Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la In vitro Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

L’objectif global de cette procédure est d’incorporer des gènes gag dérivés d’individus infectés par le sous-type CHIV 1 dans un plasmide VIH compétent pour la réplication. Afin d’évaluer l’effet des polymorphismes de la séquence gag sur la capacité de réplication du VIH in vitro, cela est accompli en amplifiant d’abord le gène gag à partir du plasma du patient. La deuxième étape consiste à cloner la séquence gag dérivée du patient dans le clone moléculaire infectieux MJ four, compétent en matière de réplication.

Ensuite, le plasmide chimère gag MJ quatre est transfecté afin de générer des stocks viraux infectieux et titré pour évaluer l’infectivité sur une lignée cellulaire indicatrice. La dernière étape consiste à mesurer la capacité de réplication in vitro dans la lignée des lymphocytes T G XR 25. En fin de compte, un test de transcriptase inverse radiomarqué est utilisé pour quantifier la production de virions au fil du temps afin de visualiser la cinétique de réplication virale.

La méthode que nous allons décrire aujourd’hui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du VIH. Il s’agit notamment de définir les déterminants de la capacité de réplication du VIH et de comprendre comment la capacité du VIH influe sur la pathogenèse à long terme. Jessica Prince et Dan Klaban, deux de mes étudiants diplômés, décriront les méthodes d’aujourd’hui.

Pour commencer cette procédure, transcrivez inversement l’ADNC de l’ARN et amplifiez les premiers produits d’ADN ronds à l’aide de la transcriptase inverse et d’une ADN polymérase thermostable dans une RT PCR en une étape. Ensuite, en utilisant un microlitre de l’amplification PCR du premier tour comme matrice d’ADN, effectuez une amplification PCR de deuxième tour imbriquée. Ensuite, ajoutez trois microlitres de cinq x colorant de chargement à cinq microlitres du volume de réaction du deuxième tour.

Faites-le fonctionner à 120 volts sur un gel TAE à 1 % contenant une coloration d’ADN fluorescente UV jusqu’à ce que les bandes soient résolues. Visualisez ensuite les bandes de 1,6 Ko sur un illuminateur à lumière bleue. Après cela, exécutez le volume de réaction restant de 45 microlitres sur un gel TAE à 1 % contenant la coloration d’ADN.

Excisez les bandes appropriées avec une lame de rasoir propre et combinez trois réactions positives par individu. Ensuite, extrayez l’ADN de la tranche de gel à l’aide d’un kit de purification de gel et placez-le dans l’eau sans nucléases. Congelez le produit à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure dans cette procédure.

Après avoir amplifié la longue répétition terminale de la région UTR première cinq du plasmide MJ quatre. Visualisez les produits PCR de 1,3 Ko sur l’illuminateur, excisez les amplicons positifs, puis purifiez-les et congelez-les comme décrit précédemment. Ensuite, créez les amplicons de gag MJ quatre LTR fusionnés via PCR d’extension de chevauchement d’épissure.

Visualisez, excisez, purifiez et congelez l’amplicon de 3,2 kb de long. Digérez maintenant 1,5 microgramme de plasmide MJ quatre et 1,5 microgramme de produit PCR gag LTR purifié avec une endonucléase de restriction BCL pendant 1,5 heure à 50 degrés Celsius. Par la suite, ajoutez un microlitre de NGOM 4 à la réaction de digestion et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après cela, ajoutez cinq x colorant de chargement aux réactions de digestion de restriction. Électrophorèse lentement le volume total sur un gel TAE à 1 % contenant une coloration d’ADN pendant une à deux heures à 100 volts. Visualisez, excisez et purifiez les bandes indiquées pour le clonage comme décrit précédemment.

Ensuite, préparez les réactions de ligature à l’aide du bâillon LTR purifié. Insérez un ADN à quatre vecteurs MJ dans un rapport insert/vecteur de trois pour un. Incuber les réactions de ligature pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Transformez ensuite les bactéries JM 1 0 9 chimiquement compétentes avec des produits de ligature étalés sur des plaques de tarière LB avec 100 microgrammes par millilitre. L’ampicilline fait pousser des bactéries transformées à 30 degrés Celsius pendant au moins 22 heures. Pour confirmer la fidélité du clonage, coupez l’ADN de la mini-préparation avec les enzymes de restriction NGO M quatre et HPA un dans une double digestion à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, analysez-le sur un 1 %aros. Gel TAE. Calculez le volume de virus nécessaire à partir de chaque stock en fonction de l’UI par titre de microlitre d’un test de cellules TZM BL afin d’infecter cinq fois 10 à la cinquième G XR deux cinq cellules à une multiplicité d’infection de 0,05.

Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle approprié pour travailler avec des personnes compétentes en matière de réplication, qui comprend une blouse complète, un masque facial et des gants doubles le jour de l’infection. Retirer les stocks de virus du congélateur à moins 80 degrés Celsius et les décongeler. Ensuite, diluez le virus dans un milieu C-R-P-M-I à un volume de 100 microlitres.

Afin d’obtenir un MOI de 0,05, ajoutez-le à la plaque de 96 puits traitée par culture tissulaire vbo, en incluant à la fois un témoin positif et un témoin négatif dans chaque série d’expériences de réplication, et configurez la plaque de telle sorte que toutes les autres colonnes soient vierges pour limiter la contamination croisée entre les puits. Ensuite, comptez les deux cinq cellules GXR à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et calculez le nombre de cellules nécessaires au total pour toutes les infections. Aliquote le volume requis dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuge pour granuler les cellules.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu et mettez-le en suspension dans C-R-P-M-I à une concentration de cinq fois 10 à la cinquième cellule par 100 microlitres, pipetez les cellules dans une auge stérile et mélangez soigneusement. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant le virus dilué et mélangez soigneusement. Après cela, ajoutez deux microlitres de cinq milligrammes par millilitre de solution de poly brain dans chaque puits et mélangez soigneusement les cellules.

Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire avec 5 % de CO2 pendant trois heures afin de laver la centrifugeuse de cellules infectées. La plaque inférieure en V de 96 puits pour granuler les cellules. Ensuite, retirez soigneusement 150 microlitres du milieu et remplacez-le par 150 microlitres frais de C-R-P-M-I sans perturber la pastille cellulaire.

Répétez la procédure deux fois de plus pour laver suffisamment les cellules après la dernière centrifugation et l’ajout de 150 microlitres de C-R-P-M-I remettez en suspension la pastille cellulaire avec une pipette multicanaux. Ajouter le mélange de chaque puits à 800 microlitres de C-R-P-M-I dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius tous les deux jours.

Transférez 100 microlitres de surnageant de la surface du puits de culture vers un puits d’une plaque inférieure de 96 puits et congelez-les pour une analyse ultérieure à l’aide du test RT, puis remettez les cellules en suspension à fond et retirez la moitié du volume restant pour éviter la prolifération cellulaire. Après cela, rétablissez le volume d’origine en ajoutant 550 microlitres de C-R-P-M-I frais dans chaque puits dans cette procédure, ajoutez un à deux microlitres de 10 millicuries par millilitre de DTTP et quatre microlitres d’une molaire DIO trois etol à chaque aliquote d’un millilitre de notre mélange maître. Mélangez soigneusement chaque tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre de RT master mix DTT et DTTP avec une pipette de 1000 microlitres et transférez-le dans une auge stérile.

Ensuite, distribuez 25 microlitres de RT étiqueté. Mélanger dans chaque puits d’une plaque PCR à paroi mince de 96 puits. Ajouter cinq microlitres de chaque surnageant à la plaque de PCR contenant le mélange maître RT. Ensuite, scellez la plaque PCR avec un couvercle en aluminium adhésif et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans un thermocycleur après l’incubation, faites de petits trous dans le couvercle en aluminium à l’aide d’une pipette multicanaux de 200 microlitres.

Mélangez les échantillons cinq fois. Transférez cinq microlitres de chaque échantillon sur du papier DE 81 et laissez tous les échantillons sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Placez les taches dans des récipients de lavage séparés.

Ensuite, lavez les taches cinq fois avec un XSSC. Puis deux fois avec de l’éthanol à 90 % pendant cinq minutes par lavage avant de les laisser sécher à l’air. Une fois sec, enveloppez soigneusement le tampon dans du film Saran et exposez-le à l’écran phospho dans une cassette hermétiquement fermée pendant la nuit à température ambiante.

Une fois prêt, analysez les écrans phospho à l’aide d’un imageur phospho et quantifiez les transcrits radioactifs. Montré. Voici les images de gel représentatives illustrant la séparation électrophorétique des différents amplicons PCR nécessaires pour générer un amplicon gag dérivé d’un patient capable d’être cloné dans le squelette plasmidique MJ quatre. Cette image de gel représentative représente la séparation électrophorétique des digestions de restriction pour cloner les gènes gag du patient dans MJ quatre.

Et cette image de gel représentative représente la séparation électrophorétique des digestions de restriction d’un gag purifié MJ quatre chimères d’ADN plasmidique. Ce graphique montre la reproductibilité du test de réplication dans le temps dans la lignée G XR deux cinq cellules. Le même gag MJ quatre virus chimériques ont été utilisés pour infecter G XR deux cinq cellules dans deux expériences indépendantes réalisées à environ un an d’intervalle.

Les scores de réplication ont été générés en calculant la pente des valeurs DLU transformées en log et en normalisant cette pente à MJ quatre de type sauvage. Les deux mesures indépendantes sont fortement corrélées et mettent en évidence la reproductibilité des tests effectués à des moments différents et avec des cellules à différents passages. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du VIH/sida pour explorer les déterminants viraux de la pathogenèse.

Dans l’infection aiguë de sous-type C, le sous-type le plus répandu dans le monde. Travailler avec un VIH compétent en réplication peut être extrêmement dangereux. Toutes les étapes impliquant des virus vivants doivent être effectuées dans une installation BSL deux plus.

Toutes les surfaces doivent être régulièrement décontaminées et des gants doubles doivent être portés en tout temps.