Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et Ex vivo fibroblastes

L’objectif global de cette procédure est de caractériser la biologie distinctive à l’interface entre les cellules épithéliales malignes sur le front de la tumeur invasive et les cellules stromales associées au cancer. Ceci est accompli en établissant d’abord des cultures primaires de fibroblastes à partir d’implants côliques. La deuxième étape consiste à construire des modèles de co-culture organotypique à l’aide de fibroblastes coliques primaires et de cellules cancéreuses colorectales cultivées.

Ensuite, les modèles organotypiques sont fixés dans de la formine, sectionnés sur des lames montées sur membrane et colorés au violet crestal. La dernière étape est la microdissection au laser afin de séparer les cellules tumorales envahissantes des cellules tumorales non envahissantes et des cellules stromales associées au cancer. En fin de compte, des techniques de profilage moléculaire peuvent être utilisées pour caractériser la biologie des cellules tumorales envahissantes et non envahissantes et des cellules stromales dans le microenvironnement tumoral environnant.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé à quel point les cellules envahissantes sont clairement distinguables des cellules non envahissantes dans les modèles de co-culture organotypique tridimensionnelle du cancer colorectal. Pour commencer, obtenez des échantillons de tissu normal de la muqueuse du côlon humain directement du bloc opératoire chirurgical en laboratoire. Placez un échantillon au centre d’une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres, puis lavez la culture trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate ou du PBS complété par de la pénicilline, de la streptomycine et une zone fongique.

Ne pas aspirer après le lavage final avec des pinces stériles et un scalpel, coupez le tissu en petits morceaux. Placez ensuite chaque morceau au centre d’une croix dessinée avec la lame du scalpel. Dans une plaque à 12 puits, balancez doucement le scalpel sur le tissu pour lui permettre d’adhérer à la culture.

Les échantillons sont dans 750 microlitres de milieu de croissance primaire de fibroblastes, qui doit immerger le tissu sans lui permettre de flotter. Placez ensuite les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius, avec une température de 5 à 10 % de CO2 au cours des cinq prochains jours. Les fibroblastes commenceront lentement à se développer à partir du bord du tissu vers environ sept jours.

Cela sera plus visible après environ trois à quatre semaines. Et s’il y a suffisamment de fibroblastes en croissance, ajoutez 750 microlitres de trypsine dans chaque puits après que les cellules se sont détachées et transférez-les dans un flacon de culture tissulaire T 25 pour le gel organotypique imprégné de fibroblastes. Tout d’abord, préparez une suspension de cellules de fibroblastes contenant 500 000 cellules par gel dans du dmm supplémenté.

Préparez les gels organotypiques sur glace dans les proportions trouvées dans le protocole textuel pour neuf gels à raison d’un millilitre par gel. Préparez 10 millilitres et mélangez doucement pour éviter les bulles. Ajoutez ensuite un millilitre dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée.

Pour permettre aux gels de prendre après une heure, ajoutez un millilitre de DM EM supplémenté sur les gels et retournez dans l’incubateur pendant la nuit. Le lendemain. Aspirez le milieu par le haut des gels et plaquez un millilitre de milieu contenant 500 000 cellules épithéliales du cancer colorectal pour les feuilles de nylon enduites de gel.

Préparez à l’avance des feuilles de nylon d’autoclaves stériles mesurant 1,5 centimètre sur 1,5 centimètre à l’aide d’une pince stérile. Placez le nombre requis de feuilles de nylon dans un plat de culture de 10 centimètres. Préparez le mélange de gel sur de la glace comme décrit dans le protocole de texte et ajoutez 0,1 molaire d’hydroxyde de sodium au mélange de gel jusqu’à ce qu’il devienne rose indiquant que la solution a été neutralisée.

Ajoutez ensuite 250 microlitres de cette solution à chaque feuille de nylon. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 30 minutes pour permettre au gel de prendre. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’une solution de glutaraldéhyde à 1 % dans du PBS dans chaque boîte de culture de 10 centimètres.

Une fois que le gel a pris avant d’incuber à quatre degrés Celsius pendant une heure, lavez les feuilles de nylon trois fois dans du PBS et une fois dans du dme supplémenté. Incuber les feuilles pendant la nuit dans le même tampon à quatre degrés Celsius pour élever les gels organotypiques sur des grilles d’échafaudage stérilisées qui ont été préparées en pliant des feuilles d’acier inoxydable en une formation de trépied. Ensuite, à l’aide d’une pince stérilisée et d’éthanol, placez une grille d’acier dans chaque puits d’une plaque à six puits.

Placez une feuille de nylon enduite de gel avec le côté collagène vers le haut sur chaque grille. Transférez soigneusement les gels organotypiques de la plaque à 24 puits sur la feuille de nylon en relief à l’aide d’une spatule stérilisée et d’éthanol. Remplissez le puits de D mem supplémentaire jusqu’à ce que la feuille de nylon soit en contact avec le milieu mais pas immergée.

Assurez-vous que le milieu ne touche pas le gel organotypique. Incuber pendant 14 jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Remplacer le milieu tous les deux jours.

Retirez tout l’organotypique, y compris la feuille de nylon, du puits et placez-le sur un film collant. Coupez en deux la feuille d’organotypique et de nylon à l’aide d’un scalpel jetable propre et fixez les deux moitiés dans du formaldéhyde pendant 24 heures. À température ambiante, remplacez le formaldéhyde par de l’éthanol à 70 % après 24 heures et laissez reposer toute la nuit avant d’incorporer dans la paraffine, de sectionner et de colorer pour effectuer une microdissection au laser.

Première section, l’organotypique à 10 microns d’épaisseur sur des lames montées sur membrane. Après avoir traité les sections comme décrit dans le protocole de texte, préparez-vous à effectuer une microdisectation laser à l’aide de la forme de plate-forme choisie. Placez la lame de verre avec la section de teinture à disséquer au microscope.

Face vers le bas sur la platine du microscope, montez un microtube de centrifugation de 0,5 millilitre dans la cassette de collecte et ajoutez 50 microlitres de tampon de lyse cellulaire dans le capuchon dans lequel le tissu micro-disséqué s’accumulera en vision directe. Utilisez le joystick pour identifier le tissu d’intérêt et à l’aide de l’interface du logiciel, annotez la section organique colorée, en mettant en évidence les cellules à microdisecter sur le front d’invasion tumorale. Donnez l’ordre au laser de tirer, ce qui devrait à la fois découper la section en surbrillance et propulser le tissu microdisecté dans le capuchon du tube de la micro-centrifugeuse.

Procéder au traitement des échantillons par une méthode appropriée pour extraire l’analyte d’intérêt. Des images de microdissection laser de cellules cancéreuses colorectales SW 480 envahissant le stroma organotypique sont présentées ici. Le violet Crestal est utilisé pour mettre en évidence les cellules épithéliales du cancer colorectal.

Les îlots tumoraux invasifs sont ensuite définis avant la dissection au laser et le morceau coupé est transporté vers un dispositif de collecte. Les cellules non envahissantes et les cellules stromales sont identifiées et isolées à l’aide de la même méthodologie. Les co-cultures tridimensionnelles ont été analysées par profilage de micro-ARN pour comparer les microARN exprimés différentiellement entre les cellules du front de la tumeur invasive et celles des zones tumorales stratifiées.

Les données ont été triées par changement complet et valeurs de données plus ou moins deux. Les changements à partir d’une expérience représentative sont présentés montrant l’expression différentielle des gènes de micro-ARN entre les cellules de marge invasives et les cellules de marge non invasives. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de construire des modèles organotypiques anatomiquement appropriés et d’utiliser la microdissection laser pour isoler des populations individuelles de cellules pour une étude plus approfondie. Ho.