Name: Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-20T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Découvrez une méthode pour induire la plasticité des récepteurs GPCR astrocytaires en réponse à l'activité neuronale. Ce protocole utilise des tranches hippocampiques de souris et la microscopie confocale pour visualiser les transitoires calciques astrocytaires.

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Les auteurs tiennent à remercier le Centre de l&#39;UC Riverside pour gliales neuronaux Interactions de discussion précieux des protocoles et des données mise à l&#39;échelle. Les auteurs souhaitent également donner un remerciement sincère à Abcam pour le parrainage de la publication de leurs travaux.

<ol><li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2%2B+elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li>
<li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li>
<li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenoceptors+in+brain%3A+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Int%22%5BJournal%5D)">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li>
<li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li>
<li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li>
<li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca2%2B+signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li>
<li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li>
<li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li>
<li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li>
<li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li>
<li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2%2B+increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li>
<li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li>
<li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li>
<li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li>
<li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li>
<li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II%3A+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Funct%22%5BJournal%5D)">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li>
<li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2%2B-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li>
<li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors%3A+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li>
<li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cortex%22%5BJournal%5D)">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li>
<li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors%3A+%28patho%29physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li>
<li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade%3A+synaptic+scaling%2C+intrinsic+plasticity+and+age-dependence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li>
<li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer+1+and+layer+2%2F3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology%2C+pharmacology%2C+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li>
<li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs tiennent à indiquer la tétrodotoxine utilisée dans ces études a été acheté chez Abcam. Abcam n&#39;était pas impliqué dans les hypothèses, la conception ou la collecte de données. Toute communication relative au parrainage de l&#39;œuvre par Abcam a eu lieu après le processus d&#39;examen par les pairs a été complète.

Les modèles d&#39;échelle décrites représentent des méthodes pratiques pour la recherche plasticité à long terme d&#39;un groupe astrocytaire je mGluR. Imagerie Ca 2 + événements spontanés et évoqués fournit un test sensible pour mesurer les changements dans l&#39;activité Gq GPCR astrocytes, comme preuve solide a été établi que astrocytes Ca 2 + élévations se produisent suite à la libération de la propriété intellectuelle 3 magasins de R-sensible en aval de l&#39;activation Gq GPCR 10, 12, 17, 18. Le pourcentage des astrocytes dans la population face au groupe I mGluR agoniste et le motif de ces Ca 2 + réponses signalent des changements dans le groupe I mGluR par les astrocytes. La technique spécifique utilisée pour charger les astrocytes Ca 2 + indicateur est une considération importante dans la conception d&#39;expériences pour chercher les changements dans l&#39;activité Gq GPCR astrocytes. Bolus chargement ou plusieurs astrocytes de chargement en vrac, ou patch-clamp chargement des astrocytes individuels peut être utilisé pour l&#39;image de Ca 2 + transitoires dans les astrocytes. Chaque approche offre des avantages et des inconvénients. Remplissant directement les astrocytes Ca 2 + indicateur via patch clamp permet l&#39;identification sans équivoque de la cellule comme un astrocyte sans nécessité d&#39;un marqueur secondaire tel que SR-101. Livraison de patch-clamp de l&#39;indicateur permet également l&#39;enregistrement de Ca 2 + activité de petits compartiments astrocytaires y compris les processus fines broussailleux, potentiellement plus profondes dans la tranche où les cellules sont en meilleure santé et avec des interactions plus intactes avec des synapses (en fonction de la puissance du laser disponible). Cependant, patch-clamp charge souffre d&#39;une faible débit que les données sont recueillies une cellule à la fois. Bulk-chargement, au contraire, permet à un grand nombre d&#39;astrocytes à être chargé avec du Ca 2 + et imager simultanément indicateur. Cependant, seulement astrocytes près de la surface (&lt;20 mm) de la tranche sont chargés, avec préoccupation associées sur la santé des cellules et synapses intactes. La contre-pression protocole bolus chargement présenté ici offre un terrain d&#39;entente, relativement à haut débit et la capacité de surveiller l&#39;activité Ca 2 + plus profondément dans la tranche (40-75 um). Une augmentation significative du pourcentage des astrocytes spontanément actifs en utilisant la technique bolus de chargement est observée par rapport à chargement en vrac, ce qui suggère que les liens entre les synapses neuronales et les processus astrocytaires sont plus complets 15. Avec une bonne charge, on peut souvent suivre Ca 2 + activité dans les principaux processus d&#39;astrocytes (données non présentées) ou peut-être même petits compartiments en utilisant la microscopie à 2 photons. Cependant, il devra être exercé dans l&#39;attribution des petits processus à un astrocyte particulier, que les limites se fondent dans le fond non spécifique coloration. Une inquiétude supplémentaire à l&#39;utilisation de procédures en vrac chargement ou bolus de chargement est la nécessité d&#39;un mar secondaireker pour l&#39;identification des astrocytes. Bien qu&#39;il ait connu depuis de nombreuses années que les astrocytes prennent préférentiellement jusqu&#39;à ester AM Ca 2 + indicateurs, le marqueur secondaire SR-101 est souvent utilisé pour vérifier les cellules chargées que les astrocytes. SR-101 peut, en soi, de modifier l&#39;excitabilité des neurones intrinsèques 29. L&#39;utilisation de SR-101 corrobore la nécessité d&#39;effectuer toutes les astrocytes Ca 2 + dans les mesures TTX pour limiter d&#39;éventuels effets SR-101 sur l&#39;excitabilité neuronale. En supposant que le groupe contrôle et expérimentaux comprennent SR-101, le marqueur en elle-même ne doit pas tenir compte des effets observés chez les astrocytes Ca 2 + signalisation suivants manipulation à long terme des potentiels d&#39;action neuronaux. SR-101 peut être plus préoccupant en haute K + expériences, cependant, car il peut réduire la différence entre 2,5 mM K + vs 5,0 mM de K +, si le taux d&#39;allumage de base n&#39;est pas modifiée proportionnellement. Une approche très prometteuse pour fournir Ca 2 + </sup&gt; Indicateur aux astrocytes est apparue récemment qui offre une alternative intéressante aux approches plus traditionnelles utilisant Ca 2 + colorants. Des progrès significatifs ont été accomplis au cours des dernières années avec des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) destinés aux astrocytes 30-32. GECIS est acheminé en astrocytes par micro-injection de vecteurs viraux adéno-associés in vivo dans une région du cerveau d&#39;intérêt telles que l&#39;hippocampe. Expression de GECIS est atteinte après environ deux semaines après l&#39;infection virale 32. Il existe de nombreux avantages présentés par l&#39;utilisation de GECIS dans les astrocytes. Tout d&#39;abord, les vecteurs sont ciblées sur les astrocytes en utilisant un promoteur spécifique des astrocytes, de sorte que les cellules marquées sont astrocytes 32. Deuxièmement, le rapport signal sur bruit, semble maintenant comparable à ce qui peut être obtenu en utilisant la livraison de patch-clamp de colorant, mais sans le caractère envahissant d&#39;avoir eu une pipette de patch sur la cellule 32. Troisièmement, les indicateurs peuvent être delivered et exprimée dans les tissus adultes, ce qui est problématique en utilisant des méthodes de livraison en vrac de chargement. En outre, l&#39;expression est en mosaïque, en offrant la possibilité de faire la différence entre de multiples astrocytes. Ainsi, plusieurs astrocytes peuvent potentiellement être visualisés simultanément, tout en enregistrant dans le soma et rameaux fins dans le même temps. Par conséquent, potentiellement une technique unique pourrait être utilisé à la place de trois techniques distinctes (chargement en vrac, bolus de chargement, et de patch-clamp chargement) pour enregistrer l&#39;activité des RCPG échelle Gq astrocytaires, augmentant considérablement l&#39;efficacité. Un inconvénient potentiel de l&#39;utilisation de la livraison à médiation virale de Ca 2 + indicateurs aux astrocytes est l&#39;effet possible sur la santé de la tranche 32. Les vecteurs viraux adéno-associés utilisés pour livrer les GECIS ont été précédemment montré pour causer gliose réactive des astrocytes 33. Préparation des tranches de cerveau en général initie probablement parmi les premiers stades de la pathologie dont la libération de inflammatory 10 molécules. Par conséquent, combiné avec les temps d&#39;incubation longs nécessaires pour induire l&#39;échelle des récepteurs astrocytaires, l&#39;utilisation de GECIS livré utilisant des vecteurs viraux aurait besoin de recevoir une contrepartie supplémentaire dans le contexte de la santé de la tranche dans ces types d&#39;expériences. Lors de l&#39;utilisation de ce protocole, il est important de garder à l&#39;esprit que le temps d&#39;application pour agoniste à produire une réponse variera en fonction de la disponibilité des récepteurs. Pour une concentration donnée de l&#39;agoniste, le temps d&#39;application devra être plus longue si les récepteurs sont mis à l&#39;échelle vers le bas, et la plus courte si les récepteurs sont mis à l&#39;échelle vers le haut, pour le médicament d&#39;atteindre une concentration suffisante dans les tissus pour activer les récepteurs suffisamment pour produire un rapport Ca 2 + réponse. Par conséquent, les temps d&#39;application du médicament, et éventuellement de leurs concentrations, peuvent devoir être ajustés en fonction de la direction prévue de la mise à l&#39;échelle. Par exemple, la concentration de l&#39;agoniste peut avoir besoin d&#39;être abaissé dans le case de TTX pour éviter de saturer les réponses, et a augmenté après l&#39;incubation des tranches en haute K + voir même une réponse. Plus précisément, la concentration DHPG a été déplacé de 5-15 uM après le traitement TTX 30-50 uM après traitement 5,0 mM K + afin d&#39;étudier les modèles de Ca 2 + de réponse, comme 5-15 uM était souvent trop faible pour produire des réponses fiables à astrocytes après révision à la baisse du groupe I mGluR. Enregistrement des astrocytes Ca 2 + activité fournit pas de preuve directe de l&#39;insertion ou de l&#39;internalisation du récepteur ou à partir de la membrane plasmique. Cependant, sur la base de la similitude remarquable des données avec des données provenant d&#39;études antérieures in vitro qui ont examiné la relation directe entre le niveau d&#39;expression Gq GPCR et spontanée et évoquaient Ca 2 + transitoires 21-24, l&#39;interprétation la plus logique des changements en Ca 2 + la signalisation est que les niveaux d&#39;expression des récepteurs de surface d&#39;astrocytes ontchangé. Une approche complémentaire peut être un facteur important si l&#39;on veut fournir des preuves supplémentaires sur le lieu de l&#39;effet sur ​​l&#39;activité Ca 2 +. Une stratégie que nous avons utilisé était d&#39;examiner l&#39;effet de TTX incubation sur des tranches d&#39;hippocampe de souris MrgA1R astrocytaires. Ces souris transgéniques expriment un Gq GPCR étrangère (MrgA1R) que dans les astrocytes. Parce que ce récepteur n&#39;est pas indigène au cerveau, il n&#39;y a pas neurotransmetteur endogène présent de modifier ses niveaux d&#39;activité. Des travaux antérieurs suggéré que ce récepteur engage le même que les molécules endogènes groupe I mGluR de signalisation dans les mêmes astrocytes 34 intracellulaire. Incubation après à long terme de tranches provenant de souris MrgA1R à la TTX, aucune différence dans les réponses MrgA1R agonistes évoqués par rapport au contrôle de la même portée incube les tranches ne fournissent la preuve que Ca 2 + activité de l&#39;effet sur ​​les astrocytes est due à des changements localisés au récepteur de la surface, en particulier si les réponses du groupe I mGluR sont encore Significantly renforcée dans les mêmes astrocytes. Une autre solution, bien que peut-être plus impliqué stratégie consisterait à isoler les astrocytes dans les tranches pour l&#39;analyse Western blot, aussi longtemps que la fraction membranaire pouvait être analysée pour les changements dans les niveaux d&#39;expression des récepteurs de surface. Cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou la cytométrie en flux peut être utile ici. Les applications possibles de cette technique pour l&#39;étude des neurones, les astrocytes et les interactions neurones-astrocytes sont nombreux. Dans nos expériences, seul groupe DHPG évoqués Je mGluR Ca 2 + réponses astrocytaires ont été étudiés, dans les régions isolées des tranches d&#39;hippocampe de souris aigus mineurs. Cette préparation a non seulement les afférences intactes (des collatérales de Schaffer), mais aussi les neurones qui sont à leur origine (cellules pyramidaux CA3), ce qui permet de manipuler les taux de ces neurones glutamatergiques de tir sur les cellules post-synaptiques (cellules pyramidales CA1) et les astrocytes dans la strate radiatum dont les processus assoe avec ces synapses. La tranche de l&#39;hippocampe aiguë peut-être pas la meilleure préparation pour manipuler les taux d&#39;autres types de neurones de tir, cependant, que de nombreux afférents sont séparées des neurones qui leur donnent naissance. Néanmoins, il peut être possible dans certaines préparations de tranche d&#39;observer la plasticité des autres sous-types Gq GPCR astrocytaires. Par exemple, les tranches peuvent être préparées avec les neurones cholinergiques basales du cerveau antérieur et de leurs projections de l&#39;hippocampe intact. L&#39;incubation de ces tranches dans TTX ou K + élevée aurait une incidence sur les taux de mise à feu des neurones cholinergiques basaux, ce qui conduit à la mise à l&#39;échelle de mAchRs dans les astrocytes du stratum oriens, qui reçoivent une partie importante de l&#39;apport cholinergique 1. Une alternative encore d&#39;approche non testé à étudier l&#39;échelle des récepteurs astrocytes dans une zone spécifique du cerveau, avec toutes les connexions intacts tandis que l&#39;échelle se produit, pourrait être d&#39;utiliser un modèle in vivo où une libération prolongée de TTX est réalisé par l&#39;implantation d&#39;un plastic polymère Elvax 40W-dessus de la région d&#39;intérêt 35. Cette approche a été utilisée précédemment dans une étude de mise à l&#39;échelle des neurones, mais devrait également être applicable à l&#39;échelle des astrocytes. Enfin, la lecture correcte, les études futures pourraient examiner d&#39;autres familles de RCPG, y compris des changements dans l G ou G i RCPG. On pourrait prévoir des astrocytes GABA B G i GPCR d&#39;être affectés suite à l&#39;inhibition de tir à projeter localement interneurones GABA dans une préparation de tranche. Développement de nouveaux indicateurs visant d&#39;autres molécules de signalisation, comme un indicateur en temps réel de la deuxième camp de messager, serait d&#39;ouvrir un tout nouveau domaine de recherche sur la communication du récepteur des neurones-astrocytes à. Mise à l&#39;échelle bidirectionnel de mGluR astrocytaires en manipulant les taux basaux neurone de tir fournit une mesure de la sensibilité des astrocytes à libération médiée par AP de neurotransmetteur. Les astrocytes peuvent apparemment détecter les points d&#39;accès spontanés et glutamate de presse à Schaffer garantie-CA1 synapses des cellules pyramidales, même si K + extracellulaire est dans une gamme physiologique. Bien que l&#39;application de TTX aiguë ne réduit pas la fréquence spontanée des astrocytes activité de Ca 2 + 18, 36, 37, l&#39;activité de Ca 2 + chez les astrocytes dans la population devient décorrélés 36, fournissant la preuve que les récepteurs sont des détecteurs astrocytaires AP. Ceci suggère que les astrocytes détectent les points d&#39;accès neuronales spontanées avec aucun effet sur ​​leur activité globale de Ca 2 +. Il est largement admis que les concentrations intracellulaires d&#39;IP 3 doivent atteindre un niveau de seuil pour stimuler IP 3 Rs suffisamment pour entraîner une élévation de Ca 2 + détectable. AP neuronales spontanées pourraient activer GPCR astrocytaires sans produire mesurables Ca 2 + élévations? Les études futures pourraient utiliser Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ou un techn similaire<html> ique (comme BRET) pour examiner la relation entre G couplage de la protéine au récepteur (une mesure de l&#39;activation du récepteur) et Ca 2 + de presse dans les magasins internes. BRET a été largement utilisée in vitro pour détecter la protéine G à GPCR accouplement 38, même si elle peut être un certain temps avant que cette technologie sera disponible pour une utilisation dans des préparations de tissus intacts. Il est possible que les RCPG Gq astrocytaires sont activés beaucoup plus fréquemment que peuvent être enregistrées en utilisant les outils de Ca 2 + d&#39;imagerie actuellement disponibles. En plus de la détection des potentiels d&#39;action, GPCR Gq astrocytaires peuvent également être en mesure de détecter libération quantique miniature de neurotransmetteur tel que rapporté dans une étude récente 39. Procédé de mise à l&#39;échelle bidirectionnel décrit ici peut être utilisé dans des études ultérieures pour fournir une mesure de la mesure dans laquelle les GPCR astrocytaire Gq détecter la libération de neurotransmetteur vésiculaire quantique, en incluant la bafilomycine A1 dans le protocole d&#39;incubation. ntent &quot;&gt; Jusqu&#39;à présent, les protocoles d&#39;échelle ont été utilisé que dans des coupes d&#39;hippocampe de souris juvénile (p12-p18). Par conséquent, il est actuellement inconnu si l&#39;échelle de récepteur astrocytes pourrait aussi être induite dans les tissus obtenus à partir de souris adultes. Une étude convaincante récente suggère que le groupe expression je mGluR dans les astrocytes diminue considérablement après la première semaine de l&#39;âge et continue à diminuer jusqu&#39;à l&#39;âge adulte, avec de très faibles niveaux d&#39;expression des récepteurs dans les astrocytes adultes 40. Il serait donc intéressant de déterminer si mGluRs astrocytaires s&#39;adaptent à la suite de long l&#39;inhibition de la durée de la décharge neuronale dans adultes tranches d&#39;hippocampe de souris à des niveaux proches de ceux observés dans les astrocytes de souris juvéniles. Cette constatation suggère que l&#39;expression du récepteur astrocytes n&#39;est pas statique à un âge donné, mais peut changer rapidement en fonction des niveaux de l&#39;activité neuronale. Contrairement à réduction de l&#39;expression de groupe I mGluR chez la souris adulte, la preuve est en train d&#39;émerger que les récepteurs adrénergiques, y compris &amp; #945; 1A, 2A α, β et d&#39;une sous-types, sont principalement exprimés par les astrocytes dans le cerveau adulte 3, 4. L&#39;α 1A adrénergiques Gq GPCR peut être une cible intéressante pour de futures études de communication neurone à astrocyte, y compris si ces récepteurs sont sensibles aux variations de taux adrénergiques neurone de tir.

Les astrocytes répondent en quelques secondes à la stimulation des neurones ou axones neuronaux avec des augmentations de Ca 2 + cytoplasmique résultant presque exclusivement de l&#39;activation des RCPG Gq astrocytaires. Par exemple, les récepteurs muscariniques de l&#39;acétylcholine 1, les récepteurs cannabinoïdes 2, α 1A adrénergiques 3, 4, et le groupe I mGluR (voir ci-dessous) sont tous les sous-types astrocytaires Gq GPCR qui répondent aiguë de l&#39;activité neuronale. L&#39;activation du groupe I mGluR astrocytaire a été démontré plus largement, à la suite de la stimulation des afférences de neurones glutamatergiques in situ (tel que des coupes d&#39;hippocampe de courte durée) 5-7, ainsi que dans le cortex de souris adulte in vivo suite à une stimulation sensorielle 8. Le résultat de l&#39;activation des astrocytes Gq GPCR de signalisation sur la biologie et la physiologie des astrocytes, neurones, ou des interactions neurone-astrocyte a été un sujet de débat 9-12. Il sera some temps avant que la fonction de signalisation du récepteur neurone à astrocyte est pleinement apprécié. S&#39;il est clair que les neurones peuvent activer les récepteurs de astrocytaires en utilisant des protocoles expérimentaux, il ya des aspects de communication neurone à astrocyte récepteur qui restent mal compris. Tout d&#39;abord, le montant réel de l&#39;activité neuronale nécessaire pour activer les astrocytes Gq RCPG n&#39;est pas bien définie, et d&#39;autre part, la capacité des récepteurs astrocytaires exposer utilisation la plasticité a reçu peu d&#39;attention. Pour commencer à répondre à ces questions, nous avons récemment mis au point un protocole pour induire échelle bidirectionnel de groupe I mGluR astrocytes dans des coupes d&#39;hippocampe mineurs aiguë en réponse à des changements à long terme dans le potentiel d&#39;action des neurones (AP)-dépendantes activité synaptique. Similaire à ce qui a été découvert pour la plasticité homéostatique bidirectionnel de neurones récepteurs ionotropiques du glutamate 13, 14, groupe astrocytaire je mGluRs Scale Up following blocus des potentiels d&#39;action neuronaux et réduire lorsque l&#39;action neuronale fréquence potentiel est augmenté de 15. Ces changements compensatoires dans les récepteurs astrocytaires peuvent être mesurées en enregistrant spontanée et évoqués astrocytes Ca 2 + transitoires et en comparant les propriétés de ces événements à ceux des astrocytes dans les conditions témoins. Dans ce manuscrit, nous décrivons la méthodologie complète pour l&#39;utilisation de ce protocole, y compris la préparation de coupes d&#39;hippocampe, conditions d&#39;incubation de courte durée pour induire l&#39;échelle du récepteur de l&#39;astrocyte, astrocytes Ca 2 + colorant indicateur de chargement, Ca 2 + des techniques d&#39;imagerie par microscopie confocale, et les effets attendus sur l&#39;activité des astrocytes Gq GPCR. Effets prévisibles sur les astrocytes Ca 2 + propriétés de signalisation - qui correspondent à ceux enregistrés précédemment dans les cellules cultivées transfectées avec différents niveaux de GPCR Gq d&#39;expression - fournir une &quot;feuille de route&quot; qui peut être utilisé dans de futures études pour analyser les changements dans le plusexpression de GPCR trocytic. Les ramifications et les applications potentielles pour l&#39;utilisation de cette technique contribueront à notre compréhension des interactions entre les astrocytes neuronale dans le cerveau sain et malade.

<table><tbody><tr><td>Chamber Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conteneur de stockage de pipettes Brinkmann</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-491</td><td>Utiliser la partie tiroir comme chambre d’incubation</td></tr><tr><td>Perceuse</td><td></td><td></td><td></td>électrique</tr><tr><td>Tube flexible</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Mastic silicone pour joints&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Aussi appelé scelleur de joint d’aquarium</td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td><td></td> de gaz <td>95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone</td></tr><tr><td>Pointe de pipette biseautée naturelle</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1000</td><td>Cut-to-fit pour connecter des conduites oxygénées</td></tr><tr><td>Collecteur d’une à six lignes</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0210 (MP-6)</td><td>Pour l’appareil de microchargeur-collecteur</td></tr><tr><td>Microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Pour l’appareil de microchargeur-collecteur, découpé sur mesure</td></tr><tr><td>Rack à bulles flottant</td><td>Bel Art Scienceware</td><td>F18875-0400</td><td>Pour porte-tranches</td></tr><tr><td>600 &micro ; m Sefar Nitex Nylon mesh</td><td>ELKO Filtering Co.</td><td>06-600/51</td><td>Pour porte-tranche</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td><td>Pour porte-tranches</td></tr><tr><td><fort>réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher</td><td>Fisher</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn ;)-Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique (Trolox)</td><td>Acros Organics</td><td>53188-07-1</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de tétrodotoxine (TTX)</td><td>Abcam</td><td>ab120055</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101 (SR-101)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>284912</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Acide pluronique F-127</td><td>Invitrogen, Sondes moléculaires</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cellule perméable (emballage spécial)</td><td>Invitrogen, Sondes moléculaires</td><td>O6807</td><td></td></tr><tr><td>(RS)-3,5-DHPG</td><td>Abcam</td><td>ab120020</td><td></td></tr><tr><td>Histamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Carbamoylcholine chlorure (Carbachol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-ATP disodique (Na-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir à un seul tranchant&nbsp ;</td><td>GEM</td><td>62-0161</td><td>Pour bissection</td></tr><tr><td>Lame de rasoir à double tranchant</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>121-6</td><td>Pour couper des tranches Mayo</td></tr><tr><td>Ciseaux, supercut</td><td>WPI</td><td>14010-15</td><td>Pour la décapitation</td></tr><tr><td>Ciseaux à iris fins, droits</td><td>Outils de science fine</td><td>14094-11</td><td>Pour couper le crâne</td></tr><tr><td>Pince à iris, incurvée</td><td>WPI</td><td>15915</td><td>Pour enlever la peau et le crâne</td></tr><tr><td>Petite spatule</td><td></td><td></td><td>Pour enlever/transférer le cerveau</td></tr><tr><td>Dumostar Dumont #5 Biologie Pince à pointes</td><td>Outils scientifiques</td><td>fins 11295-10</td><td>Pour dissection de l’hippocampe</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>Pour le transfert de tranches de cerveau</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur poire en caoutchouc</td><td>Fisher</td><td>03-448-22</td><td>Pour le transfert de tranches de cerveau</td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire en polystyrène 100 mm</td><td>Corning</td><td>25020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Fisher</td><td>ISOTEMP 210</td><td>Pour l’incubation à chaud Extracteur</td></tr> de <tr><td>micropipettes</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Pour pipette à chargement bolus</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>Olympus Fluoview 1000</td><td></td></tr> Low <tr><td>Profile Open Diamond Bath Chambre d’imagerie avec plate-forme PM-1</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td>à profil bas</td></tr><tr><td>Pipette en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Pour pipette à chargement en bolus</td></tr><tr><td>Micromanipulateur&nbsp ;</td><td>Sutter Instrument</td><td>ROE-200</td><td>Pour pipette à chargement en bolus</td></tr><tr><td>Filtre à tube de centrifugation Spin-X avec 0,22 & micro ; m acétate de cellulose&nbsp ;</td><td>Costar</td><td>8161</td><td></td></tr></tbody></table>

induire la plasticité de astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Près de deux décennies de recherche a établi que les astrocytes in situ et in vivo expriment de nombreuses G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) qui peuvent être stimulées par l&#39;émetteur neuronale-publié. Cependant, la capacité des récepteurs astrocytaires à exposer la plasticité en réponse aux variations de l&#39;activité neuronale a reçu peu d&#39;attention. Ici, nous décrivons un système de modèle qui peut être utilisé à l&#39;échelle au niveau mondial haut ou le bas groupe astrocytaire je récepteurs de glutamate métabotropique (mGluR) dans des tranches de cerveau de courte durée. Inclus sont des méthodes sur la façon de préparer des coupes d&#39;hippocampe parasagittales, construire des chambres adaptées à long terme tranche incubation, manipuler bidirectionnelle d&#39;action neuronale fréquence potentiel, les astrocytes de charge et les processus d&#39;astrocytes avec fluorescent Ca 2 + indicateur, et mesurer les changements dans les astrocytes activité Gq GPCR par l&#39;enregistrement astrocytes spontanée et évoquée Ca 2 + événements en utilisant la microscopie confocale. En essence, un &quot;r calciumoadmap &quot;est prévue à la façon de mesurer la plasticité des RCPG Gq astrocytaires. Les applications de la technique pour l&#39;étude des astrocytes sont discutés. Avoir une compréhension de la façon dont la signalisation du récepteur astrocytaire est affecté par des changements dans l&#39;activité neuronale a des implications importantes tant pour la fonction synaptique normale ainsi que les processus sous-jacents des troubles neurologiques et des maladies neurodégénératives.

Les résultats représentatifs de la figure 3 montrent l&#39;effet de l&#39;incubation de courte durée des coupes d&#39;hippocampe de souris en TTX pour 4-6 heures sur astrocyte sr Ca 2 + de l&#39;activité. Les données comprennent les deux Ca 2 + transitoires spontanés et groupe DHPG évoqués Je mGluR Ca 2 + réponses, de tranches incubées en contrôle ACSF vs ACSF, plus TTX. Autres que les caractéristiques morphologiques caractéristiques de base, ensemble de processus stellaire et la petite taille de soma (~ 10 um), les astrocytes sont identifiés dans le sr par superposition de la Ca 2 + indicateur OGB-une heures avec le marqueur des astrocytes sélective SR-101 19, 20 ( Figure 3A). Les cases numérotées sur les corps cellulaires d&#39;astrocytes correspondent à la fluorescence numérotée sur traces de temps indiquées dans la figure 3B. Le groupe 1 mGluR agoniste (RS)-3.5-DHPG est appliquée pour déterminer les effets d&#39;échelle spécifiques sur le groupe 1 mGluR dans les astrocytes. Pour la distinction entre éducation physiqueiologie dans la spécificité de l&#39;effet de mise à l&#39;échelle à une mGluR de groupe par rapport à d&#39;autres GPCR Gq, un cocktail d&#39;agonistes est appliqué à la fin de chaque expérience. Ici, nous avons utilisé 10 uM chacun de GQ GPCR agonistes histamine, le chlorure de carbamylcholine (de carbachol) et adénosine 5&#39;-ATP disodique (Na-ATP). Le cocktail d&#39;agoniste sert aussi de témoin positif pour déterminer viables, des astrocytes réactifs dans les cas où les cellules ne répondent pas à DHPG, vraisemblablement parce que ces astrocytes notamment n&#39;expriment pas des quantités suffisantes du récepteur à induire une réponse de DHPG. Nous avons utilisé différentes concentrations de DHPG, dont 5 pM et 15 pM (figure 3B), ainsi que 30 pM et 50 pM (figure 4A) pour aider à révéler des changements dans le groupe astrocytaire je mGluR. La relation entre Ca 2 + réponses cellulaires et les niveaux d&#39;expression Gq GPCR a été préalablement examiné in vitro 21-24. Tout d&#39;abord, l&#39;seuil pour répondre à une concentration de l&#39;agoniste en particulier dépend de la densité des récepteurs exprimés par chaque cellule. Dans une population de cellules, les cellules répondent plus à une élévation de Ca 2 + à une concentration donnée d&#39;agoniste lorsque les cellules sont transfectées avec des densités plus élevées de récepteurs. Après incubation de tranches dans la TTX, le pourcentage de la population dans les astrocytes en réponse à une concentration fixe d&#39;agonistes augmente (figures 3B et 3C). Nous avons constaté que 5 pM et 15 pM DHPG révèlent des différences évidentes dans le pourcentage des astrocytes réactifs entre le contrôle et les cellules TTX traités, alors que 30 et 50 uM DHPG sont tenus de comparer les réponses groupe I mGluR dans 5,0 mM K + traités par rapport au témoin les cellules (figure 4A). La relation entre les modèles de Ca 2 + de réponse astrocytaires et la concentration de l&#39;agoniste a également été étudiée in situ. L&#39;augmentation de l&#39;agonisteconcentration décale le motif de la réponse + Ca2 dans les astrocytes de pointe unique Ca 2 + élévations pour du multi et plateau de Ca 2 + élévations 25-27. Sur la base de ces constatations antérieures, nous avons prédit que le modèle de réponse à une seule concentration de l&#39;agoniste se déplacer en cas de changements dans le niveau d&#39;expression du récepteur. Ainsi, en fonction de celui des deux modes de mise à l&#39;échelle est utilisée (inhibant la décharge neuronale ou aggraver), la concentration d&#39;agoniste nécessaire pour produire un profil de réponse particulière va augmenter ou diminuer. Par exemple, les astrocytes incubés dans TTX déplacer leur + modèle de réponse DHPG évoqués Ca 2 à plus plateau de type Ca 2 + élévations et de répondre à la baisse des concentrations d&#39;agoniste par rapport à contrôler les astrocytes (figure 3C). En tenant compte des études antérieures, ces observations suggèrent que la je mGluR niveaux d&#39;expression des récepteurs dans les astrocytes groupe a augmenté. Le temps de montée et le début (temps de latence) des élévations de Ca 2 + ont également été montré une corrélation directe à des changements dans les niveaux d&#39;expression Gq GPCR dans les cellules cultivées 22-24. Les niveaux d&#39;expression des récepteurs plus élevées donnent des latences de réponse plus courts et plus rapides temps de montée alors que la réduction de la densité des récepteurs produit l&#39;effet inverse. Pour les astrocytes incubés dans TTX, Ca 2 + transitoires évoquées par application de DHPG ont significativement plus rapide temps de montée par rapport aux astrocytes incubées en contrôle ACSF (figure 3D). Comme mentionné précédemment, les amplitudes des réponses Ca 2 + agonistes évoqués restent inchangées quelle que soit la concentration de l&#39;agoniste ou le modèle de mise à l&#39;échelle 15 (figure 3D). Outre les changements observés par le groupe activant directement je mGluRs avec DHPG, astrocytes spontanée Ca 2 + activité est également affectée de façon significative par cette manipulation. Nous observonsda augmentation de 2,26 fois dans le pourcentage d&#39;astrocytes spontanément actives incubées dans TTX par rapport au témoin. Cela représente une augmentation de 12,9% des astrocytes de contrôle présentant une activité spontanée dans le soma de 42,1% dans la TTX incubé astrocytes (figure 3E). Parce qu&#39;il est connu que l&#39;activité des GPCR exposition «intrinsèque» ou constitutive, en l&#39;absence d&#39;agoniste 21, 26, 28, et que le niveau de cette activité intrinsèque augmente avec l&#39;augmentation des niveaux d&#39;expression des récepteurs, ces données suggèrent que la densité de astrocytaires augmente Gq RCPG après réduction à long terme dans l&#39;action neuronale tir potentiel. Semblable à des réponses agonistes évoqués, les temps de montée des Ca 2 + élévations spontanées sont également augmenté (figure 3F). Des données représentatives à l&#39;aide du deuxième protocole, l&#39;incubation en potassium extracellulaire élevée (5,0 mM), est représenté dans Figure 4. Une augmentation de K + extracellulaire à partir des résultats 2,5-5,0 mM à une augmentation significative de l&#39;action des neurones CA3 fréquence basale potentiel 15. Des concentrations plus élevées de DHPG (30 pM et 50 pM) sont nécessaires afin d&#39;évoquer le groupe I mGluR Ca 2 + réponses des astrocytes incubées en haute potassium (figures 4A et 4B). Ceci est cohérent avec un niveau réduit de groupe I mGluR réactivité dans les astrocytes après une hausse à long terme de potentiels d&#39;action neuronaux. En outre, le profil de réponse évoquée à une concentration fixe de DHPG déplace à partir des réponses des plateaux en forme de réponses plus faibles mono-pointe (Figure 4B). Examinant le pourcentage des astrocytes spontanément actifs dans les deux conditions de potassium révèle que moins élevé dans les astrocytes incubées K + sont spontanément actifs par rapport à la condition contrôle (Figure 4C). Cet effet se trouve dans la oppositdirection de l&#39;e de TTX état ​​dans lequel le pourcentage d&#39;astrocytes présentant des élévations de Ca 2 + spontanées est augmentée. Enfin, à la fois évoquée et Ca 2 + élévations spontanées ont plus progressive dans les astrocytes incubées en haute K + par rapport à la condition de contrôle (figures 4C et 4D). Dans l&#39;ensemble, ces données suggèrent que les niveaux d&#39;expression astrocytaires Gq GPCR échelle bidirectionnelle en fonction du niveau d&#39;action neuronale activité potentielle sur une période de temps prolongée. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Fabrication de la chambre d&#39;incubation et de mettre en place une tranche. (A) Le passage de tiroir d&#39;un conteneur de stockage de pipette Brinkmann avec son couvercle étanche à l&#39;air est utilisé pour construire la tranche chambre d&#39;incubation. (B) Drill un trou dans le côté du récipient d&#39;environ 1 ¼ à partir du haut et dans ¼ du côté. Monter dans un morceau de tuyau flexible. (C) Branchez l&#39;appareil de microloader-collecteur à l&#39;extrémité intérieure du tube flexible. Remarque couper au montage pointe de la pipette 200 ul naturel (flèche blanche). (D) Six 20 pi microloaders Eppendorf sont coupées au montage à un collecteur d&#39;une ligne à six pour créer un appareil de microloader-collecteur. (E) Percez deux petits trous sur le couvercle. (F) Un rack de bulle flottant pour faire le support de tranche. (G) Les &quot;jambes&quot; du fond de l&#39;armoire de bulles flottantes sont retirées de telle sorte qu&#39;un morceau de matériau à mailles en nylon peut être collé au fond. (H) Remplir la chambre d&#39;incubation avec une quantité suffisante de l&#39;ACSF de sorte que les flotteurs de support de tranche. Réglez la longueur du tube de sorte que les pointes des microloaders peuvent se reposer dans un coin de plancher de la chambre. Lors du placement de la chambre d&#39;incubation enle bain d&#39;eau, le niveau d&#39;eau dans le bain doit être au même niveau que l&#39;ACSF dans la chambre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Estimation de la santé de la tranche. (A) Une tranche de l&#39;hippocampe saine à l&#39;aide d&#39;interférence différentiel (DIC) optique contraste. Tranches en bonne santé ont une apparence veloutée et un pourcentage élevé de neurones pyramidaux CA1 sains. Notez les dendrites apicales saillie dans la strate radiatum. Patch-clamp de neurones qui ressemblent à ceux présentés ici révèlent un potentiel de repos de membrane faible (-61 à -62 mV) en standard de 2,5 mM K + ACSF avec quelques potentiels d&#39;action spontanée. Les taux de potentiel de membrane et de cuisson varieront en fonction de l&#39;exextracellulaire de K + (Xie et al. 15). Les flèches indiquent les astrocytes putatifs. Abréviations: sr, la stratum radiatum; s.py., strate pyramidale. La barre d&#39;échelle, 10 um. (B) tranches malsaines auront un pourcentage élevé de morts neurones pyramidaux CA1, qui ont l&#39;apparence d&#39;œufs frits (flèches blanches indiquent les noyaux des neurones morts - le &quot;jaune&quot; de l&#39;oeuf sur le plat). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Enregistrement amplifié activité Gq GPCR et le groupe évoqué je mGluR Ca 2 + réponses après inhibition à long terme de points d&#39;accès neuronales par incubation dans TTX. (A) des images représentatives de cellules dans le domaine de l&#39;enregistrement incubées dans control conditions (panneaux supérieurs) ou dans TTX (panneaux inférieurs) qui ont pris Oregon Green BAPTA-une heures Ca 2 + colorant indicateur (panneaux de gauche) et SR-101 (panneaux intermédiaires). La barre d&#39;échelle est de 10 um. Superposition de deux signaux («fusionner») indique que les astrocytes charge avec Ca 2 + indicateur. Les boîtes sont établis sur personne soma des astrocytes à enregistrer l&#39;intensité de fluorescence au cours du temps dans le canal vert pour surveiller l&#39;activité Ca 2 + dans les astrocytes. (B) Exemples de traces provenant des caisses enregistreuses par A) de l&#39;activité de Ca 2 + dans les astrocytes. Astrocytes incubés dans TTX spectacle augmentation de l&#39;activité spontanée et le groupe évoqué plus robuste je mGluR Ca 2 + réponses comme en témoigne par des changements dans le modèle de réponse. Exemples de pointe unique (cercle), du multi (rectangle), et le plateau (rectangle pointillé) Ca 2 + transitoires sont présentés. (C) les changements dans les modes d&#39;intervention sont particulièrement évidents en utilisant concent différenterations du groupe I mGluR agoniste DHPG. Plus de réponses multi crête et de plateau sont évidents après incubation dans TTX par rapport au témoin à une concentration de l&#39;agoniste donné. (D) Hausse temps de Ca 2 + réponses DHPG-évoqués sont plus rapides dans les astrocytes incubés dans TTX par rapport au contrôle (panneau supérieur), tandis que les amplitudes ne changent pas (panneau inférieur), indicatif d&#39;amplitudes de réponse «tout ou rien», une fois le seuil de répondre a été atteinte. (E) Hausse temps de astrocyte spontanée Ca 2 + transitoires sont également plus rapides dans TTX incubé par rapport au témoin incubé astrocytes (panneau supérieur), tandis que le pourcentage des astrocytes dans la population présentant spontanées Gq GPCR Ca 2 + augmente l&#39;activité (panneau inférieur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width = &quot;6 po&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figure 4. Enregistrement astrocytaire diminué activité Gq GPCR et groupes évoqués Je mGluR Ca 2 + réponses suivantes augmentation à long terme dans les points d&#39;accès neuronales par incubation en potassium extracellulaire élevée. (A) des traces représentatives des astrocytes Ca 2 + enregistrements de tranches incubées dans 5,0 mM K + ACSF à dépolariser les neurones et augmenter leur cadence de tir de base par rapport à contrôler ACSF (2,5 mM K + ACSF). Astrocytes incubées avec 5,0 mM K + ACSF exposition somatiques Ca 2 + transitoires de moins spontanées et plus faible DHPG évoqués réponses par rapport aux astrocytes incubées en contrôle ACSF. (B) Une comparaison des modèles de réponses évoquées à plusieurs concentrations de DHPG révèle types de réponse plus faibles après l&#39;augmentation à long terme dans les points d&#39;accès neuronales. (C) Une réduction du pourcentage des astrocytes dans la population présentant Ca 2 + activité spontanée est observée après incubation à long terme en K + élevé comparé à contrôler ACSF (panneau supérieur), tandis que les temps de montée de l&#39;activité spontanée deviennent plus lents (panneau inférieur). (D) Hausse temps de astrocyte évoqué Ca 2 + réponses à différentes concentrations de DHPG devenu plus lent suivant le traitement 5.0 mM K + par rapport aux astrocytes incubées en contrôle ACSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

Nous décrivons ici une adaptation des protocoles utilisés pour induire la plasticité homéostatique dans les neurones de l&#39;étude de la plasticité des G récepteurs couplés à la protéine astrocytaires. Récemment utilisé pour examiner les changements dans le groupe I mGluR astrocytes chez les souris jeunes, la méthode peut être appliquée pour mesurer l&#39;échelle des différents RCPG astrocytaires, dans les tissus de souris adultes in situ et in vivo, et d&#39;avoir une meilleure appréciation de la sensibilité des récepteurs astrocytaires aux variations de l&#39;activité neuronale.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une augmentation ou une diminution à long terme de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G de l'astrocyte GQG en réponse à des modifications de la transmission synaptique neuronale. Cela est réalisé en préparant d'abord des tranches aiguës d'hippocampe provenant de souris de type sauvage. La deuxième étape consiste à appliquer le sulur Rumine 1 0 1 sur les tranches afin de marquer les astrocytes.Ensuite, les tranches hippocampiques aiguës sont incubées pendant quatre à six heures avec de la tétradotoxine afin de bloquer les potentiels d'action neuronaux ou dans un liquide céphalo-rachidien artificiel standard. La dernière étape consiste à charger les astrocytes dans la couche radiatum de la tranche avec un indicateur calcique en utilisant un protocole de chargement par pression arrière. Enfin, la microscopie confocale est utilisée pour visualiser les modifications de l'activité de signalisation Gq/GPCR des astrocytes en enregistrant les variations des transitoires calciques spontanés et évoqués des astrocytes.Cette méthode permet d'obtenir des informations sur la plasticité des récepteurs des astrocytes et les modifications associées de la signalisation TQG PCR. Elle peut également être utilisée pour mesurer la plasticité homéostatique des récepteurs métabotropes dans les neurones. Pour commencer cette procédure, allumez le vibratome et assurez-vous que le drainage est fermé.Ensuite, fixez la chambre de coupe dans le vibratome et entourez la chambre de coupe de glace. Puis, retirez la graisse d'usine de la lame de rasoir double tranchant en la faisant tremper dans de l'éthanol à 70 % pendant cinq minutes, puis rincez-la avec de l'eau doublement distillée. Coupez-la soigneusement en deux moitiés et fixez une moitié sur le bloc de coupe pour la préparation des tranches de cerveau.Après avoir obtenu un cerveau de souris divisé en deux à l'aide d'une lame de rasoir refroidie dans une boîte de Pétri afin d'augmenter la surface destinée au refroidissement et à l'oxygénation, laissez les hémisphères sectionnés tremper deux à trois minutes dans la solution de coupe glacée afin qu'ils refroidissent complètement et deviennent plus solides. Ensuite, appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la plateforme du vibratome, puis fixez-y les deux hémisphères.Avec les faces coupées vers le bas, les côtés latéraux vers le haut et le bulbe olfactif orienté vers l'avant, fixez ensuite la plateforme dans la chambre de coupe. Remplissez la chambre de coupe avec du tampon de découpe bien oxygéné et glacé. Continuez à oxygéner la chambre de coupe tout en préparant des tranches para-sagittales de 300 microns à l’aide du vibratome. Après la découpe, disséquez l’hippocampe et le cortex entorhinal adjacent à partir de chaque tranche para-sagittale dans le tampon de découpe glacé et bien oxygéné.Pour fabriquer une pipette de transfert, cassez l'extrémité longue d'une pipette de Pasteur en verre et placez un embout de pipette sur la partie cassée. Transférez les tranches d'hippocampe une par une dans la chambre d'incubation placée dans le bain d'eau à 35 degrés Celsius. Veuillez noter que, pour des raisons de visibilité, ces étapes sont montrées ici avec les chambres d'incubation à l'extérieur du bain d'eau à 35 degrés Celsius.Incuber les tranches d'hippocampe pendant 20 minutes dans un SR 1 0 1 à une concentration d'un micromolaire dilué dans du LCR à faible teneur en calcium, dans un bain d'eau à 35 degrés. Puis les transférer dans du LCR à faible teneur en calcium sans SR 1 0 1 pendant 10 minutes supplémentaires. Réchauffer pour récupération.Transférez ensuite les tranches dans le LCR témoin ou expérimental pour les 15 minutes restantes de l'incubation à chaud. Après la récupération de 45 minutes, déplacez soigneusement les chambres d'incubation du bain-marie à 35 degrés Celsius vers le plan de travail et laissez les tranches continuer à s'incuber à température ambiante pendant trois heures au total avant de commencer le protocole de chargement en bolus. Dans cette procédure, préparez une pipette à partir d'une micropipette en verre borosilicique étirée jusqu'à une résistance d'environ 1,3 mégaohm lorsqu'elle est remplie de solution colorante.Placez ensuite une tranche d'hippocampe dans une chambre d'enregistrement et perfusez-la continuellement avec du LCR A oxygéné à 1,5 millilitre par minute ; n'utilisez qu'une tranche d'hippocampe présentant un pourcentage élevé de cellules CA1 paramédianes saines et une surface lisse, et jetez-la si elle paraît altérée. À l'aide d'une optique à contraste d'interférence différentielle, repérez un champ d'astrocytes approprié dans la strate radiaire située entre 40 et 70 micromètres sous la surface de la tranche. Puis, insérez la micropipette en verre préchargée avec la solution D dans un porte-électrode microscopique standard pour enregistrement en configuration patch.Abaissez-la jusqu'à la surface de la tranche au-dessus du champ, avec la pipette placée à la surface de la tranche. Appliquez une pression positive sur la pipette pour commencer à éjecter le colorant. Abaissez lentement la pipette à environ 40 micromètres sous la surface de la tranche à l’aide d’un micromanipulateur et laissez s’écouler le colorant pendant environ 45 à 60 secondes.Abaissez ensuite la pipette de 35 micromètres supplémentaires et éjectez le colorant pendant environ 45 à 60 secondes. Ensuite, retirez lentement la pointe de la pipette du tranché pour vous assurer qu'un grand nombre d'astrocytes incorporent le colorant. Il est généralement utile d'injecter un second bolus de colorant à une courte distance de l'endroit précédent.Pour ce faire, remontez la pipette jusqu'à la surface de la tranche et vérifiez que la pipette n'est pas obstruée. Déplacez ensuite la pipette d'environ 80 à 100 micromètres par rapport au premier site d'injection le long de la stratum radiatum, répétez l'injection en bolus à ce site, puis attendez de 30 à 45 minutes avant d'imager les astrocytes, le temps de configurer le microscope confocal pour l'acquisition d'images. Il est primordial de limiter l'exposition de la tranche à la lumière laser, car une exposition excessive peut entraîner un délavage du colorant et/ou une phototoxicité.Configurer les valeurs par défaut pour chaque laser sur un réglage élevé du photomultiplicateur, un gain de un x et une puissance de sortie du laser de 0,5 % par heure. Ensuite, appliquer un zoom de 1,5 x pour une meilleure visualisation des prolongements des astrocytes. Puis régler la résolution du champ sur 512 pixels par 512 pixels.Ensuite, réglez la vitesse de balayage au maximum, soit environ 1,2 seconde par balayage. En utilisant le mode de balayage unidirectionnel, collectez les spectres d'émission à l'aide de filtres à bande passante de 503 à 548 nanomètres pour le laser de 488 nanomètres et de 624 à 724 nanomètres pour le laser de 559 nanomètres. Puis, confirmez l'identité des cellules chargées avec le colorant calcique comme étant des astrocytes en visualisant la double coloration avec le SR 1 0 1.Utilisation du laser de 559 nanomètres pour enregistrer l'activité calcique des astrocytes. Dessinez d'abord des zones délimitées autour des régions d'intérêt à l'intérieur de la cellule à l'aide du logiciel d'acquisition d'images, dans ce cas-ci autour des corps cellulaires des astrocytes. Ensuite, dessinez une zone autour du fond comme référence.Enregistrez pendant 10 minutes l'activité calcique spontanée de base provenant des régions d'intérêt (ROIs). Ensuite, appliquez un agoniste d'intérêt à des concentrations croissantes séquentielles, en laissant un minimum de cinq minutes entre chaque application afin de réduire la désensibilisation éventuelle des récepteurs. À la fin de l'enregistrement, appliquez un cocktail d'agonistes ciblant d'autres voies GQ, RCPG astrocytaires comme contrôle positif des voies de signalisation GQ RCPG astrocytaires Inpact.À l’achèvement de l’enregistrement du calcium, acquérir des images fixes à l’aide des lasers de 488 nanomètres et de 559 nanomètres afin de confirmer ultérieurement l’identité des astrocytes et le positionnement des régions d’intérêt. Voici des images représentatives de cellules présentes dans le champ d’enregistrement, incubées dans des conditions de contrôle ou en présence de TTX, ayant incorporé le colorant indicateur de calcium Oregon Green BAFTA 1:00 AM et le SR 1 0 1. La superposition des deux signaux indique les astrocytes chargés de l’indicateur de calcium ; des zones sont délimitées autour des corps cellulaires individuels des astrocytes afin d’enregistrer l’intensité de fluorescence au fil du temps sur le canal vert, permettant ainsi de surveiller l’activité calcique dans les astrocytes.Voici les tracés représentatifs des enregistrements d'activité calcique dans les astrocytes. Les astrocytes incubés avec de la TTX présentent une activité spontanée accrue et des réponses calciques du groupe un des récepteurs MGL R plus marquées, comme en témoignent les modifications du profil de réponse. Des exemples de transitoires calciques uniphasiques, multiphasiques et en plateau sont montrés. Voici des tracés représentatifs d'enregistrements calciques dans les astrocytes provenant de tranches incubées dans un liquide céphalorachidien artificiel (A CSF) contenant 5,0 millimolaire de potassium, afin de dépolariser les neurones et d'augmenter leur fréquence de décharge de base par rapport au liquide céphalorachidien artificiel contrôle contenant 2,5 millimolaire de potassium. Les astrocytes incubés avec un liquide céphalorachidien artificiel contenant 5,0 millimolaire de potassium présentent moins de transitoires calciques somatiques spontanés et des réponses induites par le DHPG plus faibles par rapport aux astrocytes incubés dans le liquide céphalorachidien artificiel contrôle. L'imagerie calcique dans les astrocytes fournit un bon indicateur fonctionnel des modifications de la signalisation par les récepteurs couplés aux protéines G.Cependant, elle ne permet pas d'identifier précisément à quel endroit du chemin de signalisation ces modifications interviennent. Par conséquent, une approche complémentaire consisterait à utiliser le tri cellulaire activé par fluorescence ou la cytométrie en flux sur des astrocytes exprimant la protéine fluorescente verte, puis à appliquer un anticorps dirigé contre le récepteur couplé à la protéine G d'intérêt, et enfin à réaliser des immunobuvards (western blots) afin de détecter d'éventuelles modifications des niveaux d'expression du récepteur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer la régulation de l'activité de la RT-qPCR dans les astrocytes, suite à des modifications de la transmission synaptique neuronale, en enregistrant les événements calciques spontanés et les événements calciques induits par l'agnésie dans les astrocytes.

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