Dans la méthode in vitro pour observer les interactions E-sélectine-médiation entre la prostate cellules tumorales circulantes issues de patients et endothéliales cellules humaines

L’objectif général de cette procédure est d’examiner les interactions entre les cellules cancéreuses rares de la prostate et les cellules endothéliales exprimant la sélectine à l’aide d’un assemblage de micro-lames. Ceci est accompli en enduisant d’abord une micro-lame avec de la fibronectine. La deuxième étape consiste à cultiver des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ou VE dans un système d’écoulement dynamique sur une micro-lame avec une petite largeur de canal.

Ensuite, les cellules cancéreuses de la prostate sont marquées avec un antigène membranaire spécifique de la prostate ou anticorps monoclonal humanisé PSMA, qui est internalisé. La dernière étape consiste à perfuser les cellules cancéreuses de la prostate marquées anti PSMA sur la sélectine e exprimant ve. En fin de compte, la microscopie vidéo est utilisée pour montrer les interactions entre les cellules cancéreuses de la prostate et les cellules endothéliales.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la chambre d’écoulement à plaques parallèles et d’autres assemblages dynamiques, est qu’avec cette technique, vous pouvez examiner les interactions entre les cellules cancéreuses rares de la prostate, telles que les cellules tumorales circulantes et les cellules endothéliales cultivées dans un système d’écoulement dynamique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des métastases, telles que comment les cellules tumorales de la prostate ils métastasent par le système vasculaire sanguin ? Utilisent-ils le même mécanisme que celui utilisé par les leucocytes lors de leur isation ?

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal car elle implique la culture d’une monocouche de cellules endothéliales dans un canal étroit sous perfusion sous le capot de culture tissulaire. Tout d’abord, rincez la microlame avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ensuite, enduisez doucement la micro-lame avec 200 microlitres de fibronectine de 50 microgrammes par millilitre à l’aide d’une seringue à leurre d’un millilitre.

Couvrez la micro-lame avec le couvercle et conservez-la à l’intérieur du capot de culture tissulaire pendant 30 minutes. Ensuite, perfuser 200 microlitres de milieu de croissance chaud sur la micro-lame et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. La distribution lente du liquide dans la micro-lame empêche la formation de bulles dans le canal.

Pendant la perfusion, préparez la suspension de vex en rinçant le vex avec du PBS et en ajoutant 0,1 % de collagénase plus 0,05 % d’EDTA dans du PBS pendant une à deux minutes à température ambiante. Centrifugez le avoir dans deux millilitres de milieu de croissance à 180 fois G pendant cinq minutes. Mesurez ensuite la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et préparez 10 millions de cellules pour 100 microlitres de milieu de croissance.

Ensuite, retirez délicatement le fluide de l’entrée de la micro-lame. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, amenez la micro-lame au niveau des yeux et à l’aide d’une seringue à verrouillage de leurre d’un millilitre, versez doucement 200 microlitres de la concentration préparée de vex dans le canal. Des précautions sont de mise à cette étape pour éviter la formation de bulles si les bulles apparaissent, continuez à perfuser pendant un peu plus longtemps jusqu’à ce que les bulles pénètrent dans le canal de sortie.

Ensuite, pipetez un volume égal d’environ 80 microlitres de fluide VE à l’entrée et à la sortie de la micro-lame. Cela empêche l’écoulement des cellules dans les deux sens. Couvrez la lame et conservez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure.

Pour commencer l’assemblage de la chambre d’écoulement, placez une seringue stérile de 20 millilitres, des connecteurs de leurre femelles et mâles, un pousse-seringue et un tube dans l’incubateur pendant 15 minutes pour un volume mort minimal. Tube usagé d’un diamètre intérieur de 0,04 pouce. Le diamètre plus petit du tube empêche la formation de bulles.

Ensuite, remplissez la seringue de 20 millilitres avec 12 millilitres de milieu VE chaud. Retirez complètement la bulle de la seringue. Remplissez l’entrée de la micro-lame avec du milieu VE.

Connectez cet ensemble à la micro-glissière. Fixez délicatement le connecteur de sortie à la micro-glissière. Apportez l’installation dans l’incubateur et connectez-la à la pompe à seringue.

Réglez ensuite la pompe à un taux de cisaillement de 10 microlitres par minute avant de laisser les cellules pendant la nuit dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Le lendemain, démontez l’installation en retirant le connecteur fixé à l’entrée de la micro-lame. Retirez ensuite le connecteur de sortie deux pour réguler à la hausse l’expression de la sélectine sur les cellules endothéliales.

Préparez un milieu de croissance frais contenant de l’interleukine un bêta. Aspirez le milieu dans une seringue de 10 millilitres. Retirez le milieu restant de l’entrée de la lame, puis ajoutez-le frais et moyen en remplissant complètement l’entrée.

Connectez la seringue à la lame. Réglez le pousse-seringue à un taux de cisaillement de 10 microlitres par minute pendant quatre heures dans l’incubateur pendant l’incubation de l’interleukine un bêta de vex, préparez des cellules cancéreuses de la prostate marquées anti PSMA Alexa 4 88. Tout d’abord, ajoutez 0,05 % de trypsine EDTA aux cellules cancéreuses de la prostate MDA pendant une minute.

N’exposez pas les cellules à la trypsine pendant de longues périodes car cela peut affecter les glycopeptides présents à la surface de la cellule. Centrifugez les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, réinstillez le palais cellulaire MDA dans un millilitre de tampon de Hank et ajoutez l’anticorps anti-PSMA incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans un endroit sombre, en réanimant les cellules pendant l’incubation.

Après 30 minutes, centrifugez la solution cellulaire à 800 fois G pendant cinq minutes. Aspirez et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de tampon Hank’s. Comptez les cellules MDA marquées et amenez la concentration finale à 1 million de cellules par millilitre.

Remplissez une seringue de cinq millilitres avec les cellules MDA étiquetées et retirez les bulles. Allumez le microscope inversé et réglez l’éclairage du bigoudi sur 10 x objectif. Amenez le pousse-seringue au même niveau que la platine d’échantillon du microscope et réglez-le à un centime par centimètre carré de contrainte de cisaillement.

Ensuite, ouvrez le logiciel de vision Zeiss Axio. Sélectionnez l’objectif sur l’écran de l’ordinateur. Créez un nouveau dossier sous l’option outils du logiciel.

Ouvrez l’option d’expériences intelligentes dans Axio vision et ajustez les paramètres pour enregistrer de courtes vidéos 32e pendant 30 minutes Pour une vidéo fluorescente en direct, définissez les options d’image. Ces paramètres permettent d’obtenir des vidéos proches de la fréquence d’images vidéo avec la caméra Zeiss MRM pour visualiser toute la largeur du canal d’écoulement à 10 x objectif sur l’écran de l’ordinateur, utilisez un adaptateur de monture CM sur la lampe au mercure avant de placer la seringue et le connecteur contenant les cellules sur le pousse-seringue. Ensuite, fixez le connecteur au canal d’entrée rempli de la micro-lame contenant de l’interleukine une hache stimulée par bêta.

Connectez le canal de sortie avec le connecteur fixé au tube. Mettez le tube dans un plat ou un tube conique de 15 millilitres pour recueillir le débit. Commencez l’infusion à travers la micro lame à 10 microlitres par minute.

Observez les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules MDA marquées ou les CTC marquées dérivées de patients sous 488 nanomètres. Filtre sur le microscope à épifluorescence. Commencez à enregistrer l’expérience sous forme de 32e courtes vidéos.

Pendant l’analyse de lecture, mesurez la vitesse de roulement. La vitesse de roulement est mesurée en divisant la distance parcourue par les cellules au fil du temps. On voit ici une culture nocturne d’une monocouche de cellules endothéliales.

Sur la micro diapositive. Les mises à l’échelle montrent que 100 % de la micro-diapositive est visible à l’aide d’un objectif cinq x tandis que 70 % est visible à l’aide d’un objectif 10 x pour certaines interactions médiées, les cellules roulant sur les bords ne sont pas prises en compte, ce qui rend plus de 70 % de la micro-diapositive disponible pour l’enregistrement vidéo et l’analyse de la lecture. La boîte à moustaches montre la distribution des vitesses de roulement des cellules MDA non marquées et anti-PSMA, marquées sur des cellules endothéliales stimulées par l’interleukine à une bêta dans différentes conditions de stress de cisaillement.

Aucune différence significative n’a été observée dans les vitesses de roulement à un et cinq centimètres carrés à une contrainte pure plus élevée de 10 centimes par centimètre carré. Une vidéo chronométrée prise à partir du sang d’un patient atteint d’un cancer de la prostate montre trois types d’interactions entre les CTC prostatiques marqués et les cellules endothéliales exprimant la lectine : l’attache où les CTC se fixent et se rattachent, l’adhésion stable où les CTC ne se détachent pas même après 30 secondes et aucune interaction lorsque les CTC non interactifs entrent dans le champ de vision. Les micro-lames peuvent être facilement immuno-colorées et imaginées par fluorescence de l’adhérence ferme des cellules MDA marquées anti-PSMA.

Après une profusion d’interleukine, des cellules endothéliales stimulées par la bêta peuvent être observées ici. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’examiner les interactions entre les cellules rares telles que les cellules tumorales circulantes de la prostate et les cellules endothéliales exprimant la sélectine à la suite de cette procédure. D’autres méthodes telles que l’immunofluorescence peuvent également être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la présence de sélectine. Ligands.

De telles techniques peuvent aider les chercheurs à comprendre les différentes étapes impliquées dans les métastases.