Name: Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Découvrez une méthode in vitro pour observer les interactions entre cellules tumorales circulantes du cancer de la prostate et cellules endothéliales humaines via la microscopie vidéo sous flux physiologique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par un financement du ministère de la Défense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 de l&#39;Institut national du cancer, et le Fonds de recherche Robert McCooey génito-urinaire oncologie. Nous tenons à remercier le Dr Annarita Lorenzo (Département de pathologie) pour fournir des anticorps VE-cadhérine, et le Dr Marco Seandel (département de chirurgie) pour fournir HUVEC.

1. HUVEC en culture sur microplaques pour Interactions observation CTC-endothéliales <ol><li> Sous le capot de la culture de tissus, d&#39;abord rincer la microplaque, largeur de canal de 1 mm avec du PBS. Manteau doucement la microplaque avec 200 pi de 50 pg / ml de fibronectine (dissous dans du PBS) en utilisant une seringue de 1 ml de type Luer-lock. </li><li> Couvrir la microplaque avec le couvercle et garder à l&#39;intérieur de la culture de tissus capot pendant 30 min. Distribution lente du liquide dans la microplaque empêche la formation de bulles dans le canal. </li><li> Perfuser 200 ul de (37 ° C) Agent chaud HUVEC de croissance (milieu M199, 1 M de HEPES, 20% de FBS, 5 mg / ml d&#39;héparine, 100 ug / ml de facteur de croissance des cellules endothéliales, et la L-glutamine) au-dessus de la microplaque et incuber pendant 20 min à température ambiante. Au cours de la perfusion, de préparer la suspension de cellules HUVEC. </li><li> Rincer HUVEC avec du PBS et ajouter 0,05% de trypsine-EDTA pendant 1-2 min à température ambiante. Centrifugeuse HUVEC dans 2 ml de milieu de croissance à 180 xg pendant 5 min. </li><li> Mesurer la concentration des cellules en utilisant un Neubauer hémocytomètre et préparer 10 7 cellules HUVEC cellules/100 ul de milieu de croissance. Puis, enlevez délicatement le milieu de l&#39;entrée de la microplaque à l&#39;aide d&#39;une pipette 200 pl. </li><li> Apportez la microplaque au niveau des yeux et en utilisant un 1 ml luer-lock seringue, perfuser doucement 200 pi de concentration prêt de HUVEC dans le canal. La prudence est requise à cette étape pour éviter la formation de bulles. Si des bulles apparaissent, garder la perfusion pendant une durée légèrement plus longue jusqu&#39;à ce que les bulles pénètrent dans le canal de sortie. </li><li> Mettre un volume égal (~ 80 pi) de support HUVEC dans l&#39;entrée et à la sortie de la microplaque. Cela empêche le flux de cellules dans les deux sens. </li><li> Recouvrir la lame et le maintenir dans l&#39;incubateur (37 ° C) pendant 1,5 heure. </li></ol> 2. Préparation des flux Assemblée Chambre pour une nuit HUVEC Culture sur un Microslide <ol><li> Placez une seringue stérile de 20 ml, connecteurs Luer mâles et femelles, des tubes, et une pompe à seringue dans l&#39;incubateur pendant 15 kmn. </li><li> Pour le volume mort minimal, utiliser le tuyau d&#39;un diamètre intérieur de 0,04 pouces. Plus petit diamètre du tube empêche la formation de bulles. </li><li> Remplir la seringue de 20 ml au chaud (37 ° C) des cellules HUVEC médias (12 ml). Fixez le tube avec les connecteurs sur la seringue. Retirer les bulles. Connectez cette assemblée à la microplaque. </li><li> Remplir complètement l&#39;entrée de la microplaque avec les médias HUVEC. Amener le rempli de 20 ml seringue fixée au connecteur côté de la microplaque. Attacher doucement le connecteur de la microplaque. </li><li> Apportez la mise en place dans l&#39;incubateur et le connecter à la pompe seringue, fixé à 10 taux de cisaillement pi / min. Laisser les cellules O / N dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Le jour suivant, démonter la mise en place en retirant le connecteur fixé à l&#39;entrée de la microplaque. </li><li> Pour réguler positivement l&#39;expression E-sélectine sur les CE, préparer le milieu de croissance frais contenant de l&#39;IL-1β à 10 ng / ml dans 4 ml de milieu. Aspirer les médias dans une seringue de 10 ml. Retirer til médias de l&#39;entrée de la microplaque et connecter la seringue à la diapositive. </li><li> Réglez la pompe seringue à 10 pi / min vitesse de cisaillement pendant 4 heures dans l&#39;incubateur. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;anti-PSMA (J591-488) a marqué des cellules de cancer de la prostate <ol><li> Au cours de l&#39;IL-1β incubation de HUVEC, préparer anti-PSMA J591-Alexa488 a marqué des cellules APC. Ajouter 0,05% de trypsine-EDTA à des cellules MDA pendant 1 min. Ne pas exposer les cellules à la trypsine pour des temps plus longs car il peut affecter les glycopeptides présents à la surface cellulaire. Enzyme réactif de dissociation cellulaire libre peut également être utilisé à la place de la trypsine. Centrifuger à 200 g pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension cellulaire MDA culot dans 1 ml de H / H tampon (% du sel de Hanks équilibrée HSA/10 mM HEPES / 1 mM de CaCl2). Ajouter anticorps J591-Alexa488 anti-PSMA à 20 pg / ml pendant 30 min à température ambiante dans un endroit sombre. Remettre en suspension les cellules pendant l&#39;incubation. </li><li> Après 30 minutes, centrifuger la solution de cellules à 800 xg pendant 5 min. Aspitaux et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon H / H. Compter les cellules MDA étiquetés et porter la concentration finale de 1x10 6 cellules / ml. Remplir une seringue de 5 ml avec J591-488 cellules MDA étiquetés et éliminer les bulles. </li></ol> 4. Préparation des anti-PSMA (J591-488) Étiqueté CTC enrichi de CaP patients <ol><li> Recueillir 7,5 ml de sang de patients atteints de cancer de la prostate dans un tube à bouchon bleu (contenant du citrate de sodium). Diluer doucement 1h01 de sang dans 0,1% de BSA / EDTA 1 mM / PBS. </li><li> Ajouter 5,3 ml de Ficoll-Paque Plus dans un tube conique de 50 ml. Couche diluée sang sur le dessus du Ficoll-Paque. Centrifuger à 400 g pendant 30 min. </li><li> Pré-manteau tous les tubes ou embouts venant en contact avec les CTC avec 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM de CaCl 2/4 mM de MgCl 2 (R / S tampon) pour empêcher une liaison non spécifique des CTC aux surfaces. Maintenir 4 ° C la température des médias et des tampons à venir en contact avec les CTC. </li><li> Recueillir la cellule périphérique mononucléées du sang (PBMC) de fractionCTC contenant de l&#39;interface dans un autre tube conique de 50 ml contenant 30 ml de tampon R / S. Centrifuger à 400 g pendant 8 min. </li><li> Reprendre le culot et laver de nouveau dans un tampon R / S à 400 g pendant 8 min. Après centrifugation, remettre le culot dans un tampon H / H. Ajouter anti-PSMA J591-488 anticorps à 20 pg / ml pendant 30 min à température ambiante dans un endroit sombre. </li><li> Après 30 minutes, centrifuger les PBMC contenant J591-488 CTC marqués à 800 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans un tampon H / H. Remplir une seringue de 1 ml (pré-revêtu avec du tampon R / S) avec l&#39;échantillon. </li></ol> 5. Préparation du microscope, seringue et flux Assemblée Chambre <ol><li> Allumez le microscope inversé et mettre l&#39;éclairage Kohler à 10X objectif. Apportez la pompe de la seringue au même niveau que la scène du microscope de l&#39;échantillon et le fixer à 1 dyn / cm 2 cisaillement (~ 10 pi / min). </li><li> Ouvrez le logiciel Zeiss Axiovision. Sélectionnez l&#39;objectif sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur. Créer un nouveaudossier sous l&#39;option des outils dans le logiciel. </li><li> Ouvrez l&#39;option expériences intelligentes en Axiovision et ajuster les paramètres pour enregistrer de courtes vidéos de 30 sec pour 30 min. </li><li> Pour la vidéo en direct fluorescent, définissez les options-12 images ms exposition, 2 x 2 bin 5 Gain. Ces paramètres permettent à la réalisation de vidéos à proximité de la fréquence d&#39;images vidéo (~ 23 images par seconde) avec l&#39;appareil photo Zeiss MRM. </li><li> Pour visualiser toute la largeur du canal d&#39;écoulement à 10 X objectif sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur, utilisez un adaptateur de monture C (0,63 Interface xf/60 mm). </li><li> Allumez la lampe à mercure. </li><li> Placer la seringue et le connecteur contenant les cellules sur la pompe à seringue. </li><li> Apportez IL-1β stimulée HUVECs de l&#39;incubateur. Branchez le connecteur sur le canal d&#39;entrée rempli de la microplaque contenant HUVEC. </li><li> Connecter le canal de sortie avec le connecteur fixé à la tubulure. Mettre le tube dans une boîte de 15 ml ou tube conique pour recueillir le débit à travers. </li><li> Démarrez le infusià travers la microplaque à 10 pi / min. Observer les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules MDA marqués ou étiquetés CTC provenant de patients sous filtre 488 nm sur le microscope à épifluorescence. </li><li> Commencer à enregistrer l&#39;expérience que de courtes vidéos de 30 sec. Lors de l&#39;analyse de lecture, mesurer la vitesse de roulement. La vitesse de laminage est mesurée en divisant la distance parcourue par les cellules au cours du temps. </li></ol> 6. Immunocoloration du Microslide <ol><li> Retirez le support de l&#39;entrée et la sortie de la microplaque après perfusion, les cellules MDA sur IL-1β stimulée HUVEC pendant 10 min. </li><li> En utilisant une pointe de 200 ul, mettre au chaud (37 ° C) du PBS contenant du calcium et du magnésium dans l&#39;entrée de la microplaque pendant 5 min. Inclinez la microplaque à l&#39;aide de son couvercle comme un accessoire sur le banc. Gardez la microplaque dans une position inclinée pour tous les incubations pendant immunologique. </li><li> Fixer HUVEC par perfusion chaud 2% de formaldéhyde dans l&#39;entrée </li><li&gt; incuber pendant 20 min à température ambiante. Rincer deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Ajouter triton X-100 (0,1%) dans 5% de BSA dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Rincer deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Bloquer avec 5% de BSA dans du PBS pendant 30 min. </li><li> Incuber avec la chèvre d&#39;anticorps primaire anti-VE-cadhérine (1:100) dans 2,5% de BSA O / N à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Ajouter âne secondaire anti-chèvre 647 anticorps pendant 45 min. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Incuber à température ambiante avec l&#39;anticorps humanisé conjugué J591-Alexa488 pendant 1 heure. </li><li> Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Ajouter DAPI pendant 5 min. Laver avec de l&#39;eau distillée pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter PBS (ou MOWIOL pour le stockage à long terme). Visualisez la microplaque sous le microscope confocal. </li></ol>

<ol><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
<li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li>
<li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+in+transit%3A+the+vascular+interactions+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li>
<li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+%28PSMA%29+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li>
<li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--%2Frag2--+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li>
<li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li>
<li>Remuzzi, A., Giavazzi, R. Adhesion of tumor cells under flow. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRemuzzi%2C+A+%22Adhesion+Protein+Protocols%22">Adhesion Protein Protocols</a>. Dejana, E., Corada, M. 96, Humana Press. 153-157 (1999).</li>
<li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li>
<li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li>
<li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li>
</ol>

Dr Bander est l&#39;inventeur sur les brevets qui sont affectés à la Cornell Research Foundation (&quot;CRF&quot;) pour l&#39;anticorps J591 utilisé dans cet article. Dr Bander est consultant et possède des actions dans BZL biologiques, la société à laquelle les brevets ont été autorisés par le CRF pour la recherche et le développement.

En raison du faible nombre de CTC parmi les cellules sanguines, il est difficile d&#39;isoler les CTC comme une population pure de cellules. Afin d&#39;étudier les interactions CTC / CE, la population rare et impure de CTC pose deux défis majeurs: a) Identification des CTC entre les cellules du sang; b) Observation des interactions CTC / CE. Pour remédier à la première limitation d&#39;identifier les CTC de la prostate chez les cellules du sang, nous avons profité...

Métastase est un processus complexe en plusieurs étapes qui reste mal compris. L&#39;axe de ligand E-selectin/selectin a été montré pour jouer un rôle important dans la métastase de la tumeur en favorisant les interactions adhésives primaires entre l&#39;endothélium vasculaire et les cellules cancéreuses 1,2. Endothéliale (E)-sélectine est une protéine transmembranaire exprimée par les cellules endothéliales activées, tandis que les différents ligand (s) E-sélectine est exprimée par les cellules tumorales 3. De nombreuses approches in vitro ont été utilisés avec succès pour modéliser les interactions de ligands E-selectin/selectin entre les cellules tumorales et les cellules endotheliales (EC) 1. Pour étudier ces interactions, les différents systèmes de chambres d&#39;écoulement sont utilisées pour simuler le système vasculaire sanguin. Parmi les ensembles de la chambre d&#39;écoulement, la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles (FPNC), en liaison avec les EC est couramment utilisé comme modèle in vitro simulant vivo dans des conditions de contrainte de cisaillement. Dans ceProcédé, les EC sont cultivées sur une boîte de 35 mm, et après la réalisation d&#39;une monocouche, les EC sont fixés à la FPNC et expériences basées contrainte de cisaillement sont effectuées. Cependant, PPFC et autres systèmes actuels présentent de nombreuses limites à l&#39;étude des interactions adhésives entre les cellules tumorales circulantes (CTC) provenant de patients et EC, principalement parce que les CTC sont une population rare de cellules, remise de la tumeur primaire, circulant parmi des millions de cellules sanguines (1 CTC par 10 9 cellules sanguines) 4. Ainsi, contrairement à l&#39;offre illimitée de lignées cellulaires en culture, un faible nombre de CTC conduisent à très peu et rares interactions CTC / CE, nécessitant la bonne largeur de canal d&#39;écoulement d&#39;enregistrer les interactions pour l&#39;analyse de la lecture. En outre, depuis patients CTC dérivés sont une population impur, donc un marqueur d&#39;identification est nécessaire pour suivre les CTC en particulier. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une nouvelle méthode pour identifier le cancer de la prostate (CaP) CTCs en profitant du fait que la quasi-totalité de ces CTC expriment l&#39;antigène de membrane spécifique de la prostate (PSMA) sur leur surface cellulaire 5,6. Dans ce rapport, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cancer de la prostate, MDA PCa2b (MDA), afin de démontrer l&#39;utilité potentielle de notre nouveau système à étudier la prostate interactions CCT avec les CE, finalement à comprendre le mécanisme de métastases. Notre méthodologie peut être appliquée à diverses expériences de cisaillement en fonction de simulation dans le système vasculaire in vivo 7-9. Outre l&#39;examen des interactions PCa CTC / CE, le système de chambre de passage du courant pourrait être facilement adapté pour l&#39;analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique ou des interactions des cellules tumorales avec les EC. La facilité de démontage et remontage de la chambre d&#39;écoulement, une microplaque III (0,1) (ci-après dénommé microlame), permet la culture EC sous perfusion et stimulant EC avec différentes cytokines pour induire protein expression. En outre, les EC cultivées, des protéines recombinantes telles que E-et P-sélectine peuvent être revêtus sur la microplaque et les interactions avec les cellules tumorales peut être observé dans des conditions d&#39;écoulement laminaire 10.

<table><tbody><tr><td>Microslide</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Tube en plastique</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur Luer mâle</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur Luer femelle</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer-lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 medium</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Endothélial Mitogen</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Département de chirurgie</td><td></td><td>fourni par Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x objectif</td><td>Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire libre enzymatique</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

dans la méthode in vitro pour observer les interactions e-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

La métastase est un processus dans lequel les cellules tumorales perdent de la tumeur primaire intravasate vasculaire sanguin et du système lymphatique, de ce fait, l&#39;accès à s&#39;extravaser et former un créneau secondaire. L&#39;extravasation de cellules tumorales à partir du système vasculaire sanguin peut être étudiée en utilisant des cellules endotheliales (EC) et des cellules tumorales obtenues à partir de différentes lignées cellulaires. Les premières études ont été menées dans des conditions statiques, mais il a été bien documenté que les CE se comporter différemment dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques. Par conséquent, les différents ensembles de chambre de débit sont actuellement utilisés pour l&#39;étude des interactions de cellules cancéreuses avec les EC. Ensembles de chambre de flux actuels offrent des résultats reproductibles en utilisant soit des lignées cellulaires différentes ou de fluide à différentes conditions de stress de cisaillement. Toutefois, à observer et à étudier les interactions avec les cellules rares telles que des cellules tumorales circulantes (CTC), certaines modifications doivent être apportées à l&#39;ensemble de la chambre de flux classique. CTCsont une population de cellules rares parmi des millions de cellules sanguines. Par conséquent, il est difficile d&#39;obtenir une population pure de CTC. Contamination des CTC avec différents types de cellules qui se trouvent normalement dans la circulation est inévitable en utilisant enrichissement présents ou techniques d&#39;épuisement. Dans le présent rapport, nous décrivons une méthode unique de cellules de cancer de la prostate par fluorescence de l&#39;étiquette de circulation et d&#39;étudier leurs interactions avec les CE dans un système de chambre de circulation auto-assemblée. Cette technique peut être en outre appliqué à observer les interactions entre les CTC de la prostate et de toute protéine d&#39;intérêt.

La figure 1 montre une culture O / N d&#39;une monocouche de EC sur la microplaque. Les battitures sur la figure 1A montre que 100% de la microplaque est visible à l&#39;aide objectif 5X tandis que 70% est visible à l&#39;aide d&#39;un objectif 10X (figure 1B). Pour les interactions à médiation par la E-sélectine, les cellules de roulement sur les bords ne sont pas considérés ce qui rend plus de 70% de la microplaque disponible pour l&#39;enregistrement vidéo et analyse...

Notre rapport décrit une méthode unique pour visualiser et analyser les interactions CTC / CE dans le cancer de la prostate dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques.

Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les interactions entre les cellules rares de cancer de la prostate et les cellules endothéliales exprimant la sélectine E à l'aide d'un dispositif de flux microscopique. Cela est réalisé en premier lieu en recouvrant une lame microscopique de fibronectine. La deuxième étape consiste à cultiver des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ou VE dans un système de flux dynamique sur une lame microscopique présentant une faible largeur de canal. Ensuite, les cellules de cancer de la prostate sont marquées avec un anticorps monoclonal humanisé anti-antigène membranaire spécifique de la prostate, ou PSMA, qui est internalisé. La dernière étape consiste à perfuser les cellules de cancer de la prostate marquées avec l'anti-PSMA sur les VE exprimant l'E-sélectine. Enfin, une microscopie vidéo est utilisée pour montrer les interactions entre les cellules de cancer de la prostate et les cellules endothéliales.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la chambre d'écoulement à plaques parallèles et autres assemblages dynamiques, est qu'elle permet d'examiner les interactions entre des cellules rares de cancer de la prostate, comme les cellules tumorales circulantes, et des cellules endothéliales cultivées dans un système d'écoulement dynamique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la métastase, telles que : comment les cellules tumorales de la prostate métastasent-elles à travers le système vasculaire sanguin ? Utilisent-elles le même mécanisme que celui employé par les leucocytes lors de leur extravasation ?En général, les personnes novices dans cette technique éprouveront des difficultés, car elle implique la culture d'une monocouche de cellules endothéliales dans un canal étroit sous perfusion sous hotte de culture tissulaire. Commencez par rincer la micro-lame avec du chlorure de sodium tamponné au phosphate ou PBS. Ensuite, recouvrez délicatement la micro-lame de 200 microlitres de fibronectine à 50 microgrammes par millilitre à l'aide d'une seringue munie d'un embout Luer lock d'un millilitre.Couvrez la lame microscopique avec le couvercle et laissez-la à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire pendant 30 minutes. Ensuite, perfusez 200 microlitres de milieu de croissance qve tiède sur la lame microscopique et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Un dispensage lent du liquide sur la lame microscopique empêche la formation de bulles dans le canal.Pendant la perfusion, préparez la suspension de vex en rinçant les vex avec du PBS et en ajoutant 0,1 % de collagénase plus 0,05 % d'EDTA dans du PBS pendant une à deux minutes à température ambiante. Centrifugez les hve dans deux millilitres de milieu de croissance à 180 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, mesurez la concentration cellulaire à l’aide d’un cytomètre hématique et préparez 10 millions de cellules par 100 microlitres de milieu de croissance.Ensuite, retirez soigneusement le milieu de l'entrée de la lame microscopique. À l'aide d'une pipette de 200 microlitres, placez la lame microscopique à hauteur des yeux et, à l'aide d'une seringue munie d'un embout de verrouillage de un millilitre, perfusez doucement 200 microlitres de la concentration préparée de vex dans le canal. Une grande précaution est nécessaire à cette étape pour éviter la formation de bulles ; si des bulles apparaissent, continuez la perfusion pendant un temps légèrement plus long jusqu'à ce que les bulles pénètrent dans le canal de sortie.Ensuite, prélevez à la pipette un volume égal d'environ 80 microlitres de milieu VE et ajoutez-le dans l'entrée et la sortie de la lame microscopique. Cette étape empêche l'écoulement des cellules dans l'une ou l'autre direction. Couvrez la lame et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure.Pour commencer l'assemblage de la chambre d'écoulement, placez une seringue stérile de 20 millilitres, des raccords femelle et mâle de type Luer, une pompe à seringue et un tube dans l'incubateur pendant 15 minutes afin de minimiser le volume mort. Utilisez un tube d'un diamètre intérieur de 0,04 pouce. Un diamètre de tube plus petit empêche la formation de bulles.Ensuite, remplir la seringue de 20 millilitres avec 12 millilitres de milieu VE tiède. Éliminer complètement la bulle de la seringue. Remplir l'entrée de la micro-lame avec du milieu VE.Connecter cet ensemble à la lamelle microscopique. Fixer délicatement le raccord de sortie à la lamelle microscopique. Placer le dispositif dans l'incubateur et le relier à la pompe à seringue.Ensuite, régler la pompe sur un débit de cisaillement de 10 microlitres par minute avant de laisser les cellules toute la nuit dans l'incubateur à 37 degrés Celsius. Le lendemain, démonter le dispositif en retirant le connecteur fixé à l'entrée de la lamelle microscopique. Puis retirer le connecteur de sortie deux à deux pour augmenter l'expression de l'E-sélectine sur les cellules endothéliales.Préparez un milieu de croissance frais contenant l'interleukine une bêta. Aspirez le milieu dans une seringue de 10 millilitres. Éliminez le milieu résiduel de l'entrée de la lamelle, puis ajoutez du milieu frais en remplissant complètement l'entrée.Connectez la seringue à la lamelle. Réglez la pompe à seringue à un débit de cisaillement de 10 microlitres par minute pendant quatre heures dans l'incubateur pendant l'incubation avec l'interleukine une bêta du vex, préparez des cellules de cancer de la prostate marquées avec l'anticorps anti-PSMA Alexa 488. Ajoutez d'abord 0,05 % de trypsine EDTA aux cellules de cancer de la prostate MDA pendant une minute.Ne pas exposer les cellules à la trypsine pendant des durées plus longues, car cela peut affecter les glycopeptides présents à la surface cellulaire. Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, resuspendre le palais cellulaire MDA dans un millilitre de tampon de Hank et ajouter l'anticorps anti-PSMA ; incuber pendant 30 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière, en resuspendant régulièrement les cellules pendant l'incubation.Après 30 minutes, centrifuger la solution cellulaire à 800 fois G pendant cinq minutes. Aspirer et resuspendre le culot dans un millilitre de tampon de Hank. Compter les cellules MDA marquées et ajuster la concentration finale à un million de cellules par millilitre.Remplissez une seringue de cinq millilitres avec les cellules MDA marquées et retirez les bulles. Allumez le microscope inversé et réglez l'éclairage en mode curler sur l'objectif 10 x. Placez la pompe à seringue au même niveau que le plateau d'échantillonnage du microscope et réglez-la sur un dime par centimètre carré de contrainte de cisaillement.Ensuite, ouvrez le logiciel Zeiss Axio Vision. Sélectionnez l'objectif sur l'écran de l'ordinateur. Créez un nouveau dossier dans l'option outils du logiciel.Ouvrez l'option d'expériences intelligentes dans Axio Vision et réglez les paramètres pour enregistrer de courtes vidéos au 32e d'heure pendant 30 minutes. Pour la vidéo fluorescente en direct, configurez les options d'image. Ces paramètres permettent d'obtenir des vidéos proches de la fréquence d'images vidéo avec la caméra Zeiss MRM afin de visualiser la largeur totale du canal d'écoulement à l'objectif 10 x sur l'écran de l'ordinateur. Utilisez un adaptateur à montage CM, allumez la lampe au mercure, puis placez la seringue et le connecteur contenant les cellules sur la pompe à seringue. Ensuite, fixez le connecteur au canal d'entrée rempli de la micro-lame contenant l'ax stimulé par l'interleukine une bêta.Reliez le canal de sortie au connecteur fixé au tube. Placez le tube dans une boîte ou un tube conique de 15 millilitres afin de recueillir l'écoulement. Commencez l'infusion à travers la lamelle microfluidique à raison de 10 microlitres par minute.Observer les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules MDA marquées ou les CTC marquées provenant de patients à 488 nanomètres. Filtrer sur le microscope à fluorescence épiscopique. Commencer l'enregistrement de l'expérience sous forme de 32 courtes vidéos.Lors de l'analyse de la lecture, mesurez la vitesse de roulement. La vitesse de roulement est déterminée en divisant la distance parcourue par les cellules par le temps. On observe ici une culture sur une nuit d'une monocouche de cellules endothéliales.Sur la lame microscopique. Les échelles indiquent que 100 % de la lame microscopique est visible avec un objectif 5x, tandis que 70 % seulement est visible avec un objectif 10x pour les interactions médiées sélectionnées ; les cellules roulant en périphérie ne sont pas prises en compte, ce qui rend plus de 70 % de la lame microscopique disponible pour l'enregistrement vidéo et l'analyse en lecture différée. Le diagramme en boîte montre la distribution des vitesses de roulement des cellules MDA non marquées et marquées par un anticorps anti-PSMA, sur des cellules endothéliales stimulées par l'interleukine-1 bêta, dans différentes conditions de contrainte de cisaillement.Aucune différence significative n'a été observée entre les vitesses de roulement à un et cinq dynes par centimètre carré sous une contrainte de cisaillement plus élevée de 10 dynes par centimètre carré. Une différence statistiquement significative a été observée entre les vitesses de roulement des cellules MDA non marquées et celles marquées avec un anticorps anti-PSMA. Une vidéo enregistrée en temps réel à l’aide de sang provenant d’un patient atteint d’un cancer de la prostate montre trois types d’interactions entre les CTC prostatiques marquées et les cellules endothéliales exprimant des lectines : l’ancrage, où les CTC s’attachent et se réattachent ; l’adhésion stable, où les CTC ne se détachent pas même après 30 secondes ; et l’absence d’interactions, lorsque des CTC non interactives entrent dans le champ de vision. Les micro-lames peuvent facilement être immunomarquées et imagées en fluorescence afin de visualiser l’adhérence ferme des cellules MDA marquées avec un anticorps anti-PSMA.Après une profusion sur des cellules endothéliales stimulées par l'interleukine-1 bêta, on peut observer ceci. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'examiner les interactions entre des cellules rares, telles que les cellules tumorales prostatiques circulantes, et les cellules endothéliales exprimant le S-sélectine, en suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'immunofluorescence, peuvent également être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la présence de ligands du S-sélectine.Des techniques comme celles-ci peuvent aider les chercheurs à comprendre les différentes étapes impliquées dans la métastase.

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Ce rapport fournit une représentation visuelle des plaques parallèles d'analyse chambre d'écoulement pour l'étude des interactions des leucocytes endothéliales sous la contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle de l'endothélium (E)-sélectine et la E-sélectine leucocytaire ligands qui déclenchent des leucocytes roulant sur la surface des cellules endothéliales.

Analyse des leucocytes roulant physiologique E-sélectine-Mediated sur l&#39;endothélium microvasculaire

Cellules tumorales circulantes sont isolés du sang de patients atteints de cancer sans infliger des dommages cellulaires. Isolement des cellules tumorales est accomplie en utilisant une surface bimoléculaire de E-sélectine en plus d'anticorps contre des marqueurs épithéliales. Un revêtement de nanotubes de promouvoir spécifiquement l'adhésion cellulaire du cancer résultant en des puretés de capture élevés.

Isolement rapide des cellules tumorales circulantes viables partir d&#39;échantillons sanguins des patients

L'adhésion des neutrophiles à l'endothélium activé sur les sites d'infection est une partie intégrante de la réponse inflammatoire de l'hôte. Décrite dans le présent rapport est une analyse de liaison des neutrophiles qui permet...

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

L’accessibilité de modèles fiables pour étudier les interactions sanguines vasculaires chez l’homme fait défaut. Nous présentons un modèle in vitro de cellules endothéliales humaines primaires cultivées combinées à du sang total humain pour étudier les interactions cellulaires à la fois dans le sang (ELISA) et dans le compartiment vasculaire (microscopie).

A Novel In vitro Modèle pour l'étude des interactions entre les droits du sang total et de l'endothélium

Nous rapportons une méthode fiable pour isoler et cultiver des cellules endothéliales primaires spécifiques à la tumeur à partir de modèles murins génétiquement modifiés.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Ce manuscrit détaille une méthode utilisée pour générer des xénogreffes dérivées de patients atteints d’un cancer de la prostate (PDX) à partir de cellules tumorales circulantes (CTC). La génération de modèles PDX à partir de CTC fournit un modèle expérimental alternatif pour étudier le cancer de la prostate ; La tumeur la plus fréquemment diagnostiquée et une cause fréquente de décès par cancer chez les hommes.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d'angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

des cellules progénitrices endothéliales (EPCs) sont fondamentalement impliqués dans la néovascularisation des tissus ischémiques. Cette méthode décrit l'isolement de EPCs humains provenant du sang périphérique, ainsi que l'identification de leur potentiel migratoire avec des échantillons de sérum de patients de chirurgie cardiaque.

Isolement de cellules progénitrices endothéliales de volontaires sains et de leur potentiel migratoire Influencé par échantillons de sérum après chirurgie cardiaque

Le but du présent protocole est de démontrer l’injection intra prostatique de cellules de cancer de la prostate, avec castration ultérieure. Orthotopique des modèles précliniques de cancer de la prostate androgéno-dépendants et résistant à la castration sont essentielles pour étudier la maladie dans le contexte d’un micro-environnement tumeur cliniquement pertinents et un hôte immunocompétent.

Un modèle murin syngénique bioluminescentes et Fluorescent orthotopique du Cancer de la Prostate androgéno-dépendants et résistant à la Castration

Cellules endothéliales tumorales sont des déterminants importants du microenvironnement tumoral et l’évolution de la maladie. Ici, un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales pures et viables de carcinome colorectal humain et côlon normal pour être utilisé dans la recherche de tests et la pathogenèse est décrite.

Isolement des cellules endothéliales humaines du côlon Normal et carcinome Colorectal - un protocole amélioré

Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.

In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments

Découvrez une méthode in vitro pour observer les interactions entre cellules tumorales circulantes du cancer de la prostate et cellules endothéliales humaines via la microscopie vidéo sous flux physiologique.

Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines (Vidéo) | JoVE Journal

Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines

Explorer plus de vidéos