Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l'ensemble du génome

L’objectif global de l’expérience suivante est d’isoler les polysomes en traduction des ribosomes afin d’étudier les changements dans l’activité de traduction de l’ARNm dans la cellule. Ceci est réalisé en ajoutant du cyclohexa au milieu de croissance afin de geler les ribosomes sur l’ARNm, empêchant ainsi le ruissellement des ribosomes dans un deuxième temps. Les ribosomes sont extraits des cellules et séparés en fonction de leur densité par centrifugation à gradient de densité de saccharose pour quantifier et isoler les sous-unités ribosomiques libres 40 s et 60 s mono zones a DS, et traduire les ribosomes polysomes polysome.

Ensuite, des ARN ou des protéines peuvent être extraits des fractions de saccharose afin d’analyser Mr NA et l’abondance des protéines respectivement dans les fractions pré et poly somales. Les résultats montrent des changements quantitatifs et qualitatifs dans la traduction de l’ARNm, qui peuvent être examinés à l’échelle du génome à l’aide de microréseaux ou de séquençage de l’ARN de nouvelle génération et analysés à l’aide d’un algorithme NoDa. La méthode de profilage du poison peut être utilisée pour répondre à des questions majeures en matière de régulation de l’expression génique aux niveaux post-transcription, telles que la surveillance des changements dans l’ARNm, la traduction à l’échelle du génome, ainsi que l’association des protéines avec le ribosome et le polys.

Valentina Gand, associée de recherche dans notre laboratoire, fera la démonstration de cette technique Pour commencer, préparez 100 millilitres de solution de saccharose à 60 % en poids par volume dans de l’eau distillée désionisée, puis filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 micromètre. Ensuite, diluez la solution de saccharose à 60 % dans un tampon de gradient de saccharose X pour obtenir 40 millilitres de solutions de saccharose à 5 % et 50 %. Utilisez le bloc de marquage fourni avec l’unité de gradient pour marquer la moitié du point plein sur six tubes d’ultracentrifugation en poly aamer.

Ensuite, utilisez le dispositif de superposition pour ajouter une solution de saccharose à 5 % à la demi-pointe. Ensuite, ajoutez la solution à 50 % de saccharose au fond du tube jusqu’à ce que l’interface des deux solutions atteigne les tubes d’étanchéité à demi-point complet avec des capuchons zonaux à taux élevé et placez les tubes d’étanchéité dans le support de tube sur le fabricant de gradient. Exécutez le gradient maker pour obtenir un gradient linéaire de 5 % à 50 %Le gradient maker fait pivoter les tubes à un angle d’inclinaison élevé pour former six gradients linéaires en quelques minutes.

Le jour de l’expérience, les cellules doivent être confluentes à environ 80 %. Traitez les cellules avec 100 microgrammes par millilitre de cyclohexa dans un milieu de croissance et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone Lavez deux fois les cellules avec 10 millilitres de PBS glacé contenant 100 microgrammes par millilitre de cyclohexa. Ajoutez ensuite cinq millilitres supplémentaires de la solution PBS glacée.

Grattez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un récipient de 50 millilitres pour centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 425 microlitres de tampon de lyse hypotonique. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de 10 milligrammes par millilitre de cyclohexa, un microlitre d’une molaire de DTT et 100 unités d’inhibiteur d’ARN à la suspension cellulaire.

Ensuite, vortex la solution pendant cinq secondes. Complétez la suspension cellulaire avec 25 microlitres de 10 % de tritton X 125 microlitres de 10 % de désoxy coate, puis tourbillonnez pendant cinq secondes supplémentaires. Ensuite, centrifugez les lysats à 16 000 fois G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.

Transférez le super natin dans un nouveau tube pré-refroidi de 1,5 millilitre et enregistrez 10 % du lysat comme contrôle pour mesurer les niveaux d’ARNm à l’état d’équilibre. Mesurez la DO à 260 nanomètres pour chaque échantillon de lysat, puis ajustez la DO à la même DO dans un tampon de lyse hypotonique avec un volume final de 500 microlitres. Retirez 500 microlitres du haut des gradients de saccharose et chargez les échantillons de lysat ajustés sur chaque gradient.

Ensuite, pesez et équilibrez chaque tube incliné. Placez les tubes dans un rotor SW 41 TI et mettez l’ultra-centrifugeuse en mode de rupture faible. Ensuite, centrifugez les échantillons à 222, 228 fois G pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Lorsque l’ultra-centrifugation est terminée, retirez soigneusement les tubes inclinés du rotor et placez-les sur de la glace. Tout d’abord, remplissez le collecteur de fractions avec deux tubes de collecte d’un millilitre. Ensuite, allumez la pompe de l’ordinateur, le détecteur UV et le collecteur de fractions une demi-heure avant que les fractions ne soient collectées.

Réglez la pompe pour qu’elle fonctionne à trois millilitres par minute, puis remplissez le tube avec une solution de chasse pour éliminer l’air dans le système. Faites passer la solution de chasse à travers le tube jusqu’à ce qu’une goutte sorte de l’aiguille. Ouvrez le logiciel d’analyse.

Réglez ensuite la sensibilité à plus ou moins 10 milliélectronvolts et la base de temps à 100 secondes. Placez le tube de l’ultracentrifugeuse dans le détecteur UV et assurez-vous que le tube est en position orthogonale. Ensuite, tournez le bouton sous le support de tube pour percer le tube avec l’aiguille.

Ajustez le débit de la pompe à 1,5 millilitre par minute et réglez le collecteur de fractions pour collecter les fractions toutes les 30 secondes, ce qui équivaut à 750 microlitres dans chaque fraction. Mettez la pompe en position à distance. Démarrez ensuite la pompe et le collecteur de fractions et commencez l’enregistrement avec le traceur DAQ en même temps.

Lorsque la première goutte de solution de chasse tombe dans un tube de collecte, arrêtez la pompe et le traceur DAQ. Dans le même temps, ajoutez 750 microlitres de triol à chaque fraction collectée et flashez. Congelez les fractions dans de l’azote liquide.

Suivez ensuite les instructions du fabricant pour isoler les polysomes associés et l’ARN cytosolique des échantillons. Le fractionnement des polysomes a été utilisé pour évaluer l’activité translationnelle des cellules cancéreuses du sein C sept traitées à l’insuline. La proportion de polysomes a augmenté avec le traitement à l’insuline par rapport aux cellules témoins et à celles traitées avec l’inhibiteur de mTOR, Torin one.

Ce résultat indique que l’insuline stimule les taux globaux d’initiation de la traduction dans les cellules mc sept. Les résultats de quatre essais indépendants de l’expérience sur l’insuline ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de cette méthode de fractionnement des polysomes. Les échantillons de la même condition de traitement et de la même origine de l’ARN sont étroitement positionnés sur ce graphique, ce qui indique une reproductibilité élevée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de lys les cellules, de préparer le saccharose, les gradients et enfin de collecter les ribosomes fractionnés. Ce protocole vous permettra d’analyser l’expression des gènes au niveau de la post-transcription.