Élevage et manipulation d’embryons de poisson-zèbre

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

4.10: Mouse Genotyping

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

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07:48 min

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April 30, 2023

Overview

Les poissons-zèbres (Danio rerio) sont un organisme modèle important qui est particulièrement précieux pour la recherche en biologie du comportement. Les poissons-zèbres sont extrêmement fertiles et peuvent produire des centaines de progénitures par semaine, il est donc relativement facile de collecter un grand nombre d’embryons pour un nombre élevé d’échantillons. De plus, les poissons-zèbres ont un développement rapide et les embryons sont transparents ce qui permet une visualisation facile des procédés de développement.

Cette vidéo explique les étapes requises pour la collecte d’embryons de poissons-zèbres récemment fécondés. Un bref aperçu du comportement d’accouplement du poisson-zèbre est présenté, suivi par les instructions pour la mise en place de croisements dans des cuves d’élevage spécialisées de laboratoire qui permettent de contrôler l’accouplement. Les conditions requises pour initialiser la libération des œufs (connue comme le frai) le matin suivant la mise en place des cuves, sont aussi expliquées. Ensuite, les techniques essentielles pour le travail avec des embryons sont présentées, incluant l’inhibition du développement de pigments avec le produit chimique PTU et la déchorionation ; une procédure lors de laquelle la membrane entourant l’embryon qui ressemble à une coquille (le chorion) est retirée. Finalement, la vidéo conclut avec quelques utilisations pratiques de ces techniques en recherche du développement.

Procedure

Le poisson-zèbre est un système modèle petit mais puissant. Ces poissons prolifiques peuvent produire des centaines de descendants par semaine et plusieurs milliers au cours de leurs vies. Leur développement externe rapide et leur corps transparent rendent les embryons idéaux pour des utilisations variées. Cette vidéo va expliquer les bases de la récolte et de la manipulation d’embryons, avant de décrire les méthodes de recherche actuelles utilisant les embryons de poissons-zèbres.

En vue de produire des embryons, il peut etre interessant de connaître les principes de l’accouplement du poisson-zèbre.

Le poisson-zèbre a une reproduction sexuée, donc l’élevage requiert des mâles et des femelles. Les mâles ont des corps fins avec une légère teinte rougeâtre, tandis que les femelles ont de gros ventres argentés et plein d’œufs.

Un accouplement périodique garde les œufs sains, mais produire tous ces œufs nécessite beaucoup de travail. Par consequent, chaque femelle ne devrait être accouplée qu’une fois par semaine.

Enfin, comme chez beaucoup d’autres animaux, des processus sensoriels guident le comportement de reproduction des poissons. Un signal olfactif du mâle aide son amie féminine à être prête à frayer, tandis qu’un peu de lumière tamisée les met tous les deux en action.

Après avoir appris comment identifier mâle et femelle, il est temps de mettre en place le croisement. Pour l’élevage de zebrafish, les chercheurs utilisent des récipients spécifiquement créés pour la reproduction. Les cuves d’élevage ont une partie amovible avec des trous qui permettent aux œufs de tomber au travers. Ceci empeche les œufs d’être mangés par un poisson adulte affamé.

Pour commencer, rassemblez les poissons adultes dans une cuve d’élevage pendant l’après-midi ou la soirée. Pour collecter des embryons à leur premier stade le matin suivant, séparez le poisson mâle de la femelle avec une paroi, qui va les empêcher de se reproduire avant que vous soyez prêt à commencer votre expérience. Pour empêcher les poissons de sauter, couvrez la cuve avec un couvercle. Ensuite, laissez les poissons s’acclimater l’un à l’autre au cours de la nuit.

Après avoir passé la nuit ensemble, les poissons vont s’accoupler au matin suivant.

La première étape au matin est de retirer la paroi qui sépare le mâle et la femelle pour initialiser le frai. Si vous n’utilisez pas de paroi séparatrice, le poisson va pondre des œufs rapidement après l’apparition de lumière.

Lorsque les mâles poursuivent les femelles autour de la cuve, les pontes sont stimulées et les mâles relâchent le sperme dans l’eau pour fécondation. Attendez environ 15 à 30 minutes après avoir retiré la paroi de séparation pour laisser le temps aux poissons de se reproduire. Ensuite, retirez les adultes de la cuve en utilisant un filet, ou en levant la partie amovible tout en versant les poissons dans une autre cuve.

Ensuite, versez l’eau et les embryons à travers une passoire à thé pour les récolter. Utilisez de l’ « eau de poisson » pour laver les embryons hors de la passoire dans un plaque de pétri. Il pourrait être nécessaire de transférer des embryons entre plateaux pour atteindre une densité optimale de 50 à 100 œufs par plaque. Pour assurer que le développement ait lieu à un rythme normal, placez les plaques dans un incubateur à 28,5 °C.

Une fois que vous avez vos embryons, manipulez les précautionneusement. Ils sont importants pour vos expériences ! Passons en revue certaines astuces.

Pour garder les embryons sains, faites en sorte que l’eau dans la plaque de pétri soit propre et sans débris. Des embryons morts seront opaques et doivent être retirés tous les jours. De plus, du bleu de méthylène peut être ajouté à l’eau pour empêcher la croissance fongique.

Quand vous avez besoin de bouger des embryons d’une plaque à une autre, utilisez une pipette de transfert. En faisant tourbillonner la plaque, vous pouvez concentrer les embryons au milieu, ce qui facilite le pipetage.

Quelques protocoles requièrent des étapes supplémentaires pour l’entretien des embryons. Les trois premiers jours de vie les embryons de poisson-zèbre se développent à l’intérieur du chorion, ce qui peut gêner sa manipulation. Le chorion peut être retiré par traitement avec l’enzyme protéolytique pronase, ou en utilisant des forceps pour le retirer manuellement. De plus, le poisson-zèbre commence à développer des pigments après 24 heures, comme montré ici, ce qui peut interférer avec le microscope. Pour voir au travers, les scientifiques ajoutent du PTU à l’eau de l’embryon, ce qui inhibe la production du pigment mélanine.

Maintenant que vous savez comment obtenir et maintenir des embryons de zebrafish, explorons quelques moyens d’utilisation des poissons-zèbres pour la recherche et les découvertes scientifiques.

Le développement externe des embryons de poisson-zèbre permet la manipulation génétique par microinjection d’ADN, ARN, ou de réactifs démolisseurs de gènes. Cette méthode amène à une distribution uniforme du matériel injecté d’un bout à l’autre de l’embryon et peut produire des phénotypes visibles résultant d’une surexpression ou d’une perte de protéines. La même technique peut aussi être utilisée pour créer des poissons transgéniques dans lesquels des structures spécifiques sont marquées par l’expression de protéines fluorescentes.

De plus, la petite taille des embryons et des larves de poisson-zèbre les rend idéaux pour le criblage chimique phénotypique. Ici, les embryons sont placés dans une plaque à 96 puits et ensuite traités avec un catalogue de petites molécules en ajoutant les produits chimiques dans l’eau. Plus tard, ces plaques de poissons sont passées en revue à la recherche de défauts morphologiques, tel que le développement anormal montré ici.

Enfin, la transparence des embryons de zebrafish les rend bien adapté pour la microscopie. Des embryons vivants qui expriment des protéines fluorescentes dans des types spécifiques de cellules peuvent être visualisés avec le microscope confocal, permettant aux chercheurs d’examiner les mouvements cellulaires dans des tissus en développement au cours du temps.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’élevage et la manipulation d’embryons de poisson-zèbre. Dans cette vidéo, nous avons expliqué les bases de la reproduction, la mise en place des cuves d’élevage et la manipulation des embryons. Nous avons aussi expliqué quelques méthodes de recherche qui profitent de ce petit embryon puissant. Merci de nous avoir regardé !

Transcript

Zebrafish are a small but powerful model system. These prolific fish can generate hundreds of offspring per week and many thousands over their lifetimes. Rapid external development and transparent bodies make the embryos ideal for diverse applications. This video will cover the basics of embryo collection and handling before describing current research methods that take advantage of zebrafish embryos.

In order to generate embryos, it helps to know a little bit about zebrafish mating behavior.

Zebrafish undergo sexual reproduction, so breeding requires both male and female fish. Males have slimmer bodies with a slightly red hue, while females have bigger, silver bellies full of eggs.

Periodic mating keeps eggs healthy, but making all those eggs takes a lot of work, so individual females should only be mated once per week.

Finally, like many other animals, sensory processes guide mating behavior in fish.

Olfactory cues from the male help to get his lady friend ready to spawn, while a little bit of mood lighting sets them both in action.

Having learned how to identify male and female fish, it’s time to set up a cross.

For zebrafish breeding, researchers use tanks specifically designed for mating. Breeding tanks typically feature a removable insert with holes that allow eggs to fall through. This feature protects the eggs from being eaten by hungry adult fish.

To begin, combine adult fish in breeding tanks during the afternoon or evening. To collect early stage embryos the following morning, separate male and female fish with a divider, which stops them from breeding before you’re ready to begin an experiment. To prevent the fish from jumping out, be sure to cover the breeding tank with a lid. Then, leave the fish to acclimate to each other overnight.

After spending the night together in a breeding tank, the fish will mate the following morning.

The first step in the morning is to remove the divider from between the male and female fish to initiate spawning. If a divider is not used, the fish will lay eggs shortly after light onset.

As the males chase the females around the tank, they stimulate spawning of eggs while releasing sperm into the water for fertilization. Wait approximately 15 – 30 minutes after pulling a divider to give the fish time to mate. Then, remove the adults from the tank by using a net or by lifting the tank insert and placing the fish into another tank.

Next, pour the water and the embryos through a mesh tea strainer for collection. Then, using “egg water,” wash the embryos off the strainer into a petri dish. It may be necessary to transfer embryos between dishes to achieve an optimal density of 50 – 100 per dish. To ensure development proceeds at a normal pace, place the dishes in an incubator at 28.5 °C.

Once you’ve got your embryos, handle them with care. They are important for your experiments! Let’s go over some pointers.

To keep embryos healthy, make sure to keep the water in the petri dishes clean and free of debris. Dead embryos will be opaque and should be removed daily. Additionally, methylene blue can be added to the water to prevent fungal growth.

Any time you need to move embryos from one dish to another, use a transfer pipet. By swirling the dish, you can concentrate the embryos in the center of the plate, making the pipetting easier.

Some protocols require a few additional steps for embryo maintenance. For the first three days of life, zebrafish embryos develop inside of a chorion, which can impede manipulation of the embryo. The chorion can be removed by treatment with the proteolytic enzyme, pronase, or by using forceps to remove it manually. Additionally, zebrafish begin to develop pigment by 24 hours, as shown here in this zebrafish larva, which can interfere with microscopy. To see through this problem, scientists supplement the embryo water with PTU, which inhibits production of the pigment melanin.

Now that you know how to obtain and care for zebrafish embryos, let’s explore some of the ways researchers use them for scientific discovery.

The external development of zebrafish embryos allows for genetic manipulation by microinjection of DNA, RNA, or gene knockdown reagents. This method leads to uniform distribution of injected material throughout the embryo and can produce visible phenotypes resulting from the overexpression or loss of a protein. The same technique can also be used to make transgenic fish in which specific structures are marked by the expression of fluorescent proteins.

Additionally, the small size of zebrafish embryos and larvae make them ideal for phenotypic chemical screening. Here, embryos are loaded into 96-well plates and then treated with libraries of small molecules by adding the chemicals into the water. Later, these plates of fish are screened for morphological defects, such as the abnormal development shown here.

Finally, the transparency of the zebrafish embryos makes them well suited for microscopy. Live embryos expressing fluorescent proteins in specific cell types can be mounted and visualized with confocal microscopy, allowing researchers to examine cell movements in developing tissues over time.

You’ve just watched JoVE’s video on zebrafish breeding and embryo handling. In this video, we’ve discussed the basics of mating, setting up breeding tanks, and embryo handling. We also discussed some research methods that take advantage of this powerful little embryo. Thanks for watching!

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