubes d'ultracentrifugation en polyallomère.Ensuite, utilisez le dispositif de superposition pour ajouter la solution de saccharose à 5 % jusqu’au point à demi rempli. Ajoutez ensuite la solution de saccharose à 50 % au fond du tube jusqu’à ce que l’interface entre les deux solutions atteigne le point à demi rempli. Fermez les tubes avec des bouchons zonals et placez les tubes scellés dans le support de tubes sur le générateur de gradient. Faites fonctionner le générateur de gradient afin d’obtenir un gradient linéaire allant de 5 % à 50 %. Le générateur de gradient fait tourner les tubes selon un angle d’inclinaison élevé, formant ainsi six gradients linéaires en quelques minutes.Le jour de l'expérience, les cellules doivent être environ à 80 % de confluence. Traiter les cellules avec 100 microgrammes par millilitre de cycloheximide dans le milieu de croissance et incuber cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS glacé contenant 100 microgrammes par millilitre de cycloheximide. Puis ajouter cinq millilitres supplémentaires de la solution de PBS glacé.Grattez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres pour centrifuger les cellules à 200 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans 425 microlitres de tampon d'lyse hypotonique. Ajoutez ensuite cinq microlitres de cycloheximide à 10 milligrammes par millilitre, un microlitre de DTT à un molaire et 100 unités d'inhibiteur d'ARNs à la suspension cellulaire.Ensuite, vortexer la solution pendant cinq secondes. Compléter la suspension cellulaire avec 25 microlitres de Triton X à 10 % et 125 microlitres de désoxycholate de sodium à 10 %, puis vortexer pendant cinq secondes supplémentaires. Ensuite, centrifuger les lysats à 16 000 ×g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre prérefroidi et conservez 10 % du lysat comme témoin pour mesurer les niveaux d'ARNm MR à l'état stationnaire. Mesurez l'OD à 260 nanomètres pour chaque échantillon de lysat, puis ajustez-les à la même OD dans du tampon de lyse hypotonique avec un volume final de 500 microlitres. Retirez 500 microlitres depuis le haut des gradients de saccharose, puis déposez les échantillons de lysat ajustés sur la partie supérieure de chaque gradient.Ensuite, peser et équilibrer chaque tube de gradient. Placer les tubes dans un rotor SW 41 TI et mettre l'ultracentrifugeuse en mode de faible freinage. Puis centrifuger les échantillons à 222,228 ×g pendant deux heures à quatre degrés Celsius.Lorsque l'ultracentrifugation est terminée, retirez soigneusement les tubes de gradient du rotor et placez-les sur de la glace. Commencez par remplir le collecteur de fractions avec des tubes de collecte de deux millilitres. Ensuite, allumez la pompe informatisée, le détecteur UV et le collecteur de fractions une demi-heure avant la collecte des fractions.Régler la pompe pour qu'elle fonctionne à trois millilitres par minute, puis remplir le tube avec une solution de chasse pour éliminer l'air du système. Faire circuler la solution de chasse dans le tube jusqu'à ce qu'une goutte sorte de l'aiguille. Ouvrir le logiciel d'analyse.Ensuite, réglez la sensibilité à plus ou moins 10 milliélectrons-volts et la base de temps à 100 secondes. Placez le tube d'ultracentrifugation dans le détecteur UV et assurez-vous que le tube est en position orthogonale. Ensuite, tournez le bouton situé sous le support du tube pour percer le tube avec l'aiguille.Régler le débit de la pompe à 1,5 millilitre par minute et configurer le collecteur de fractions pour recueillir une fraction toutes les 30 secondes, ce qui correspond à 750 microlitres par fraction. Placer la pompe en position télécommandée. Ensuite, démarrer la pompe et le collecteur de fractions, et commencer l'enregistrement avec le traceur DAQ en même temps.Lorsque la première goutte de solution de lavage tombe dans un tube de collecte, arrêtez la pompe et le traceur DAQ. En même temps, ajoutez 750 microlitres de triol à chaque fraction recueillie et flash. Congelez les fractions dans de l'azote liquide.Ensuite, suivre les instructions du fabricant pour isoler l'ARN associé aux polysomes et l'ARN cytosolique à partir des échantillons. La fractionnement des polysomes a été utilisé pour évaluer l'activité traductionnelle des cellules cancéreuses du sein C seven traitées à l'insuline. La proportion de polysomes a augmenté avec le traitement à l'insuline par rapport aux cellules témoins et à celles traitées avec l'inhibiteur de mTOR, Torin one.Ce résultat indique que l'insuline stimule les taux globaux d'initiation de la traduction dans les cellules mc seven. Les résultats de quatre expériences indépendantes de l'expérience avec l'insuline ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de cette méthode de fractionnement des polysomes. Les échantillons provenant des mêmes conditions de traitement et d'origine en ARN sont étroitement regroupés sur ce graphique, ce qui indique une forte reproductibilité.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment lyser les cellules, préparer des gradients de saccharose et, enfin, recueillir des ribosomes fractionnés. Ce protocole vous permettra d'analyser l'expression génique au niveau post-transcriptionnel.

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit un protocole pour l'extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d'étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l'isolement et la comparaison de l'ARN total à ribosome fractions d'ARN liés.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

La purification par affinité des ribosomes (TRAP) est capable de capturer la traduction spécifique du type cellulaire de l’ARNm. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédié à l’isolement de l’ARNm dans des populations cellulaires rares d’embryons de drosophile.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Ici, nous décrivons l’immunoprécipitation des ribosomes et de l’ARN associé de populations choisies de cellules mâles adultes de germe de souris utilisant le système de RiboTag. La reproduction stratégique et l’immunoprécipitation soigneuse donnent des résultats propres et reproductibles qui informent sur le translatome des cellules germinales et donnent un aperçu des mécanismes des phénotypes mutants.

Immunoprécipitation de RiboTag dans les cellules germinales de la souris mâle

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Le protocole présenté ici implique un profilage polysomal pour isoler le translatome, ARNm associé aux ribosomes, en ARN non polysomiques et polysomiques d’Arabidopsis par centrifugation à gradient de densité de saccharose. Cette méthode démontre l’efficacité de traduction d’Arabidopsis soumis à un stress thermique.

Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Apprenez le fractionnement des polysomes pour analyser l'activité de traduction de l'ARNm à l'échelle du génome entier. Cette méthode isole les ribosomes actifs et évalue les changements de traduction dans les cellules.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l'ensemble du génome

Explorer plus de vidéos