Name: Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la In vitro Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Découvrez une méthode de clonage par enzyme de restriction pour évaluer la capacité de réplication du VIH-1 sous-type C in vitro. Cette technique permet d'incorporer des gènes gag dérivés de patients dans le plasmide MJ4 et de quantifier la production de virions.

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Les chercheurs remercient tous les volontaires en Zambie qui ont participé à cette étude et tout le personnel du projet de recherche sur le VIH Zambia Emory à Lusaka qui a rendu cette étude possible. Les chercheurs tiennent à remercier Jon Allen, Smita Chavan et Mackenzie Hurlston pour leur assistance technique et la gestion des échantillons. Nous tenons également à remercier le Dr Mark Brockman pour ses discussions et son généreux don des cellules GXR25.
Cette étude a été financée par R01 AI64060 et R37 AI51231 (EH) et l’Initiative internationale pour un vaccin contre le sida. Ce travail a été rendu possible en partie grâce au généreux soutien du peuple américain par l’intermédiaire de l’Agence des États-Unis pour le développement international (USAID). Le contenu relève de la responsabilité des auteurs de l’étude et ne reflète pas nécessairement les opinions de l’USAID ou du gouvernement des États-Unis. Ce travail a également été soutenu, en partie, par le centre de virologie du Centre Emory pour la recherche sur le sida (subvention P30 AI050409). DC et JP ont été soutenus en partie par Action Cycling Fellowships. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention de base du Centre national de recherche sur les primates de Yerkes (2P51RR000165-51). Ce projet a également été financé en partie par le National Center for Research Resources P51RR165 et est actuellement soutenu par l’Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison de la longueur et de la nature technique de ce protocole, il ya plusieurs étapes qui sont essentielles à la fois pour la construction réussie de chimères plasmides Gag-MJ4 ainsi que pour la quantification de la capacité de réplication virale. Bien que la stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour l&#39;introduction de gènes gag étranger dans MJ4 décrite dans le présent protocole a de nombreux avantages par rapport aux méthodes basées sur la recombinaison utilisées précédemment, le p...

Déterminer à la fois l&#39;hôte et des caractéristiques virales qui influent sur le VIH-1 pathogenèse et la progression de la maladie est primordiale pour la conception rationnelle de vaccins. La réponse immunitaire cellulaire est un élément clé de la réponse immunitaire humaine au VIH-1 infection. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont nécessaires pour le contrôle initial de la virémie aiguë, et permettent à l&#39;hôte d&#39;établir un état ​​stable (point de consigne) de la charge virale de 1,2. Épuisement expérimentale de ces cellules effectrices en résulte une perte de contrôle viral 3,4. Malgré cela, les mutations se produisent à l&#39;intérieur de s&#39;échapper du génome viral qui renverser CTL reconnaissance des cellules infectées par des virus 9.5. Certains allèles HLA ont été associés à une charge virale plus faibles et plus lente progression de la maladie, y compris 57 * B, B * et B * 27 81 10 à 15. Une partie de l&#39;effet protecteur des allèles HLA de classe I peut être attribué au fait qu&#39;ils ciblent les régions fonctionnellement limitées du génome tels que Gaget pour sélectionner des mutations d&#39;échappement qui diminuent la capacité du virus à se répliquer in vitro de 16 à 21. Bien évasion du système immunitaire cellulaire est bénéfique pour le virus dans le contexte de la classe de sélection de l&#39;allèle HLA I, l&#39;effet de ces mutations peut avoir des conséquences différentielles de l&#39;hôte lors de la transmission d&#39;un individu HLA-incompatibles 22,23. Par conséquent, la compréhension des effets des mutations transmises évacuation de HLA-associé sur la capacité de réplication virale sera important d&#39;approfondir notre compréhension de début de la pathogenèse du VIH-1. Bien que beaucoup de progrès ont été faits pour identifier et caractériser les défauts de remise en forme de mutations d&#39;échappement individuelles associées à HLA de classe spécifique je allèles 24-29, naturellement isolats VIH-1 ont des empreintes uniques et complexes de polymorphismes HLA-associé, probable découlant de l&#39;HLA pression immunitaire médiée par des milieux différents immunogénétiques 30. En apanalyse revious, Goepfert et al. a montré que l&#39;accumulation de mutations HLA-associés dans les séquences Gag transmissibles provenant de 88 Zambiens infection aiguë a été associée à une réduction de la valeur de consigne de la charge virale 31. Ceci suggère que la transmission de mutations délétères d&#39;échappement, en particulier dans Gag, à des destinataires HLA-incompatibles fournit un bénéfice clinique, et peut être dû à la réplication virale atténuée. Aller de l&#39;avant, il est impératif d&#39;étudier la complexité des combinaisons de polymorphismes Gag dans les isolats naturels travaillent de concert pour définir les caractéristiques du virus transmissibles telles que la capacité de réplication et de la réplication précoce pourrait à son tour affecter le VIH-1 paramètres cliniques et à un stade avancé pathogenèse. Brockman et al. D&#39;abord démontré un lien entre la capacité de réplication des séquences gag-pro isolé lors de l&#39;infection de stade chronique et la charge virale dans les deux sous-type C et les infections B32-35. L&#39;approche expérimentale présentée dans ces études, bien approprié pour l&#39;examen de la capacité de réplication in vitro de séquences provenant d&#39;individus infectés de manière chronique, présente plusieurs réserves techniques et des limitations qui rendent l&#39;étude du VIH-1 sous-type à capacité réplicative C individus infectés aiguë difficile. Cette méthode repose sur la recombinaison de séquences amplifiées par PCR basée sur la population dans le sous-type B NL4-3 provirus, qui a été dérivé en partie de VBL, un laboratoire adapté stock de virus 36. génération du virus a été réalisée par co-transfection d&#39;une lignée de cellules T CEM à base 37 avec des amplicons PCR et digéré delta NL4-3 ADN de gag-pro. Cette méthode nécessite l&#39;excroissance du virus au cours d&#39;une période de plusieurs semaines à plusieurs mois, ce qui pourrait fausser la nature du stock de virus récupérée par rapport à la quasi-espèce virale in vivo, et en modifiant par conséquent la mesure de la capacité de réplication in vitro. Cette méthode is plus approprié pour étudier les individus infectés de manière chronique, où il sélectionne de manière efficace contre le virus de la capacité réplicative plus élevé, et où le clonage de nombreux différents variants viraux à partir d&#39;un grand nombre d&#39;individus infectés de manière chronique est très laborieuse et donc non réalisable. Cependant, au sein d&#39;une personne gravement infectée, il ya généralement de un à deux variantes présent, et éliminant ainsi le risque de biaiser la nature du stock de virus récupéré, grâce à des pressions de sélection in vitro, permet une évaluation plus précise de vitro la capacité à la réplication. Deuxièmement, cette méthode nécessite recombiner sous-type C séquences gag-pro dans un squelette dérivé sous-type B, et pourrait introduire squelette biais d&#39;incompatibilité dans l&#39;analyse. En raison de ces limitations, un grand nombre de séquences doivent être analysés afin de surmonter les biais potentiels introduits. Nous décrivons ici une appro expérimental alternatifhaque approprié pour étudier des séquences dérivées de sous-type C personnes infectées de façon aiguë. Nous utilisons une stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour introduire le gène gag provenant de points de VIH-1 sous-type C individus infectés temps de l&#39;infection aiguë dans le proviral épine dorsale sous-type C, MJ4. L&#39;utilisation de MJ4 comme une épine dorsale qui en commun pour cloner les gènes gag est crucial pour l&#39;analyse de sous-type C de séquences dérivées. MJ4 est issu d&#39;un isolat primaire 38, et seraient donc moins susceptibles d&#39;introduire un biais en raison de sous-type incompatibilité entre la colonne vertébrale et le gène gag. De plus, l&#39;approche de clonage en utilisant l&#39;enzyme de restriction sur la base permet la proviral construit pour être directement transfectées dans des cellules 293T, et pour la récupération d&#39;un stock de virus clonal identique à la séquence gag clone. Le procédé présenté ci-dessous est un procédé à haut débit pour évaluer la capacité de réplication de sous-type C provenant Gag-MJ4les virus chimériques. La transfection dans des cellules 293T est simple et la récupération de virus ne prend que trois jours. In vitro la capacité de réplication est analysée sur la même lignée de cellules T à base de CEM-CCR5 créé par Brockman et al. 37, mais en utilisant des modifications du protocole importants nécessaires à la replication réussie des sous-types des virus chimériques C MJ4. L&#39;utilisation d&#39;une lignée de cellules T approprié plutôt que de PBMC permet à un grand nombre de virus de sous-type chimérique MJ4-C à tester avec une grande reproductibilité test. Enfin, en utilisant un dosage radio-marqué de la transcriptase inverse pour la quantification du virus dans le surnageant est plus économique que l&#39;utilisation des kits ELISA disponibles dans le commerce p24. Il donne également une gamme dynamique plus élevée, ce qui était important pour détecter les virus faiblement et hautement répliquant dans le même dosage et pour détecter des différences subtiles dans la réplication entre les isolats. En conclusion, la méthode présentée ici a permis del&#39;étude approfondie de la capacité de réplication des séquences gag dérivés du VIH-1 sous-type C infection aiguë individus de la Zambie, et comme il est écrit, pourrait aussi être élargie pour étudier d&#39;autres sous-type C infecté populations. Un haut degré de variation dans les capacités de réplication entre les différents isolats Gag a été observée. En outre, nous avons pu montrer une association statistique entre la capacité de réplication du Gag transmis et la consigne de la charge virale ainsi que des CD4 + baisse sur une période de trois ans 39. Ces résultats soulignent l&#39;importance d&#39;étudier les caractéristiques virales faire transmis, tels que la capacité de réplication, interagissent avec le système immunitaire de l&#39;hôte d&#39;influencer la pathogenèse lors de l&#39;infection précoce et feront partie intégrante de l&#39;élaboration d&#39;interventions efficaces de vaccination ainsi que le traitement.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs PCR</td></tr><tr><td>GOF : 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalé standard</td></tr><tr><td>VifOR : 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>GagInnerF1 : 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalé standard</td></tr><tr><td>BclIDegRev2 : 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>MJ4For1b : 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>MJ4Rev : 5' CCCATCTCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>BclIRev : 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>GagF2 : 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>For3 : 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>GagR6 : 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>Rev3 : 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>Rev1 : 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Fabriqué par Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Mini Kit d’ARN viral</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Tubes de bandelettes, bleu (capuchon plat)</td><td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III système RT-PCR en une étape</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II ADN polymérase</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucléotide Mix</td><td>Roche 4638956001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, haute résistance au gel</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb Échelle d’ADN</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Fabriqué par Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel et Système de nettoyage PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir, à simple tranchant</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Fabriqué par Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & Réactifs de clonage </td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 100 x 15 mm polystyrène Boîtes de Pétri</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Tubes à fond rond en polypropylène</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>endonucléase de restriction NgoMIV</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucléase de restriction BclI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucléase de restriction HpaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase, 5 U/&mu ; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 cellules compétentes, >108 cfu/&mu ; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield plasmidique miniprep system</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Amphyl cleaner/disinfectant</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Fabriqué par Promega</td></tr><tr><td>Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Costar, 6 puits, plates</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Plaques Costar, 24 puits, plates</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Plaques Costar, 96 puits, rondes</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Dessus du filtre Corning/col incliné, 75 cm2</td><td></td><td>Fisher 10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Fioles, Dessus du filtre Corning/col incliné, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 50 ml, bouchon bleu</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Fabriqué par BD Biosciences</td></tr><tr><td>Tubes coniques, 15 ml, bouchon bleu</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Fabriqué par BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Fabriqué par Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/ Streptomycine/Glutamine, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS avec magnésium et calcium, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans magnésium et calcium</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Sarstedt, couleurs assorties</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Plateaux de réservoir pour Multicanaux, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 microplaque à fond en V bien transparent traité pour culture tissulaire</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, tampon de 1 m Solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, défini, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Fabriqué par Promega</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde, Grade II, 25 % en H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Solution de chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde, pour la biologie moléculaire, 36,5 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Allegra X15-R</td><td></td> Compteur de cellules automatisé <td>Beckman Coulter</td> 392932 <td></td></tr><tr><td>TC10 Microscope inversé</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Réactifs de dosage de la <forte> de la transcriptase inverse</forte></td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha ;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8,0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Doit être ajusté à pH 7,8 avec KOH</td></tr><tr><td>2 M Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Adjust à 1 M solution</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Acide polyadénylique (Poly rA) sel de potassium&nbsp ;</td><td>Midland Reagent Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) primer</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, écran phosphorescent super résolution, petit</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96-well plaque modèle (M) Polycarbonate</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Corning Ruban d’étanchéité en aluminium à microplaques à 96 puits, non stérile</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Papier d’échange d’anions DE-81</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Cassette d’autoradiographie</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Cyclone stockage phoshpor écran</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; in vitro</em&gt; capacité de réplication du vih-1 sous-type c gag-mj4 chimériques virus

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

L’effet protecteur de nombreux allèles HLA de classe I sur la pathogenèse du VIH-1 et la progression de la maladie est, en partie, attribué à leur capacité à cibler les parties conservées du génome du VIH-1 qui s’échappent difficilement. Les changements de séquence attribués à la pression immunitaire cellulaire se produisent dans tout le génome pendant l’infection et, s’ils sont trouvés dans des régions conservées du génome telles que Gag, peuvent affecter la capacité du virus à se répliquer in vitro. La transmission de polymorphismes liés à HLA chez Gag à des receveurs non appariés HLA a été associée à une réduction des charges virales de consigne. Nous avons émis l’hypothèse que cela pourrait être dû à une capacité de réplication réduite du virus. Nous présentons ici une nouvelle méthode d’évaluation de la réplication in vitro du VIH-1 influencée par le gène gag isolé à partir de points temporels aigus chez des Zambiens infectés par le sous-type C. Cette méthode utilise le clonage basé sur l’enzyme de restriction pour insérer le gène gag dans un squelette proviral commun du VIH-1 de sous-type C, MJ4. Cela le rend plus approprié pour l’étude des séquences de sous-type C que les méthodes précédentes basées sur la recombinaison qui ont évalué la réplication in vitro de séquences gag-pro dérivées de manière chronique. Néanmoins, le protocole pourrait être facilement modifié pour l’étude de virus d’autres sous-types. De plus, ce protocole détaille une méthode robuste et reproductible pour évaluer la capacité de réplication des virus chimériques Gag-MJ4 sur une lignée de cellules T à base de CEM. Cette méthode a été utilisée pour l’étude des virus chimériques Gag-MJ4 dérivés de 149 Zambiens gravement infectés de sous-type C, et a permis d’identifier les résidus dans Gag qui affectent la réplication. Plus important encore, la mise en œuvre de cette technique a permis de mieux comprendre comment la réplication virale définit les paramètres de la pathogenèse précoce du VIH-1, tels que la charge virale au point de consigne et le déclin longitudinal des lymphocytes T CD4+.

Pour exécuter correctement ce protocole, ce qui crée un plasmide proviral capable d&#39;assembler entièrement fonctionnels, infectieuses chimères Gag-MJ4, un grand soin doit être pris pour générer des amplicons PCR appropriées. Déterminer si le PCR a généré l&#39;amplicon gag de taille appropriée est cruciale. Les produits doivent être à moins de 100 paires de bases (pb) de l&#39;amplicon d&#39;environ 1700 pb représenté sur la figure 1A. La longueur exacte de ce fragment sera variable en fonct...

La pathogenèse du VIH-1 est définie à la fois par les caractéristiques virales et les facteurs génétiques de l’hôte. Nous décrivons ici une méthode robuste qui permet d’effectuer des mesures reproductibles pour évaluer l’impact de la variation de la séquence du gène gag sur la capacité de réplication in vitro du virus.

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

L'objectif général de cette procédure est d'insérer des gènes gag provenant de personnes infectées par le VIH-1 sous-type C dans un plasmide de VIH-1 doté d'une capacité de réplication, afin d'évaluer l'effet des polymorphismes de la séquence gag sur la capacité de réplication du VIH-1 in vitro. Cette approche consiste d'abord à amplifier le gène gag à partir du plasma du patient. La deuxième étape consiste à cloner la séquence gag provenant du patient dans le clone moléculaire infectieux et réplicatif MJ-quatre. Ensuite, le plasmide chimérique gag-MJ-quatre est transfecté afin de produire des stocks viraux infectieux, puis titrés pour évaluer l'infectiosité sur une lignée cellulaire indicatrice. La dernière étape consiste à mesurer la capacité de réplication in vitro dans la lignée cellulaire T GXR-25. En définitive, un dosage de la transcriptase inverse marquée au radio-isotope est utilisé pour quantifier la production de virions au fil du temps et visualiser la cinétique de réplication virale.La méthode que nous allons décrire aujourd'hui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du VIH. Celles-ci incluent la définition des déterminants de la capacité de réplication du VIH et la compréhension de la manière dont la capacité de réplication du VIH affecte la pathogenèse à long terme. La description des méthodes aujourd'hui sera assurée par Jessica Prince et Dan Claiborne, deux de mes étudiants diplômants.Pour commencer cette procédure, effectuez une transcription inverse de l'ADNc à partir de l'ARN et amplifiez les produits d'ADN du premier cycle à l'aide d'une transcriptase inverse et d'une ADN polymérase thermostable dans une réaction RT-PCR en une étape. Ensuite, en utilisant un microlitre de l'amplification PCR du premier cycle comme matrice d'ADN, réalisez une amplification PCR du second cycle en configuration imbriquée. Ajoutez ensuite trois microlitres de colorant de charge 5X à cinq microlitres du volume de réaction du second cycle.Faites-le migrer à 120 volts sur un gel d’agarose TAE à 1 % contenant un colorant d’ADN fluorescent UV jusqu’à ce que les bandes soient résolues. Ensuite, visualisez les bandes de 1,6 kb sur un éclairage à lumière bleue. Après cela, faites migrer le volume restant de 45 microlitres de réaction sur un gel d’agarose TAE à 1 % contenant le colorant d’ADN. Découpez les bandes appropriées à l’aide d’une lame de rasoir propre et combinez trois réactions positives par individu. Ensuite, extrayez l’ADN à partir du fragment de gel à l’aide d’un kit de purification de gel et éluésez-le dans de l’eau sans nucléase. Congelez le produit à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. 0:15:56 Dans cette procédure, après amplification de la région UTR 5’ de la répétition terminale longue du plasmide MJ-quatre, visualisez les produits PCR de 1,3 kb sur l’éclairage. Découpez les amplicons positifs, puis purifiez-les et congelez-les comme décrit précédemment. Ensuite, créez les amplicons fusionnés MJ-quatre LTR gag par PCR d’extension par recouvrement par épissage. Visualisez, découpez, purifiez et congelez l’amplicon long de 3,2 kb. Digestez maintenant 1,5 microgramme de plasmide MJ-quatre et 1,5 microgramme de produit PCR LTR-gag purifié avec l’endonucléase de restriction BCL-un pendant 1,5 heure à 50 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez un microlitre de NGOM-quatre à la réaction de digestion et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après cela, ajoutez du colorant de charge 5x aux réactions de digestion par restriction. Faites migrer lentement le volume total sur un gel d’agarose TAE à 1 % contenant un colorant d’ADN pendant une à deux heures à 100 volts. Visualisez, découpez et purifiez les bandes indiquées pour le clonage comme décrit précédemment.Ensuite, préparez les réactions de ligation en utilisant l'insert purifié LTR-gag et de l'ADN vectoriel MJ-four dans un rapport insert/vecteur de trois pour un. Incubez les réactions de ligation toute la nuit à quatre degrés Celsius.Ensuite, transformer des bactéries chimiquement compétentes JM-109 avec les produits de ligation étalés sur des boîtes de gélose LB contenant 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline. Faire croître les bactéries transformées à 30 degrés Celsius pendant au moins 22 heures. Pour confirmer la fidélité du clonage, couper l'ADN de mini-prep avec les enzymes de restriction NGOM-quatre et HPA-un lors d'une double digestion à 37 degrés Celsius pendant deux heures.Ensuite, analyser sur un gel d'agarose TAE à 1 %. Calculer le volume de virus nécessaire à partir de chaque stock en fonction du titre en UI par microlitre obtenu lors d'un dosage sur cellules TZM-BL afin d'infester cinq fois 10 puissance 5 cellules GXR-25 à une multiplicité d'infection de 0,05. Veiller à porter les équipements de protection individuelle adéquats pour manipuler le VIH réplicatif, incluant une blouse intégrale, un masque facial et des gants doubles. Le jour de l'infection, sortir les stocks de virus du congélateur à moins 80 degrés Celsius et les décongeler. Ensuite, diluer le virus dans du milieu C-R-P-M-I jusqu'à un volume de 100 microlitres afin d'obtenir une MOI de 0,05. Ajouter au plateau 96 puits en fond v, traité pour culture cellulaire, en incluant à chaque série d'expériences de réplication un contrôle positif et un contrôle négatif, et organiser le plateau de sorte que chaque colonne sur deux reste vide afin de limiter la contamination croisée entre les puits. Ensuite, compter les cellules GXR-25 à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé et calculer le nombre total de cellules requis pour toutes les infections. Répartir le volume nécessaire dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuger pour former un culot cellulaire. Puis aspirer soigneusement le milieu et resuspendre dans du C-R-P-M-I à une concentration de cinq fois 10 puissance 5 cellules par 100 microlitres. Prélever les cellules à la pipette et les verser dans un réservoir stérile, puis bien mélanger. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque puits du plateau 96 puits contenant le virus dilué et bien mélanger. Ajouter ensuite deux microlitres de solution de polybrene à cinq milligrammes par millilitre dans chaque puits et bien mélanger les cellules. Incuber ensuite à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture cellulaire avec 5 % de CO2 pendant trois heures.Afin de laver les cellules infectées, centrifuger la plaque V en 96 puits afin de former un culot cellulaire. Ensuite, retirer soigneusement 150 microlitres du milieu et le remplacer par 150 microlitres frais de C-R-P-M-I sans perturber le culot cellulaire. Répéter la procédure deux fois supplémentaires afin de bien laver les cellules ; après la dernière centrifugation et l'ajout de 150 microlitres de C-R-P-M-I, resuspendre le culot cellulaire à l’aide d’une pipette multicanal. Ajouter le mélange de chaque puits à 800 microlitres de C-R-P-M-I dans un puits d’une plaque de culture tissulaire en 24 puits. Puis placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % de CO₂ à 37 degrés Celsius. Tous les deux jours, transférer 100 microlitres de surnageant prélevé à la surface du puits de culture vers un puits d’une plaque en 96 puits en U, puis congeler pour une analyse ultérieure par le test RT. Ensuite, resuspendre soigneusement les cellules et retirer la moitié du volume restant afin d’éviter une surcroissance cellulaire. Puis, rétablir le volume initial en ajoutant 550 microlitres de C-R-P-M-I frais à chaque puits. Dans cette procédure, ajouter un à deux microlitres de DTTP à 10 millicuries par millilitre et quatre microlitres de DTT à un molaire à chaque aliquot de un millilitre du mélange maître de RT. Mélanger soigneusement chaque tube de micro-centrifugation de 1,5 millilitre contenant le mélange maître de RT, le DTT et le DTTP à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres et transférer dans une cuve stérile.Ensuite, distribuez 25 microlitres du mélange RT marqué dans chaque puits d'une plaque PCR à 96 puits à parois minces. Ajoutez 5 microlitres de chaque surnageant dans la plaque PCR contenant le mélange maître de RT. Scellez ensuite la plaque PCR avec un couvercle en feuille adhésive et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans un thermocycleur. Après l'incubation, faites de petits trous dans le couvercle en feuille à l’aide d’une pipette multicanal de 200 microlitres. Mélangez les échantillons cinq fois. Transférez 5 microlitres de chaque échantillon sur du papier DE-81 et laissez sécher à l’air pendant 10 minutes. Placez les taches dans des récipients de lavage séparés. Lavez ensuite les taches cinq fois avec du SSC 1X. Puis deux fois avec de l’éthanol à 90 % pendant cinq minutes par lavage, avant de les laisser sécher à l’air. Une fois sèches, enveloppez soigneusement la tache dans du film plastique et exposez-la à l’écran phosphorescent dans une cassette hermétiquement fermée toute la nuit à température ambiante.Une fois prêt, analyser les écrans phosphorescents à l’aide d’un imageur à phosphor et quantifier les transcrits radioactifs.Illustrées ici sont les images représentatives de gel illustrant la séparation électrophorétique des différents amplicons PCR nécessaires pour générer un amplicon gag dérivé du patient, pouvant être cloné dans le vecteur plasmidique MJ-quatre. Cette image représentative de gel montre la séparation électrophorétique des digestions par enzymes de restriction pour le clonage des gènes gag du patient dans MJ-quatre.Cette image représentative de gel illustre la séparation électrophorétique de digestions par enzymes de restriction d'un ADN plasmidique purifié de l'ARNm gag chimérique MJ-quatre. Ce graphique montre la reproductibilité du test de réplication dans le temps sur la lignée cellulaire GXR-25. Les mêmes virus chimériques gag MJ-quatre ont été utilisés pour infecter les cellules GXR-25 dans deux expériences indépendantes réalisées à environ un an d'intervalle.Les scores de réplication ont été obtenus en calculant la pente des valeurs DLU transformées en log et en normalisant cette pente par rapport au type sauvage MJ-four. Les deux mesures indépendantes sont fortement corrélées et soulignent la reproductibilité des tests réalisés à différents moments et avec des cellules à différents passages. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du VIH/sida d'explorer les déterminants viraux de la pathogenèse, lors d'une infection aiguë par le sous-type C, le sous-type le plus répandu dans le monde. Travailler avec un VIH capable de se répliquer peut être extrêmement dangereux. Toutes les étapes impliquant un virus vivant doivent être effectuées dans une installation de niveau de sécurité biologique deux plus. Toutes les surfaces doivent être régulièrement désinfectées et des gants doubles doivent être portés en permanence.

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Immunology and Infection

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Cette expérience visualisé est un guide pour utiliser un clone moléculaire fluorescent du VIH pour vivre des expériences d'imagerie confocale.

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Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

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Comprendre les conformations des antigènes de surface viraux est nécessaire pour évaluer la neutralisation des anticorps et guider la conception d’immunogènes vaccinaux efficaces. Nous décrivons ici un test ELISA basé sur des cellules qui permet d’étudier la reconnaissance du VIH-1 trimérique Env exprimé à la surface des cellules transfectées par des anticorps anti-Env spécifiques.

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La compétition de croissance entre virus quasi isogéniques fournit une mesure sensible pour déterminer la valeur relative de réplication. Les protocoles décrits ici comprennent la construction de clones recombinants du VIH-1, la propagation et la compétition de croissance du virus et des méthodes d’analyse optimisées pour produire des résultats sensibles et cohérents.

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Ici, un protocole est présenté pour la création d’un chromosome artificiel bactérien infectieux contenant un ADNc pleine longueur de l’ARN génomique à brin positif du virus de l’encéphalite japonaise. Ce protocole peut être utilisé pour construire un ADNc fonctionnel d’autres virus à ARN à brin positif, ce qui en fait un outil génomique puissant pour l’étude de la biologie des virus.

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Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

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Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

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