Name: Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen dun faisceau dions focalisés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Apprenez la préparation d'échantillons pour cryo-microscopie électronique par faisceau d'ions focalisés. Cette méthode permet d'extraire des lamelles minces de matériaux biologiques congelés pour une imagerie haute résolution sans artéfacts.

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Cette recherche a reçu le soutien du projet QNano http://www.qnano-ri.eu qui est financé par les infrastructures de recherche de la Communauté européenne au titre du programme Capacités du 7e PC (Grant No. INFRA-2010-262163). Nous remercions également le Conseil de recherches Formas de soutien financier.

REMARQUE: tous les paramètres donnés dans ce protocole sont valables pour les instruments et les modèles indiqués ici. Certains de ces paramètres (marqués par * dans le texte) peuvent différer si un autre fabricant ou le modèle utilisé. 1. Démarrage de la FIB / SEM <ol><li> Montez le nanomanipulateur froid sur mesure (NM) pointe sans y attacher les tresses Cu à la anticontaminator (AC). Au lieu de s&#39;assurer que les tresses sont reliés au reste de la NM-dessus du point d&#39;empêcher la charge pendant l&#39;étape d&#39;affûtage (1.2) d&#39;isolation. <ol><li> Fermer la chambre SEM, pompe à vide poussé et de l&#39;image de la pointe de NM. </li><li> Si la pointe est émoussée, tordue ou contaminés par l&#39;utilisation précédente, l&#39;aiguiser au moyen du faisceau d&#39;ions: sélectionner les motifs de fraisage polygonales sur les côtés de la pointe, de sorte que, après broyage, la pointe se rétrécissant vers le bas à 1 pm ou moins. </li><li> Une fois que les côtés de la pointe ont été blanchi loin, tourner manuellement par 90 ° la tige de NM ensembledepuis l&#39;extérieur de la chambre SEM. </li><li> Ajustez les modèles polygonaux de fraisage pour s&#39;adapter à la pointe tournée et répéter le fraisage sous un angle différent. </li></ol></li><li> Une fois la pointe a été aiguisé à moins de 1 pm, rentrer le NM et insérer l&#39;aiguille du système d&#39;injection de gaz (GIS); repositionner l&#39;aiguille pour être à environ 1 mm au-dessus de la distance de travail (au lieu de l&#39;habituel 175 um). </li><li> Si l&#39;on utilise un précurseur de Pt, de changer la température de fonctionnement de 24 à 26 ° C (au lieu de l&#39;habituel 40 ° C). Ces mesures sont nécessaires pour cryo-dépôt 13 de la Pt. </li><li> Ouvrez la chambre SEM et préparer la FIB / SEM pour cryo-mode en montage de la scène de l&#39;échantillon de cryo et l&#39;AC. </li><li> Mettez le Mexique à la position d&#39;insertion et de connecter ses tresses Cu à l&#39;AC. Assurez-vous de ne pas toucher accidentellement la pointe de NM. Le système est refroidi avec le NM inséré à faire en sorte que la perte de souplesse de la tresse Cu à des températures cryogéniques ne gênera pas le mouvement de NMment. </li><li> Purger les tuyaux de refroidissement à l&#39;azote sec pendant quelques minutes. </li><li> Pomper la chambre de préparation de cryo et la chambre d&#39;échantillon principal à un vide poussé. </li><li> Ajouter l&#39;azote liquide pour refroidir les Dewars deux chambres. Attendez jusqu&#39;à ce que la température désirée est atteinte. </li></ol> 2. Congélation de l&#39;échantillon <ol><li><ol><li> Montez deux grilles de TEM pour les échantillons FIB sur le support de transfert SEM. Fixez en serrant les vis correspondantes avec un tournevis. </li><li> Monter un échantillon stub approprié pour l&#39;échantillon et ajouter une partie de l&#39;échantillon. Selon le type d&#39;échantillon, l&#39;échantillon peut être fixé avec de la colle cryogénique ou avec une pince. Utiliser des quantités aussi petites que possible pour garantir une congélation optimale. </li><li> Monter le support de transfert SEM sur le dispositif de transfert sous vide (VTD). </li></ol></li><li><ol><li> Ajouter de l&#39;azote liquide dans la station de trituration et de la pompe vers le bas pour obtenir la gadoue de l&#39;azote. </li><li> Ouvrez le slstation de pousant et plongée geler le support de transfert SEM. Pompe à nouveau jusqu&#39;à ébullition est terminée et la neige fondante est obtenu à nouveau. Il convient de noter que l&#39;éthane ou de neige fondante au propane ou le gel à haute pression sont des techniques mieux adaptés pour obtenir la vitrification de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li><ol><li> Rétracter le support de transfert SEM dans la chambre à vide de la VTD et la scelle. </li><li> Purger la station de trituration et la cryo chambre de préparation sas. </li><li> Assortir le joint VTD avec le sas de la chambre de préparation et de cryo pompe. </li><li> Quand un niveau de vide bien est atteint, engager l&#39;axe du sas d&#39;ouvrir le sceau de la VTD et le sas extérieur; insérer le support de transfert SEM. Il existe des marquages ​​sur les contacts glissants dans les chambres de préparation indiquant la position de l&#39;échantillon pour la pulvérisation cathodique et la fracturation. </li></ol></li><li> Si nécessaire, l&#39;échantillon peut être: fracture avec le couteau froid; sublimé par la mise en température plus élevée (généralement -1006, C); revêtue d&#39;Au / Pd ou Pt par l&#39;intermédiaire de la sputterer froid (300 V, 10 mA, 60 sec pour une 3.2 nm de Au / Pd cap) *. Sublimation ne doit pas être utilisée pour les échantillons vitrifiés pour éviter leur recristallisation. </li><li><ol><li> Utilisez le couteau froid pour ouvrir les couvercles de protection des fentes de la grille de TEM. </li><li> Amener le stade à froid dans la chambre de mesure à la hauteur de réception (16 mm *). </li><li> Couper le HT sur le FIB / SEM et ouvrir le sas intérieur. </li><li> Utiliser le VTD pour transférer le support SEM dans la chambre d&#39;échantillon. Gradation de l&#39;éclairage dans la salle peut aider dans cette étape. </li><li> Une fois que le porte-SEM est dans la phase froide, désengager la VTD en poussant et en tournant. </li><li> Rétracter la tige VTD tout le chemin dans la chambre à vide VTD et fermer le sas intérieur, le sas extérieur et le joint VTD. Le sas externe peut maintenant être évacué à retirer le joint VTD. Cette dernière étape n&#39;est pas obligatoire, mais il est recommandé que la tige VTD peut être facilement délogé par accident, ce qui peut causer des dommagesà la VTD ou le sas. </li></ol></li></ol> 3. Ion Fraisage <ol><li> Tournez sur la haute tension sur les deux colonnes et définir les paramètres appropriés d&#39;imagerie (tension d&#39;accélération: 10 kV pour le faisceau d&#39;électrons, 30 kV pour le faisceau d&#39;ions; taille de spot: 3; distance de travail: 5 mm, faisceau d&#39;ions actuelles: 10-100 pA pour l&#39;imagerie, 1-3 nA pour le fraisage) *. </li><li> Utiliser le faisceau d&#39;électrons pour trouver une caractéristique d&#39;intérêt et pour acquérir des images sur le document de l&#39;état de l&#39;échantillon avant l&#39;extraction de la lamelle. </li><li> Une fois une région d&#39;intérêt (ROI) pour l&#39;extraction a été identifié, le marquer par un motif de faisceau d&#39;ions, à moins que la topographie de l&#39;échantillon lui-même permet une identification facile du retour sur investissement, même après le dépôt Pt. Pour plus de précision, utilisez la méthode décrite par Pettersson et al. 14 Les inscriptions doivent être profond, large et assez loin pour être toujours visible après avoir été couvert par le dépôt cryo-Pt (qui est non-selcace et couvrira plusieurs mm 2 de la surface de l&#39;échantillon). </li><li> Chauffer le gaz précurseur à 24-26 ° C et insérer l&#39;aiguille de SIG pour une hauteur d&#39;environ 1 mm au-dessus de la surface de l&#39;échantillon (voir l&#39;étape également 1.3). </li><li> Bien que l&#39;imagerie par faisceau d&#39;électrons, ouvrir la vanne de gaz pendant quelques secondes. La vitesse de dépôt cryo-Pt est de 100 à 500 nm / s ou plus, en fonction de la distance de l&#39;aiguille d&#39;SIG, la rugosité de l&#39;échantillon et le système de l&#39;utilisateur. Il est recommandé d&#39;effectuer quelques dépôts d&#39;essai pour déterminer les paramètres optimaux. </li><li> Le dépôt brut cryo-Pt est très rugueuse et homogène. Guérir le dépôt sur le retour sur investissement en utilisant un faisceau d&#39;ions 1000 pA à faible grossissement (par exemple 2000 X). Contrairement au dépôt de cryo, ce site de durcissement est sélectif et ne doit être effectuée sur la seule ROI. Le but de cette première cryo-dépôt est de protéger la surface de l&#39;échantillon contre les dommages par faisceau d&#39;ions et à réduire l&#39;amincissement ionique au cours de frisage 13. </li><li> Inclinez l&#39;échantillon à52 °, de sorte que la surface est perpendiculaire au faisceau d&#39;ions. Mill distance deux tranchées en terrasses de chaque côté de la ROI. Des dimensions typiques pour les tranchées sont de 20 à 30 um dans la direction (X) parallèle à la lamelle à extraire, de 10 à 15 um dans la direction perpendiculaire (Y) et par une variable, en pente profondeur (Z), avec le point le plus profond près de la ROI. La pente doit être de 45-55 °. Dans certains instruments, tranchées en terrasses ne peuvent être broyées avec le point le plus profond sur le dessus. Dans ce cas, un moulin dans le cadre du retour sur investissement, puis faire pivoter l&#39;image de 180 ° et le moulin le deuxième de l&#39;autre côté. La profondeur de fraisage peut être sélectionné si le taux de la matière de pulvérisation cathodique est connue. Pour la plupart d&#39;échantillon congelé-hydraté, le taux de glace par pulvérisation cathodique peut être utilisé 7. </li><li> Inclinez l&#39;échantillon à 0 ° et utiliser le faisceau d&#39;ions à couper les côtés et le dessous de la lamelle, en s&#39;assurant que les repères de coupe passent par toute la lamelle (ils devraient laisser des traces de fraisage sur le moulin des pentes en terrassesed à l&#39;étape précédente). Laisser seulement deux petits ponts de liaison de la lamelle vers le reste de l&#39;échantillon. </li><li> Insérez l&#39;aiguille de SIG (cela peut changer légèrement l&#39;échantillon). Manœuvrer le Mexique jusqu&#39;à la pointe est en contact physique avec la lamelle, de préférence sur le côté. Assurez-vous que le Mexique ne gêne pas la vue du faisceau d&#39;ions des deux petits ponts de liaison. </li><li><ol><li> Ouvrir la vanne de SIG pendant quelques secondes et contrôler le dépôt de cryo par imagerie continue avec le faisceau d&#39;électrons. </li><li> Quand une couche supplémentaire de 1-2 um de Pt a été cryo-déposé, fermer la vanne. </li><li> Guérir le Pt (voir l&#39;étape 2.6) que dans les quelques um autour du point où le Mexique est en contact avec la lamelle. </li><li> Utilisez un courant de faisceau ionique élevée pour couper la lamelle libre. Les deux ponts de liaison doivent être broyés à une distance, ainsi que tout excès de Pt qui aurait pu se former de nouveaux points de contact entre la lamelle et le reste de l&#39;échantillon. Ne se rétracte pas encore l&#39;aiguille de SIG. </li></ol></li&gt; <li> Manoeuvrer avec précaution le NM pour extraire la lamelle de tranchées et de le déplacer au moins 500 um au-dessus de la surface de l&#39;échantillon. Ce n&#39;est qu&#39;après cette étape, rétracter l&#39;aiguille SIG. </li><li> Abaissez la scène de l&#39;échantillon de quelques mm et le déplacer jusqu&#39;à ce que l&#39;une des grilles de TEM est en vue. Déplacez la zone de fixation sur la grille en position de travail et insérer l&#39;aiguille de SIG. </li><li><ol><li> Manoeuvrer avec précaution le NM pour amener la lamelle attachée en contact physique avec la zone de fixation sur la grille de TEM. Il devrait y avoir aucune pression ou de tension entre la lamelle, la grille de TEM et le Mexique. </li><li> Ouvrez le robinet de gaz pour quelques secondes et cryo-dépôt d&#39;une couche supplémentaire de 1-2 um de Pt. </li><li> Guérir le Pt (voir l&#39;étape 2.6) que dans les quelques um autour du point de contact entre la lamelle et la grille de TEM. </li></ol></li><li> Utilisez un courant de faisceau ionique élevée pour couper la lamelle libre de la NM. Ceci peut être réalisé par broyage à une distance de l&#39;une ou l&#39;autre extrémité de la NM ou le côté de l&#39;échantillon. En til premier cas, la pointe devra être affûté à nouveau avant la prochaine utilisation, comme décrit dans l&#39;étape 1.2. </li><li> OPTION: à ce stade, il est possible d&#39;utiliser le VTD de prendre la porte de transfert SEM et stocker O / N dans un Dewar rempli d&#39;azote liquide. Ce transfert et O / N stockage est susceptible de provoquer la formation de glace sur la surface de la lamelle, si les cristaux de glace sont déjà présentes et / ou si l&#39;azote liquide est exposé à de l&#39;air humide; mais une telle contamination sera supprimé par la prochaine étape dans un temps relativement court. Comme les étapes précédentes ont peut-être pris plusieurs heures pour terminer, il pourrait être approprié de le faire, puisque, après l&#39;étape suivante tel stockage O / N n&#39;est pas recommandé, car il n&#39;y aurait aucun moyen de supprimer la contamination de glace sauf par sublimation (qui ne peut pas être effectué si la vitrification de l&#39;échantillon doit être maintenue). </li><li> Inclinez l&#39;échantillon à 52 ° et d&#39;utiliser le faisceau d&#39;ions de mince à électrons transparence 7. Il est recommandé de commencer avec une plus grande, rougses courants de faisceau de supprimer l&#39;essentiel et de procéder à une amende polissage de la surface avec des courants de poutre inférieure, réduisant éventuellement aussi la tension d&#39;accélération. L&#39;épaisseur finale de la lamelle doit être de 100 à 200 nm ou moins pour l&#39;analyse de l&#39;ultrastructure de 100 à 200 kV dans un TEM ou jusqu&#39;à 500 nm pour une tomographie à 300 kV TEM, en fonction de la composition de l&#39;échantillon. Lors de l&#39;amincissement, les contraintes internes de l&#39;échantillon peuvent causer la lamelle se gondoler ou de se tordre. Dans un tel cas, la région amincie doit être limité. Cela s&#39;est produit par exemple dans les Figures 11 et 12. </li></ol> 4. Cryo transfert de TEM <ol><li><ol><li> Rincer la station cryo-transfert avec de l&#39;azote gazeux sec pendant quelques minutes. </li><li> Ajouter l&#39;azote liquide pour le Dewar de la TEM AC et de la gare cryo-transfert. </li><li> Insérez le support de cryo-MET transfert dans la fente appropriée de la station cryo-transfert et remplir son Dewar ainsi. Attendez jusqu&#39;à ce que chaque échantillononent a atteint la température souhaitée (environ 15 min). Si possible, le dispositif de commande du support de cryo-TEM transfert doit être connecté pour contrôler la température au cours du transfert. Il est important de se rendre compte que la pointe du support de TEM (où le capteur de température est situé) sera en contact avec la station cryo-transfert et ne sera donc refroidir beaucoup plus rapidement que le reste du support de TEM. Il est donc recommandé que le temps nécessaire pour l&#39;ensemble du support de cryo-TEM transfert à refroidir est mesurée au préalable, et que le système est autorisé à thermaliser au moins pour ce laps de temps. </li><li> Remplissez une tasse cryogénique à l&#39;azote liquide et plonger en elle: l&#39;outil TEM échantillon de serrage, un tournevis et une pince à épiler, afin de refroidir leurs conseils à la température désirée. Tous les outils doivent être correctement isolés à l&#39;autre extrémité afin de ne pas causer des brûlures à froid à la main de l&#39;opérateur. </li></ol></li><li> Correspondre à la VTD au sas extérieur. Apportez le cerf froide à la hauteur de transfert (16 mm *). Désactiver la haute tension. </li><li><ol><li> Ouvrez le sceau VTD, le sas extérieur et intérieur du sas. </li><li> Utiliser la tige VTD pour verrouiller dans le support de transfert SEM en poussant et en tournant dans le sens horaire. </li><li> Rétracter le support de transfert SEM dans la chambre de préparation cryo. </li><li> Utilisez le couteau froide pour refermer les couvercles de protection des grilles de TEM. Cela est nécessaire pour réduire la contamination de glace possible pendant le transfert. </li><li> Utiliser la tige VTD pour déplacer l&#39;échantillon dans la chambre à vide de la VTD. </li><li> Fermez les sas et joint. </li></ol></li><li> Purger le sas extérieur et détacher le VTD. Correspondre à la VTD au port SEM de la station cryo-transfert. Sous balayage d&#39;azote sec, utiliser la broche sur la station d&#39;ouvrir le sceau de la VTD et faites glisser le support de transfert SEM dans le Dewar de la station cryo-transfert. </li><li><ol><li> Ajouter suffisamment d&#39;azote liquide de sorte que le niveau dans la station cryo-transfert est suffisamment élevéejuste plonger l&#39;échantillon. </li><li> Utilisez le tournevis préalablement refroidie à ouvrir l&#39;un des couvercles et desserrer la vis correspondant qui maintient la grille de TEM en place. </li><li> Utilisez la pince à épiler préalablement refroidie à ramasser la grille de TEM et le placer dans le support de TEM. </li><li> Utiliser le hexring refroidi pour fixer la grille de TEM sur le support de TEM. </li><li> Fermez le volet du support de cryo-MET transfert. L&#39;étape de transfert des échantillons est cruciale et peut être entravée par de l&#39;azote gazeux en réduisant la visibilité du petit échantillon TEM. </li><li> Débrancher la station de cryo-transfert à partir du système de pompage et de le transporter à proximité de la TEM, conjointement avec le contrôleur de dispositif de chauffage du support de cryo-TEM transfert. </li><li> Démarrer la pompe turbo-moléculaire de la TEM pour pomper la ligne de support pour le sas TEM. </li><li> Réglez le stade de l&#39;échantillon de TEM à une inclinaison de -70 ° *. </li><li> Régler le temps le plus court de pompage pour le sas (30 à 60 sec), avec un seul cycle de rinçage avec un gaz d&#39;azote sec. </li&gt; </ol></li><li> Assurez-vous que le volet de protection sur le support de cryo-MET transfert est fermée. Retirez le support de TEM de la station cryo-transfert et l&#39;insérer dans le goniomètre incliné (azote liquide se renverse du Dewar porte-TEM). Le cycle de pompage commence. Une fois que le cycle est terminé, régler le goniomètre pour incliner à 0 ° et, en même temps, maintenir le support de TEM pour qu&#39;il ne tourne pas avec le goniomètre. Insérez complètement à l&#39;intérieur du TEM. Au cours de cette étape, le support de cryo-TEM transfert doit être relié à son dispositif de commande de réchauffeur pour contrôler la température. La procédure pour insérer le porte-échantillon dans le TEM peut varier entre différents modules thermoélectriques. Il est donc recommandé de contacter le fabricant de TEM pour obtenir la procédure appropriée. </li><li> Remplissez le cryo-transfert titulaire TEM Dewar. Attendez que le vide dans le TEM pour atteindre un niveau acceptable. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce protocole est une adaptation assez simple à des températures cryogéniques de la préparation de l&#39;échantillon FIB / TEM standard utilisé en sciences des matériaux à température ambiante. La méthode produit des échantillons TEM libres de déformation mécanique et marques de couteau (le principal inconvénient de microtomie), bien que rideaux peut se produire si la surface de l&#39;échantillon n&#39;est pas homogène. Ceci peut être réduit par cryo-dépôt d&#39;une couche de couverture (Pt dans ce travail a été utilisé), durcie jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit lisse et sans relief 13. Les échantillons avec des composants de dureté très différente peuvent être préparés aussi bien sans le risque qu&#39;ils se rompre sous le stress pendant la préparation. Contraintes internes peuvent encore causer la lame mince de plier ou boucle, dans ce cas, la taille de la section doit être réduite. Un inconvénient par rapport à l&#39;autre méthode est la possibilité de modifier la structure biologique due à l&#39;exposition au faisceau d&#39;ions et possible l&#39;implantation des ions dans l&#39;échantillon. Ces inconvénients se produisent également à la température ambiante pour l&#39;échantillon prépaation en science des matériaux 15. Ils peuvent être réduits en effectuant l&#39;amincissement par une étape de polissage finale à la plus basse tension d&#39;accélération pour les ions (V) 500-1000. Cette étape de polissage très doux va enlever la couche endommagée de la lamelle. En raison de la nature de la cryo-dépôt (étapes 3.5, 3.10 et 3.13), de grandes parties de l&#39;échantillon seront couverts, obstruant ainsi la vue de la surface d&#39;origine. Cela peut rendre difficile de garder une trace du retour sur investissement, à moins que plusieurs marques sont utilisées comme suggéré dans l&#39;étape 3.3. Au cours des étapes 4.5 et 4.7 les fines lamelles de risques à venir en contact avec l&#39;air. Ceci doit être évité car il provoquerait l&#39;humidité de l&#39;air pour former des cristaux de glace sur la surface de l&#39;échantillon, le cas échéant, au point d&#39;obscurcir les caractéristiques importantes. Ces étapes doivent être effectuées aussi rapidement que possible, mais dans le même temps une mauvaise manipulation lors du transfert est susceptible d&#39;entraîner la perte de l&#39;échantillon, ilauto. Il est recommandé que l&#39;utilisateur exerce ces étapes en utilisant vides TEM grilles avant une tentative sur un échantillon réel est fait. En science des matériaux, l&#39;instrument FIB est devenu la principale méthode de TEM préparation de l&#39;échantillon dans une décennie de sa commercialisation. Etant donné qu&#39;il peut être utilisé sur pratiquement n&#39;importe quel échantillon, il supprime la nécessité d&#39;adapter la technique de préparation à la nature de l&#39;échantillon. Nous croyons fermement que la même chose pourrait se produire à des températures cryogéniques, grâce à la procédure décrite ici. Son application à des échantillons plus importants est encore soumis à la capacité de cryoconservation dans un état ​​vitrifié, mais des techniques telles que le gel ou la plongée sous haute pression de congélation 3,5 peut s&#39;avérer des solutions optimales à ce problème.

Dans ce protocole, un cryo-FIB/SEM est utilisée pour produire des échantillons TEM d&#39;une région spécifique de l&#39;échantillon, préalablement identifiés avec une grande précision par analyse SEM. La microscopie électronique (balayage ou transmission) l&#39;analyse des échantillons biologiques est une technique de routine utilisées pour la recherche et le diagnostic. SEM est assez rapide et facile à utiliser et à interpréter, mais l&#39;information est obtenue uniquement à partir de la surface de l&#39;échantillon et avec une résolution de l&#39;ordre de 1,5 nm. TEM a une résolution plus élevée, mais est plus difficile à mettre en œuvre, l&#39;analyse d&#39;image est moins simple et que l&#39;information est obtenue en vrac, les échantillons doivent être éclaircis à électrons transparence (inférieure à environ 500 nm d&#39;épaisseur). Un problème supplémentaire est que les exigences de vide de ces instruments sont rarement tolérés par des échantillons contenant de l&#39;eau. Dans la plupart des cas, les échantillons biologiques doivent être fixés chimiquement (en remplaçant l&#39;eau avec, par exemple, des polymères) ou séché. Dans les deux cas, des changements importants à lala morphologie et la structure de l&#39;échantillon sont susceptibles de se produire. Cryo TEM préparation des éprouvettes hydratées induit des changements minimes de produits chimiques et produit des échantillons aussi près que possible de leur état ​​natif, en particulier si la vitrification de la glace, on obtient 6.1. Le FIB est largement utilisé pour préparer les échantillons TEM pour ses nombreux avantages 7. Pour n&#39;en nommer que quelques-uns: l&#39;utilisation d&#39;ions de haute énergie en incidence quasi-normale minimise l&#39;effet des différentiels des taux d&#39;usinage liés aux matières; la région extraite à partir de l&#39;échantillon en vrac peut être choisi avec une précision inférieure au micron; une très petite quantité de matériau est extrait. Certains développements techniques récents ont permis à l&#39;aide du FIB aussi pour TEM préparation des échantillons à des températures cryogéniques 2,8-10. Il existe plusieurs avantages par rapport au procédé traditionnel de préparation de cryo-microtomie 11,12 principalement utilisé pour les échantillons de matière molle, tels que l&#39;absence de déformation mécanique de la lamelle en tranches,l&#39;absence de marques de couteau et la possibilité de préparer des échantillons composites avec des interfaces dures / molles ou des composants.

<table><tbody><tr><td>Strata DB 235</td><td>FEI</td><td></td><td>FIB/SEM</td></tr><tr><td>Omniprobe 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Nanomanipulateur</td></tr><tr><td>Alto 2500</td><td>Gatan</td><td></td><td>Chambre de préparation cryogénique</td></tr><tr><td>Porte-cryo-modèle 626</td><td>Gatan</td><td></td><td>Transfert cryo Support TEM</td></tr><tr><td>Tecnai F30</td><td>FEI</td><td></td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Nous présentons ici un protocole utilisé pour préparer les échantillons cryo-TEM des spores d&#39;Aspergillus, mais qui peut facilement être adapté pour n&#39;importe quel nombre de micro-organismes ou des solutions. Nous faisons usage d&#39;une station de transfert cryo-construit sur ​​mesure et une chambre de préparation cryo-SEM modifié 2. Les spores sont prises à partir d&#39;une culture, plongez-gelés dans une bouillie de l&#39;azote liquide et observé dans la cryo-SEM pour sélectionner une région d&#39;intérêt. Une lame mince est ensuite extrait à l&#39;aide du FIB, fixé à une grille de TEM et ensuite dilué électrons à la transparence. La grille est transférée à un titulaire de cryo-MET et dans un TEM pour les études à haute résolution. Merci à l&#39;introduction d&#39;une pointe de nanomanipulateur refroidi et une station cryo-transfert, ce protocole est une adaptation simple à la température cryogénique de la préparation FIB régulièrement utilisé des échantillons TEM. Comme tel, il a l&#39;avantage d&#39;exiger une petite quantité de modifications à instruments, des configurations et des procédures existantes; il is facile à mettre en œuvre; elle a une large gamme d&#39;applications, en principe, les mêmes que pour la cryo-TEM préparation de l&#39;échantillon. Une limitation est qu&#39;il nécessite une manipulation habile des échantillons lors des étapes cruciales pour éviter ou minimiser les contaminations.

Dans ce travail, nous avons utilisé: un double faisceau FIB / SEM équipé d&#39;un nanomanipulateur et une chambre cryo-préparation; un TEM avec un support cryo-transfert; une station de transfert de cryo prototype. Le anticontaminator (AC) lames de la chambre cryo-préparation et la pointe de l&#39;nanomanipulateur (NM) ont été modifiés par Gatan. En ce qui concerne une chambre cryo-préparation standard, les pales AC sont plus grands pour fournir un plus grand dissipateur de chaleur pour la pointe de NM. Par ailleurs, le courant alternatif est muni d&#39;attaches pour le raccordement des tresses de Cu pour l&#39;échange de chaleur avec l&#39;extrémité de la NM. Les pneumatiques de la FIB / SEM ont été modifiés pour permettre le NM d&#39;être et de rester insérées même lorsque la chambre de l&#39;échantillon a été évacué. Il convient de noter que les paramètres utilisés dans ce travail sont les mieux adaptés pour l&#39;équipement énuméré ci-dessus; ces paramètres peuvent être ajustés nécessaire lorsque l&#39;on travaille avec d&#39;autres types d&#39;équipements. Pour travailler avec ce protocole, les précautions habituelles pour la manipulation de la cryogénie, systèmes d&#39;azote et de vide liquides devraitsuivre. La méthode a été testée sur différents types d&#39;échantillons avec de bons résultats, allant de solutions ou de matrices polymères contenant des nanoparticules, à organisme unicellulaire aux nématodes. Des exemples des différentes étapes du procédé sont illustrées sur les figures 1 à 12 sur R. niger spores colorées avec du tétroxyde d&#39;osmium et le permanganate de potassium. Les spores sont d&#39;abord imagées par MEB (figure 1) pour identifier le site d&#39;extraction. Dans ce cas, une coupe transversale selon l&#39;une quelconque des spores était suffisante, mais il est possible de positionner le retour sur investissement pour l&#39;extraction avec une précision sous-micrométrique, par exemple, découper une cellule spécifique à une distance spécifique à partir de la membrane cellulaire. Une fois que la caractéristique présentant un intérêt a été identifié, la première étape de la déposition cryo-Pt est appliqué (figure 2), afin de protéger l&#39;échantillon contre les dommages de faisceau à partir de l&#39;usinage ionique. L&#39;échantillon est incliné de 52 ° par rapport à procéder aux premières étapes of la fraise (figure 3): la pulvérisation de deux tranchées sur les deux côtés de la lamelle. L&#39;échantillon est ensuite incliné vers l&#39;arrière et en outre broyé pour ne laisser que deux petits ponts qui la relient à la masse (figure 4). Le nanomanipulateur refroidi est mis en contact avec la lamelle (Figure 5) et un autre dépôt de cryo-Pt les soudures ensemble (figure 6). Les petits ponts de liaison sont ensuite broyés à une distance de et le MN se déplace de la lamelle à proximité de la zone de fixation de la grille de TEM (figure 7), où il est soudé avec un cryo-dépôt final de Pt (figure 8). Le NM est ensuite séparé de la lamelle (Figure 9), qui est amincie vers le bas de la transparence d&#39;électrons avec le faisceau d&#39;ions (Figure 10 et 11). La lamelle est finalement transféré à la TEM (Figure 12) où l&#39;imagerie haute résolution, la spectroscopie, la tomographie et d&#39;autres techniques can être employé. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;image Cryo-SEM de spores de A. Niger, avant le dépôt Pt. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> Figure 2. La même zone de la figure 1 après le dépôt Pt mais avant le durcissement. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> Figure 3. L&#39;image Cryo-SEM de la même zone sur la figure 2, inclinée de 52 °, après le dépôt de Pt et le durcissement, avec la tranchée en cours de fraisage(Voir étape 3.7). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;lamelle, prêt pour l&#39;ascenseur-out. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;extrémité de nanomanipulateur froid est en contact avec la lamelle. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> Figure 6. Un deuxième Pt cryo-dépôt est utilisé pour souder ensemble les nanomanipulateur et la lamelle. <ialt = mg &quot;Figure 7&quot; fo: contenu width = &quot;5 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; /&gt; Figure 7. Nanomanipulateur Le froid est utilisé pour transférer la lamelle à la zone de fixation de la grille de TEM. <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> Figure 8. Cryo-dépôt est utilisé une fois de plus pour fixer la lamelle à la grille de TEM. <img alt="Figure 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> Figure 9. La lamelle est coupé libre de la nanomanipulateur et il est maintenant prêt pour stockage ou l&#39;amincissement à électrons transparence. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> Figure 10. Une étape intermédiaire de l&#39;amincissement, avec quelques spores visibles en coupe transversale. <img alt="Figure 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> Figure 11 images Cryo-SEM de l&#39;échantillon après l&#39;éclaircie finale.; la plupart des autres spores ont dû être blanchi de suite parce que la lamelle avait commencé à s&#39;enrouler. <img alt="Figure 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> Figure 12. Composite image cryo-MET de la lamelle. Une partie de la souche Al a été inclusdans la lamelle (flèche noire).

Cryo Electron Microscope, soit à balayage (MEB) ou de transmission (TEM), sont largement utilisés pour la caractérisation des échantillons biologiques ou d&#39;autres matériaux avec une forte teneur en eau 1. Une SEM / Focused Ion Beam (FIB) est utilisé pour identifier les caractéristiques d&#39;intérêt dans des échantillons et extraire une lame mince, électron-transparent pour le transfert à un cryo-MET.

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer un échantillon pour la microscopie électronique cryogénique en extrayant une lamelle par faisceau d'ions focalisés à partir d'un échantillon massif congelé cryogéniquement. Cela est réalisé en plongeant d'abord l'échantillon dans l'azote liquide pour le congeler, puis en le montant à l'intérieur du MEB cryogénique à faisceau d'ions focalisés. La deuxième étape consiste à découper une fine lamelle à l'aide du faisceau d'ions et à la transférer sur une grille de MET à l'aide d'un nanomanipulateur refroidi.Ensuite, la grille de MET est transférée du porte-objet de MEB au porte-objet de MET dans une station de transfert. La dernière étape consiste à transférer le porte-objet de MET vers le MET cryogénique pour une analyse supplémentaire. En fin de compte, le MET cryogénique est utilisé pour obtenir des images haute résolution, des tomos de Grahams ou des cartographies par rayons X de la lamelle extraite.Cette technique nous permettra d'analyser la matière molle avec une résolution maximale au microscope électronique en transmission, en sélectionnant au préalable l'emplacement de l'analyse à l'aide d'autres microscopies, telles que la microscopie optique ou la microscopie électronique à balayage. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la cryo-microtomie Mac, est que les artefacts de préparation, tels que la compression et la déformation de l'échantillon, sont évités. Commencez par monter deux grilles TEM destinées aux échantillons en faisceau d'ions focalisés.Sur le porte-échantillon de transfert MEB, fixez les grilles en resserrant les vis correspondantes à l’aide d’un tournevis et fermez les obturateurs. Montez une cheville d’échantillon adaptée au spécimen et ajoutez une portion du spécimen. Par exemple, utilisez une pipette pour déposer des gouttelettes sur une cheville plate. Ensuite, fixez le porte-échantillon de transfert MEB sur le dispositif de transfert sous vide ou VTD.Après avoir ajouté de l'azote liquide dans la station de formation de pâte et effectué la mise sous vide, ouvrez la station et plongez le porte-échantillon de MEB pour congeler rapidement. Effectuez à nouveau la mise sous vide jusqu'à ce que l'ébullition cesse et que la pâte se reforme. Ensuite, retirez le porte-échantillon de MEB dans la chambre à vide du VTD et scellez-le. Relâchez la pression dans la station de formation de pâte et dans la chambre de préparation cryogénique. Ouvrez le sas externe à l'air.Ensuite, aligner le joint du VTD avec l'écoutille de la chambre de préparation cryogénique et faire le vide. Une fois qu'un bon niveau de vide est atteint, actionner la goupille de l'écoutille pour ouvrir le joint du VTD et de l'écoutille extérieure. Puis insérer le porte-échantillon de transfert pour MEB.Ensuite, utilisez un couteau froid pour ouvrir les couvercles de protection des emplacements de la grille MET. Éteignez la haute tension du MEB à faisceau d'ions focalisés et ouvrez la sas interne. Puis, utilisez le VTD pour transférer le porte-échantillon du MEB dans la chambre d'échantillonnage.Une fois que le porte-échantillon MEB est placé sur le plateau froid, désengagez le DTV en poussant et en tournant. Rétractez complètement la tige du DTV dans la chambre à vide du DTV et fermez l'éclusse interne, l'éclusse externe et le joint du DTV. À ce stade, chauffez le gaz précurseur à 24 à 26 degrés Celsius et positionnez l'embout du système d'injection de gaz (SIG) à une hauteur d'environ un millimètre au-dessus de la surface de l'échantillon.Lors de l'imagerie avec le faisceau d'électrons, ouvrez la vanne à gaz pendant quelques secondes. Ensuite, durcissez le dépôt au-dessus de la région d'intérêt, ou ROI, en utilisant un faisceau d'ions de 1000 picoampères à faible grossissement. Après le durcissement, inclinez l'échantillon à 52 degrés afin que la surface soit perpendiculaire au faisceau d'ions.Broyer. Deux tranchées terroristes. De chaque côté de la zone d’intérêt, ramener l’échantillon à zéro degré et utiliser le faisceau d’ions pour découper les côtés et la face inférieure de la lamelle, en veillant à ce que les marques de coupe traversent entièrement la lamelle.Une fois que l'aiguille GIS a été insérée, manoeuvrez le nano-manipulateur jusqu'à ce que sa pointe entre en contact physique avec la lamelle, de préférence sur le côté. Ouvrez la vanne GIS pendant quelques secondes et surveillez le dépôt cryogénique par imagerie continue au faisceau d'électrons. Lorsqu'une couche supplémentaire de platine d'un à deux micromètres a été déposée par cryodépôt, fermez la vanne, puis durcissez le platine uniquement sur quelques micromètres autour du point où le nano-manipulateur est en contact avec la lamelle.Ensuite, utilisez un faisceau d'ions à fort courant pour détacher librement la lamelle. Manipulez soigneusement le nano-manipulateur afin d'extraire la lamelle des tranchées et déplacez-la à au moins 500 micromètres au-dessus de la surface de l'échantillon. Après avoir retiré l'aiguille, abaissez le plateau d'échantillonnage de quelques millimètres et déplacez-le jusqu'à ce qu'une des grilles TEM soit en vue.Déplacez la zone d'attachement sur la grille en position de travail et insérez l'aiguille GIS. Ensuite, manoeuvrez soigneusement le nano-manipulateur afin de mettre la lamelle fixée en contact physique avec la zone d'attachement sur la grille de MET, ouvrez la vanne de gaz pendant quelques secondes et déposez par cryo-dépôt une couche supplémentaire de platine d'un à deux micromètres, en solidifiant le platine uniquement sur quelques micromètres autour du point de contact entre la lamelle et la grille de MET. Puis, utilisez un faisceau d'ions à courant élevé pour découper la lamelle et la libérer du nano-manipulateur.Inclinez l'échantillon à 52 degrés et utilisez le faisceau d'ions pour l'aminir jusqu'à la transparence électronique. Après avoir purgé la station de transfert cryogénique avec du gaz d'azote sec, insérez le porte-échantillon cryogénique pour MET dans la fente appropriée de la station de transfert cryogénique et remplissez-la d'azote liquide. Ensuite, immergez un tournevis, l'outil de serrage de l'échantillon pour MET et une pince dans un récipient cryogénique rempli d'azote liquide afin de refroidir leurs extrémités à la température souhaitée.Une fois le VTD aligné sur l'écoutille extérieure, amenez le plateau froid à la hauteur de transfert de 16 millimètres. Après avoir coupé la haute tension, ouvrez le joint du VTD, l'écoutille extérieure et l'écoutille intérieure. Utilisez ensuite la tige du VTD pour verrouiller le support de transfert du MEB en poussant et en tournant dans le sens horaire.À ce stade, rétractez le porte-échantillon de microscopie électronique à balayage (MEB) dans la chambre de préparation cryogénique. Utilisez le couteau froid pour fermer les couvercles de protection des grilles de microscopie électronique en transmission (MET). Ensuite, utilisez la tige VTD pour déplacer l'échantillon dans la chambre à vide du dispositif VTD, puis fermez et scellez l'écoutille.Ensuite, dépresurisez l'écoutille extérieure et détachez le VTD. Alignez le VTD sur le port SEM de la station de transfert cryogénique. Tout en rinçant avec de l'azote sec, utilisez la broche de la station pour ouvrir le joint du VTD et faites glisser le support de transfert SEM dans l'ouverture de la station de transfert cryogénique.À l’aide du tournevis refroidi, ouvrez l’un des couvercles et desserrez la vis correspondante, en maintenant la grille de MET en place. Ensuite, prenez la grille de MET et placez-la dans le porte-grille de MET à l’aide de la pince refroidie. Puis, fixez solidement la grille de MET sur le porte-grille de MET.À l'aide de l'anneau hexagonal refroidi, fermez l'obturateur du porte-échantillon cryo-transfert pour MET et déconnectez la station de transfert cryogénique du système de pompage. Transportez la station et le contrôleur de chauffage du porte-échantillon de la MET près de la MET, puis reconnectez-les. Réglez l'inclinaison du porte-échantillon de la MET à 70 degrés négatifs.Ensuite, réglez le temps de pompage le plus court pour l'éclusage avec un seul cycle de purge au gaz d'azote sec. Retirez le porte-objet de la station de transfert cryogénique et insérez-le dans le premier étage du goniomètre incliné, ce qui lancera le cycle de pompage. Une fois le cycle terminé, réglez le goniomètre pour qu'il revienne à zéro degré tout en maintenant le porte-objet de microscope électronique afin qu'il ne tourne pas avec le goniomètre.Insérez ensuite le porte-objet entièrement à travers le goniomètre à l'intérieur du MET. Enfin, remplissez à nouveau le chargeur du porte-objet de transfert cryo-MET avec de l'azote liquide. Dans cette méthode, les spores d'Aspergillus niger sont d'abord observées par MEB afin d'identifier le site d'extraction.Une coupe transversale de n'importe quelle spore est suffisante, mais il est possible de positionner la région d'intérêt (ROI) pour l'extraction avec une précision submicrométrique afin de sectionner une cellule spécifique à une distance précise de la membrane cellulaire. Une fois la structure d'intérêt identifiée, la première étape du dépôt cryogénique est mise en œuvre. Pour protéger l'échantillon contre les dommages causés par le faisceau pendant le meulage ionique, l'échantillon est incliné à 52 degrés, puis deux tranchées sont pulvérisées de chaque côté de la mella. L'échantillon est ensuite ramené à sa position initiale et davantage usiné, ne laissant que deux petits ponts le reliant au volume principal.Le nano-manipulateur refroidi est mis en contact avec la lamelle, et un autre dépôt cryogénique de platine les soude ensemble. Les petits ponts de connexion sont usinés puis retirés, et le nano-manipulateur déplace la lamelle près de la zone de fixation de qualité TEM, où elle est soudée à l’aide d’un dépôt cryogénique final de platine. Le nano-manipulateur est ensuite séparé de la lamelle, qui est amincie jusqu’à devenir transparente aux électrons.Avec le faisceau d'ions, la lamelle est transférée au MET, où des techniques telles que l'imagerie à haute résolution, la spectroscopie, la tomographie et d'autres peuvent être utilisées. Cette méthode contribuera à la compréhension des interfaces entre tissus mous cardiaques et matériaux dans des systèmes tels que les sondes neuronales ou les implants osseux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des échantillons de TM cryogénique sans artefacts, et qui peuvent être extraits d'une région spécifique d'un échantillon biologique avec une précision submicrométrique.

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Flux de travail à l’aide d’un microscope cryogénique à fluorescence coïncidente, à faisceau d’électrons et d’ions pour le broyage ciblé de cellules

Apprenez la préparation d'échantillons pour cryo-microscopie électronique par faisceau d'ions focalisés. Cette méthode permet d'extraire des lamelles minces de matériaux biologiques congelés pour une imagerie haute résolution sans artéfacts.

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d'un faisceau d'ions focalisés

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