Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d'un faisceau d'ions focalisés

L’objectif global de cette procédure est de préparer un échantillon pour la cryo TEM en extrayant une lamelle de faisceau d’ions focalisée à partir d’un échantillon en vrac congelé cryogéniquement. Ceci est accompli en plongeant d’abord, en congelant l’échantillon dans de l’azote liquide et en le montant à l’intérieur du MEB à faisceau d’ions cryofocalisé. La deuxième étape consiste à découper un mince LA Melo avec le faisceau d’ions et à le transférer sur une grille TEM au moyen d’un nanomanipulateur refroidi.

Ensuite, le réseau TEM est transféré du support SEM au support TEM dans une station de transfert. La dernière étape est le transfert du support TEM vers le TEM cryogénique pour une analyse plus approfondie. En fin de compte, le TEM cryogénique est utilisé pour afficher des images à haute résolution, des tomos Grahams ou des cartes radiographiques de la lamelle extraite.

Cette technique nous permettra d’analyser la matière molle avec une résolution ultime au microscope électronique à transmission en présélectionnant le lieu d’analyse par d’autres microscopies telles que la microscopie optique ou l’électromicroscopie à balayage. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la cryomicrotomie Mac est d’éviter les artefacts de préparation tels que la compression et la formation de def de l’échantillon. Montez d’abord deux grilles TEM pour des échantillons de faisceaux d’ions focalisés.

Sur le support de transfert MEB, fixez les grilles en serrant les vis correspondantes à l’aide d’un tournevis et fermez les volets, montez un embout d’échantillon approprié à l’échantillon et ajoutez une partie de l’échantillon. Par exemple, utilisez une pipette pour déposer des gouttelettes sur un bout plat. Montez ensuite le support de transfert SEM sur le dispositif de transfert sous vide ou VTD.

Après avoir ajouté de l’azote liquide dans la station de gadoue et pompé, ouvrez la station et plongez la congélation du support de transfert SEM jusqu’à ce que l’ébullition soit terminée et que la neige fondue soit à nouveau obtenue. Ensuite, rétractez le support de transfert SEM dans la chambre à vide du VTD et scellez-le. Purgez la station de gadoue et la chambre de préparation cryogénique Le sas aérant le sas extérieur.

Associez ensuite le joint VTD avec le sas de la chambre de préparation cryogénique et de la pompe. Lorsqu’un bon niveau de vide est atteint, mesurez la goupille du sas pour ouvrir le joint du VTD et le sas extérieur. Insérez ensuite le support de transfert SEM.

Ensuite, à l’aide d’un couteau froid, ouvrez les couvercles de protection des fentes de la grille TEM. Coupez la haute tension sur le MEB à faisceau d’ions focalisé et ouvrez le sas intérieur. Utilisez ensuite le VTD pour transférer le support MEB dans la chambre d’échantillonnage.

Une fois que le support de MEB est à l’étape froide, désengagez le VTD en poussant et en tournant. Rétractez la tige VTD jusqu’au bout dans la chambre à vide VTD et fermez le sas intérieur, le sas extérieur et le joint VTD. À ce stade, chauffez le gaz précurseur à 24 à 26 degrés Celsius et positionnez le système d’injection de gaz ou l’aiguille GIS à une hauteur d’environ un millimètre au-dessus de la surface de l’échantillon.

Pendant l’imagerie avec le faisceau d’électrons, ouvrez la vanne de gaz pendant quelques secondes. Ensuite, durcissez le dépôt sur la région d’intérêt, ou ROI, en utilisant un faisceau d’ions de 1000 pico ampire à faible grossissement. Après le durcissement, inclinez l’échantillon à 52 degrés de sorte que la surface soit perpendiculaire au faisceau d’ions.

Moulinez-vous. Deux tranchées terroristes. De chaque côté du retour d’investissement, inclinez l’échantillon à zéro degré et utilisez le faisceau d’ions pour couper les côtés et le dessous de la lamelle, en vous assurant que les marques de coupe traversent toute la lamelle.

Une fois l’aiguille GIS insérée, manœuvrez le nanomanipulateur jusqu’à ce que sa pointe soit en contact physique avec la lamelle, de préférence sur le côté. Ouvrez la vanne GIS pendant quelques secondes et surveillez le dépôt cryogénique par imagerie continue avec le faisceau d’électrons. Lorsqu’une couche supplémentaire d’un à deux micromètres de platine a été cryodéposée, fermez la valve après cette cure du platine uniquement dans les quelques micromètres autour du point où le nanomanipulateur est en contact avec la lamelle.

Utilisez ensuite un courant de faisceau d’ions élevé pour libérer la lamelle. Manœuvrez avec précaution le nanomanipulateur pour extraire la lamelle des tranchées et déplacez-la à au moins 500 micromètres au-dessus de la surface de l’échantillon. Après avoir rétracté l’aiguille, abaissez l’étage d’échantillonnage de quelques millimètres et déplacez-le jusqu’à ce que l’une des grilles TEM soit visible.

Déplacez la zone de fixation sur la grille en position de travail et insérez l’aiguille GIS. Ensuite, manœuvrez soigneusement le nanomanipulateur pour mettre la lamelle attachée en contact physique avec la zone de fixation sur la grille TEM, ouvrez la vanne de gaz pendant quelques secondes et cryodéposez une couche supplémentaire d’un à deux micromètres de platine pour durcir le platine uniquement en quelques micromètres autour du point de contact entre la lamelle et la grille TEM. Utilisez ensuite un courant de faisceau d’ions élevé pour libérer la lamelle du nanomanipulateur.

Inclinez l’échantillon à 52 degrés et utilisez le faisceau d’ions pour l’amincir jusqu’à ce qu’il devienne transparent pour obtenir une transparence électronique. Après avoir rincé la station de transfert cryogénique avec de l’azote gazeux sec, insérez le support TEM de transfert cryogénique dans la fente appropriée de la station de transfert cryogénique et remplissez-le d’azote liquide. Ensuite, plongez un tournevis, l’outil de serrage de l’échantillon TEM et une pince à épiler dans une coupelle cryogénique remplie d’azote liquide afin de refroidir leurs pointes à la température souhaitée.

Une fois que le VTD est adapté au sas extérieur, amenez l’étage froid à la hauteur de transfert de 16 millimètres. Après avoir désactivé la haute tension, ouvrez le joint VTD, le sas extérieur et le sas intérieur. Utilisez ensuite la tige VTD pour verrouiller le support de transfert SEM en poussant et en tournant dans le sens des aiguilles d’une montre.

À ce stade, rétractez le support de transfert SEM dans la chambre de préparation cryogénique. À l’aide du couteau froid, fermez les couvercles de protection des grilles TEM. Ensuite, utilisez la tige VTD pour déplacer l’échantillon dans la chambre à vide du VTD fermer et sceller le sas.

Ensuite, aérez le sas extérieur et détachez le VTD. Adaptez le VTD au port MEB de la station de transfert cryogénique. Lors du rinçage à l’azote sec, utilisez la goupille de la station pour ouvrir le joint du VTD et faites glisser le support de transfert SEM dans le faiseur de la station de transfert cryogénique.

À l’aide du tournevis refroidi, ouvrez l’un des couvercles et desserrez la vis correspondante, en maintenant la grille TEM en place. Ensuite, prenez la grille TEM et placez-la dans le support TEM à l’aide de la pince à épiler refroidie. Ensuite, fixez la grille TEM sur le support TEM.

À l’aide de l’anneau hexagonal refroidi, fermez l’obturateur du support TEM de transfert cryogénique et déconnectez la station de transfert cryogénique du système de pompage. Transportez la station et le contrôleur de chauffage du support TEM à proximité du TEM et reconnectez-les. Réglez la platine d’échantillonnage TEM sur une inclinaison de moins 70 degrés.

Ensuite, réglez le temps de pompage le plus court pour le sas avec un seul cycle de purge avec de l’azote gazeux sec. Retirez le support TEM de la station de transfert cryogénique et insérez-le dans le premier étage du goniomètre incliné, qui démarrera le cycle de pompage. Une fois le cycle terminé, réglez le goniomètre pour qu’il s’incline à nouveau à zéro degré tout en tenant le support TEM de manière à ce qu’il ne tourne pas avec le goniomètre.

Insérez ensuite le support à travers le goniomètre complètement à l’intérieur du TEM. Enfin, remplissez le support de transfert cryogénique TEM avec de l’azote liquide. Dans cette méthode, les spores d’aspergillus Niger sont d’abord imagées par MEB pour identifier le site d’extraction.

Une section efficace de n’importe quelle spore est suffisante, mais il est possible de positionner le ROI pour l’extraction avec une précision inférieure au micromètre pour trancher une cellule spécifique à une distance spécifique de la membrane cellulaire. Une fois que la caractéristique d’intérêt a été identifiée, la première étape du dépôt cryogénique est mise en œuvre Pour protéger l’échantillon des dommages causés par le faisceau pendant le broyage ionique, l’échantillon est incliné à 52 degrés, suivi d’une pulvérisation de deux tranchées des deux côtés de la melle. L’échantillon est ensuite incliné vers l’arrière et broyé davantage, ne laissant que deux petits ponts le reliant à la masse.

Le nanomanipulateur refroidi est mis en contact avec le mella et un autre dépôt cryogénique de platine les soude ensemble. Les petits ponts de connexion sont fraisés, et le nanomanipulateur déplace la lamelle près de la zone de fixation de qualité TEM, où elle est soudée avec un dépôt cryogénique final de platine. Le nanomanipulateur est ensuite séparé de la lamelle, qui est mince jusqu’à la transparence des électrons.

Avec le faisceau d’ions, la lamelle est transférée au TEM où la spectroscopie d’imagerie à haute résolution, la tomographie et d’autres techniques peuvent être utilisées. Cette méthode contribuera à comprendre les interfaces cœur-matière molle dans des systèmes tels que les neurosondes ou les implants osseux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons de cryo TM qui sont des artefacts trois, et qui peuvent être extraits d’une région spécifique d’un échantillon de bogue avec une précision inférieure au micromètre.