Une méthode peu coûteuse pour l'analyse de la saisie-comme activité et de mouvement dans Drosophila

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les altérations des comportements locomoteurs ou convulsifs chez la drosophile. Pour ce faire, il suffit d’abord de séparer les mouches dans des flacons individuels sous anesthésie. Ensuite, une simple webcam est utilisée pour enregistrer le mouvement des mouches.

Les données sont ensuite importées dans l’image J pour commencer l’analyse. Enfin, un logiciel d’analyse de mouches sur mesure est utilisé pour déterminer la distance, la vitesse et la durée du mouvement pendant la période d’enregistrement. En fin de compte, ce test peut montrer des changements dans le comportement locomoteur ou convulsif qui sont associés à des manipulations génétiques et pharmacologiques.

Maintenant, cette technique d’enregistrement peu coûteuse que nous allons décrire peut être utilisée à la fois pour analyser le comportement des crises et la locomotion chez les mouches des fruits. En particulier, nous l’avons utilisé pour identifier les manipulations génétiques et pharmacologiques qui modifient le comportement des crises chez ces mouches. Mais aujourd’hui, Chris Burner, un assistant de recherche de premier cycle dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette technique pour commencer à configurer la webcam qui enregistrera les mouches pendant les tests de locomoteur et de convulsions.

Une fois l’appareil photo en place, ouvrez le logiciel pratique a VI. Pour régler les paramètres d’enregistrement, sélectionnez l’option Images time-lapse sous l’onglet Capture, et lorsque la nouvelle fenêtre s’ouvre, sélectionnez la webcam comme périphérique de capture. Pour la plupart des expériences, une taille de trame vidéo de six 40 par quatre 80 est suffisante. Sous l’option de compression, sélectionnez le codec Intel IUV et réglez les secondes par image en fonction du test.

Sous l’onglet avancé, créez un fichier image bitmap pour chaque capture et sélectionnez un dossier dans lequel le programme stockera la pile d’images une fois enregistrée. Ensuite, placez une mouche morte sur une feuille de papier. Cliquez sur la boîte des paramètres vidéo et, sous l’onglet Paramètres de l’appareil, ajustez les paramètres jusqu’à ce que le fond blanc brillant contraste clairement avec la mouche plus sombre.

Cliquez sur le bouton de démarrage pour commencer l’enregistrement. Une fois la période d’enregistrement terminée, cliquez sur le bouton d’arrêt. La pile d’images doit maintenant se trouver dans le dossier sélectionné pour commencer le test d’activité locomotrice.

Transférez les mouches dans des flacons individuels recouverts d’un bouchon de coton. Laissez les mouches reposer sans être dérangées pendant 20 à 30 minutes avant de continuer. Après ce temps, tapotez doucement la mouche à tester hors du flacon et sous un couvercle de boîte de Pétri.

Le couvercle doit contenir de petites fentes pour permettre la circulation de l’air, positionner la mouche sous la webcam configurée précédemment. Lorsque vous êtes prêt, appuyez sur start pour commencer à enregistrer l’activité locomotrice. La première étape du test de crise consiste à nourrir des mouches sensibles aux crises âgées de deux jours, soit dans des milieux standard, soit dans des milieux mélangés au médicament à tester.

Après deux jours d’alimentation, transférez les mouches en tapotant doucement dans des flacons vides individuels et bouchez les flacons avec un bouchon de coton. Laissez les mouches reposer sans être dérangées pendant 20 minutes avant de les observer. Lorsque vous êtes prêt, faites tourbillonner une fiole sur un vortex de laboratoire ou en utilisant les paramètres les plus élevés pendant 10 secondes.

Placez immédiatement la mouche immobilisée sur une feuille de papier blanc directement sous la webcam. Une fois en place, commencez l’enregistrement. Cela vole l’activité.

La mouche subira des mouvements rapides et non coordonnés entrecoupés de périodes de paralysie. L’enregistrement se termine une fois que la mouche s’est redressée. Pour commencer à analyser les données, ouvrez le logiciel de traitement d’image gratuit image J une fois ouvert.

Importez la pile d’images souhaitée en cliquant d’abord sur l’onglet Fichier, puis en sélectionnant Importer. Et enfin, la séquence d’images. Sélectionnez le dossier qui contient la pile d’images et ouvrez une image.

Lorsque la boîte de dialogue des options de séquence s’ouvre, sélectionnez les noms de tri numériquement, puis sélectionnez. D’accord. La pile d’images sera maintenant chargée dans l’image J.Ensuite, sélectionnez l’onglet image et définissez le type de valeur sur huit bits. Cliquez à nouveau sur l’onglet de l’image et sélectionnez le seuil sous l’option d’ajustement.

Cela définit le seuil dans toutes les images de sorte que chacune se compose d’un fond blanc avec la mouche convertie en un point noir. Cela ouvre également la boîte de dialogue du seuil où les points de coupure peuvent être ajustés. Parcourez les images pour voir si certaines contiennent des points noirs supplémentaires ou si l’endroit est manquant.

Si nécessaire, ajustez le seuil pour atténuer tout problème. Une fois les ajustements effectués, sélectionnez Appliquer dans la boîte de dialogue du seuil. Lorsque la boîte de dialogue Convertir en masque s’ouvre, cliquez sur OK pour limiter la pile d’images.

Pour mesurer le mouvement de la mouche en pixels, sélectionnez le plugin multi tracker sous l’onglet plugins. Lorsque la boîte de dialogue du suivi d’objet s’affiche, cliquez sur les quatre options indiquées et sélectionnez. D’accord. Le plugin multi tracker attachera ensuite des coordonnées au noir.

dans chaque tranche, et listez-les dans la fenêtre des résultats, ainsi que la longueur totale en pixels. La fenêtre des chemins donne l’affichage graphique du chemin emprunté par la mouche. Copiez la liste des coordonnées X et Y à partir de la fenêtre des résultats et collez les données dans une feuille de calcul Excel.

Si une diapositive de la pile n’a pas de noir. Le programme Multi Tracker s’arrêtera à cette diapositive. Si cela se produit, reseuilz la pile pour vous assurer que la mouche est enregistrée comme noire.

dans la diapositive en question. Pour convertir la longueur du chemin de pixels en centimètres, prenez une image de deux points espacés d’une distance connue sur une feuille de papier blanche vierge. Déterminez les coordonnées de pixels XY pour les deux points et utilisez ces informations pour déterminer le nombre de pixels correspondant à un centimètre pour des résultats plus précis.

Supprimez le bruit des images en important les coordonnées XY dans un programme d’analyse de mouches personnalisé. Une fois ouvert, importez les données de chaque génotype ou traitement dans des feuilles de calcul distinctes. Ensuite, sélectionnez l’onglet de la feuille récapitulative et cliquez sur le bouton cliquez moi.

Sélectionnez une valeur de seuil en fonction du type d’analyse, cliquez sur OK et le programme calculera la vitesse, le temps et la distance de mouvement. Ces voies représentatives montrent une activité convulsive chez les mouches mutantes avec et sans traitement à la metformine. L’activité convulsive a diminué avec le traitement chez les deux mutants testés.

La metformine a considérablement réduit à la fois la distance parcourue pendant le test de crise et la durée totale de l’activité convulsive. En revanche, il n’y a pas eu de changement dans la vitesse moyenne dans ces trajectoires locomotrices individuelles. Le chemin de la mouche sauvage CS de type sauvage montre une concentration autour de la périphérie de l’arène circulaire.

Alors que la trajectoire d’une mouche BSS mutante montre la même concentration, mais avec moins de mouvement dans l’ensemble. Lorsqu’ils ont été testés pour la locomotion dans un nouvel environnement, les mutants BSS ont montré une réduction significative de la longueur du trajet par rapport aux mouches CS. L’essai a également détecté des changements dans la vitesse du mouvement pendant que la mouche CS explorait pendant l’essai locomoteur.

La mouche BSS est restée relativement inactive tout au long de l’essai, à l’exception de quelques rafales d’activité. L’une des choses les plus importantes à garder à l’esprit lorsque vous effectuez l’un ou l’autre de ces tests comportementaux avec cette technique est de vous assurer que vous n’anesthésiez pas les mouches avant de faire les enregistrements. Il s’avère que l’anesthésie affectera à la fois le comportement des crises et le comportement locomoteur et peut modifier considérablement vos résultats.