Name: Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la In vitro Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Découvrez une méthode de clonage par enzyme de restriction pour évaluer la capacité de réplication du VIH-1 sous-type C in vitro. Cette technique permet d'incorporer des gènes gag dérivés de patients dans le plasmide MJ4 et de quantifier la production de virions.

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Les chercheurs remercient tous les volontaires en Zambie qui ont participé à cette étude et tout le personnel du projet de recherche sur le VIH Zambia Emory à Lusaka qui a rendu cette étude possible. Les chercheurs tiennent à remercier Jon Allen, Smita Chavan et Mackenzie Hurlston pour leur assistance technique et la gestion des échantillons. Nous tenons également à remercier le Dr Mark Brockman pour ses discussions et son généreux don des cellules GXR25.
Cette étude a été financée par R01 AI64060 et R37 AI51231 (EH) et l’Initiative internationale pour un vaccin contre le sida. Ce travail a été rendu possible en partie grâce au généreux soutien du peuple américain par l’intermédiaire de l’Agence des États-Unis pour le développement international (USAID). Le contenu relève de la responsabilité des auteurs de l’étude et ne reflète pas nécessairement les opinions de l’USAID ou du gouvernement des États-Unis. Ce travail a également été soutenu, en partie, par le centre de virologie du Centre Emory pour la recherche sur le sida (subvention P30 AI050409). DC et JP ont été soutenus en partie par Action Cycling Fellowships. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention de base du Centre national de recherche sur les primates de Yerkes (2P51RR000165-51). Ce projet a également été financé en partie par le National Center for Research Resources P51RR165 et est actuellement soutenu par l’Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison de la longueur et de la nature technique de ce protocole, il ya plusieurs étapes qui sont essentielles à la fois pour la construction réussie de chimères plasmides Gag-MJ4 ainsi que pour la quantification de la capacité de réplication virale. Bien que la stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour l&#39;introduction de gènes gag étranger dans MJ4 décrite dans le présent protocole a de nombreux avantages par rapport aux méthodes basées sur la recombinaison utilisées précédemment, le p...

Déterminer à la fois l&#39;hôte et des caractéristiques virales qui influent sur le VIH-1 pathogenèse et la progression de la maladie est primordiale pour la conception rationnelle de vaccins. La réponse immunitaire cellulaire est un élément clé de la réponse immunitaire humaine au VIH-1 infection. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont nécessaires pour le contrôle initial de la virémie aiguë, et permettent à l&#39;hôte d&#39;établir un état ​​stable (point de consigne) de la charge virale de 1,2. Épuisement expérimentale de ces cellules effectrices en résulte une perte de contrôle viral 3,4. Malgré cela, les mutations se produisent à l&#39;intérieur de s&#39;échapper du génome viral qui renverser CTL reconnaissance des cellules infectées par des virus 9.5. Certains allèles HLA ont été associés à une charge virale plus faibles et plus lente progression de la maladie, y compris 57 * B, B * et B * 27 81 10 à 15. Une partie de l&#39;effet protecteur des allèles HLA de classe I peut être attribué au fait qu&#39;ils ciblent les régions fonctionnellement limitées du génome tels que Gaget pour sélectionner des mutations d&#39;échappement qui diminuent la capacité du virus à se répliquer in vitro de 16 à 21. Bien évasion du système immunitaire cellulaire est bénéfique pour le virus dans le contexte de la classe de sélection de l&#39;allèle HLA I, l&#39;effet de ces mutations peut avoir des conséquences différentielles de l&#39;hôte lors de la transmission d&#39;un individu HLA-incompatibles 22,23. Par conséquent, la compréhension des effets des mutations transmises évacuation de HLA-associé sur la capacité de réplication virale sera important d&#39;approfondir notre compréhension de début de la pathogenèse du VIH-1. Bien que beaucoup de progrès ont été faits pour identifier et caractériser les défauts de remise en forme de mutations d&#39;échappement individuelles associées à HLA de classe spécifique je allèles 24-29, naturellement isolats VIH-1 ont des empreintes uniques et complexes de polymorphismes HLA-associé, probable découlant de l&#39;HLA pression immunitaire médiée par des milieux différents immunogénétiques 30. En apanalyse revious, Goepfert et al. a montré que l&#39;accumulation de mutations HLA-associés dans les séquences Gag transmissibles provenant de 88 Zambiens infection aiguë a été associée à une réduction de la valeur de consigne de la charge virale 31. Ceci suggère que la transmission de mutations délétères d&#39;échappement, en particulier dans Gag, à des destinataires HLA-incompatibles fournit un bénéfice clinique, et peut être dû à la réplication virale atténuée. Aller de l&#39;avant, il est impératif d&#39;étudier la complexité des combinaisons de polymorphismes Gag dans les isolats naturels travaillent de concert pour définir les caractéristiques du virus transmissibles telles que la capacité de réplication et de la réplication précoce pourrait à son tour affecter le VIH-1 paramètres cliniques et à un stade avancé pathogenèse. Brockman et al. D&#39;abord démontré un lien entre la capacité de réplication des séquences gag-pro isolé lors de l&#39;infection de stade chronique et la charge virale dans les deux sous-type C et les infections B32-35. L&#39;approche expérimentale présentée dans ces études, bien approprié pour l&#39;examen de la capacité de réplication in vitro de séquences provenant d&#39;individus infectés de manière chronique, présente plusieurs réserves techniques et des limitations qui rendent l&#39;étude du VIH-1 sous-type à capacité réplicative C individus infectés aiguë difficile. Cette méthode repose sur la recombinaison de séquences amplifiées par PCR basée sur la population dans le sous-type B NL4-3 provirus, qui a été dérivé en partie de VBL, un laboratoire adapté stock de virus 36. génération du virus a été réalisée par co-transfection d&#39;une lignée de cellules T CEM à base 37 avec des amplicons PCR et digéré delta NL4-3 ADN de gag-pro. Cette méthode nécessite l&#39;excroissance du virus au cours d&#39;une période de plusieurs semaines à plusieurs mois, ce qui pourrait fausser la nature du stock de virus récupérée par rapport à la quasi-espèce virale in vivo, et en modifiant par conséquent la mesure de la capacité de réplication in vitro. Cette méthode is plus approprié pour étudier les individus infectés de manière chronique, où il sélectionne de manière efficace contre le virus de la capacité réplicative plus élevé, et où le clonage de nombreux différents variants viraux à partir d&#39;un grand nombre d&#39;individus infectés de manière chronique est très laborieuse et donc non réalisable. Cependant, au sein d&#39;une personne gravement infectée, il ya généralement de un à deux variantes présent, et éliminant ainsi le risque de biaiser la nature du stock de virus récupéré, grâce à des pressions de sélection in vitro, permet une évaluation plus précise de vitro la capacité à la réplication. Deuxièmement, cette méthode nécessite recombiner sous-type C séquences gag-pro dans un squelette dérivé sous-type B, et pourrait introduire squelette biais d&#39;incompatibilité dans l&#39;analyse. En raison de ces limitations, un grand nombre de séquences doivent être analysés afin de surmonter les biais potentiels introduits. Nous décrivons ici une appro expérimental alternatifhaque approprié pour étudier des séquences dérivées de sous-type C personnes infectées de façon aiguë. Nous utilisons une stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour introduire le gène gag provenant de points de VIH-1 sous-type C individus infectés temps de l&#39;infection aiguë dans le proviral épine dorsale sous-type C, MJ4. L&#39;utilisation de MJ4 comme une épine dorsale qui en commun pour cloner les gènes gag est crucial pour l&#39;analyse de sous-type C de séquences dérivées. MJ4 est issu d&#39;un isolat primaire 38, et seraient donc moins susceptibles d&#39;introduire un biais en raison de sous-type incompatibilité entre la colonne vertébrale et le gène gag. De plus, l&#39;approche de clonage en utilisant l&#39;enzyme de restriction sur la base permet la proviral construit pour être directement transfectées dans des cellules 293T, et pour la récupération d&#39;un stock de virus clonal identique à la séquence gag clone. Le procédé présenté ci-dessous est un procédé à haut débit pour évaluer la capacité de réplication de sous-type C provenant Gag-MJ4les virus chimériques. La transfection dans des cellules 293T est simple et la récupération de virus ne prend que trois jours. In vitro la capacité de réplication est analysée sur la même lignée de cellules T à base de CEM-CCR5 créé par Brockman et al. 37, mais en utilisant des modifications du protocole importants nécessaires à la replication réussie des sous-types des virus chimériques C MJ4. L&#39;utilisation d&#39;une lignée de cellules T approprié plutôt que de PBMC permet à un grand nombre de virus de sous-type chimérique MJ4-C à tester avec une grande reproductibilité test. Enfin, en utilisant un dosage radio-marqué de la transcriptase inverse pour la quantification du virus dans le surnageant est plus économique que l&#39;utilisation des kits ELISA disponibles dans le commerce p24. Il donne également une gamme dynamique plus élevée, ce qui était important pour détecter les virus faiblement et hautement répliquant dans le même dosage et pour détecter des différences subtiles dans la réplication entre les isolats. En conclusion, la méthode présentée ici a permis del&#39;étude approfondie de la capacité de réplication des séquences gag dérivés du VIH-1 sous-type C infection aiguë individus de la Zambie, et comme il est écrit, pourrait aussi être élargie pour étudier d&#39;autres sous-type C infecté populations. Un haut degré de variation dans les capacités de réplication entre les différents isolats Gag a été observée. En outre, nous avons pu montrer une association statistique entre la capacité de réplication du Gag transmis et la consigne de la charge virale ainsi que des CD4 + baisse sur une période de trois ans 39. Ces résultats soulignent l&#39;importance d&#39;étudier les caractéristiques virales faire transmis, tels que la capacité de réplication, interagissent avec le système immunitaire de l&#39;hôte d&#39;influencer la pathogenèse lors de l&#39;infection précoce et feront partie intégrante de l&#39;élaboration d&#39;interventions efficaces de vaccination ainsi que le traitement.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs PCR</td></tr><tr><td>GOF : 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalé standard</td></tr><tr><td>VifOR : 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>GagInnerF1 : 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalé standard</td></tr><tr><td>BclIDegRev2 : 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>MJ4For1b : 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, desalt standard</td></tr><tr><td>MJ4Rev : 5' CCCATCTCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>BclIRev : 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>GagF2 : 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>For3 : 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>GagR6 : 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>Rev3 : 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td><td></td> <td>DNA Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>Rev1 : 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, dessalage standard</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Fabriqué par Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Mini Kit d’ARN viral</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Tubes de bandelettes, bleu (capuchon plat)</td><td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III système RT-PCR en une étape</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II ADN polymérase</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucléotide Mix</td><td>Roche 4638956001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, haute résistance au gel</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb Échelle d’ADN</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Fabriqué par Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel et Système de nettoyage PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir, à simple tranchant</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Fabriqué par Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology & Réactifs de clonage </td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 100 x 15 mm polystyrène Boîtes de Pétri</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Tubes à fond rond en polypropylène</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>endonucléase de restriction NgoMIV</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucléase de restriction BclI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucléase de restriction HpaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase, 5 U/&mu ; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 cellules compétentes, >108 cfu/&mu ; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield plasmidique miniprep system</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Amphyl cleaner/disinfectant</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Fabriqué par Promega</td></tr><tr><td>Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plaques Costar, 6 puits, plates</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Plaques Costar, 24 puits, plates</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Plaques Costar, 96 puits, rondes</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Dessus du filtre Corning/col incliné, 75 cm2</td><td></td><td>Fisher 10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Fioles, Dessus du filtre Corning/col incliné, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 50 ml, bouchon bleu</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Fabriqué par BD Biosciences</td></tr><tr><td>Tubes coniques, 15 ml, bouchon bleu</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Fabriqué par BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Fabriqué par Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/ Streptomycine/Glutamine, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS avec magnésium et calcium, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans magnésium et calcium</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Sarstedt, couleurs assorties</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Plateaux de réservoir pour Multicanaux, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 microplaque à fond en V bien transparent traité pour culture tissulaire</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, tampon de 1 m Solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, défini, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Fabriqué par Promega</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde, Grade II, 25 % en H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Solution de chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde, pour la biologie moléculaire, 36,5 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Allegra X15-R</td><td></td> Compteur de cellules automatisé <td>Beckman Coulter</td> 392932 <td></td></tr><tr><td>TC10 Microscope inversé</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Réactifs de dosage de la <forte> de la transcriptase inverse</forte></td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha ;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8,0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Doit être ajusté à pH 7,8 avec KOH</td></tr><tr><td>2 M Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Adjust à 1 M solution</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Acide polyadénylique (Poly rA) sel de potassium&nbsp ;</td><td>Midland Reagent Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) primer</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, écran phosphorescent super résolution, petit</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96-well plaque modèle (M) Polycarbonate</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Corning Ruban d’étanchéité en aluminium à microplaques à 96 puits, non stérile</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Fabriqué par Corning Life</td></tr><tr><td>Papier d’échange d’anions DE-81</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Cassette d’autoradiographie</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Cyclone stockage phoshpor écran</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; in vitro</em&gt; capacité de réplication du vih-1 sous-type c gag-mj4 chimériques virus

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

L’effet protecteur de nombreux allèles HLA de classe I sur la pathogenèse du VIH-1 et la progression de la maladie est, en partie, attribué à leur capacité à cibler les parties conservées du génome du VIH-1 qui s’échappent difficilement. Les changements de séquence attribués à la pression immunitaire cellulaire se produisent dans tout le génome pendant l’infection et, s’ils sont trouvés dans des régions conservées du génome telles que Gag, peuvent affecter la capacité du virus à se répliquer in vitro. La transmission de polymorphismes liés à HLA chez Gag à des receveurs non appariés HLA a été associée à une réduction des charges virales de consigne. Nous avons émis l’hypothèse que cela pourrait être dû à une capacité de réplication réduite du virus. Nous présentons ici une nouvelle méthode d’évaluation de la réplication in vitro du VIH-1 influencée par le gène gag isolé à partir de points temporels aigus chez des Zambiens infectés par le sous-type C. Cette méthode utilise le clonage basé sur l’enzyme de restriction pour insérer le gène gag dans un squelette proviral commun du VIH-1 de sous-type C, MJ4. Cela le rend plus approprié pour l’étude des séquences de sous-type C que les méthodes précédentes basées sur la recombinaison qui ont évalué la réplication in vitro de séquences gag-pro dérivées de manière chronique. Néanmoins, le protocole pourrait être facilement modifié pour l’étude de virus d’autres sous-types. De plus, ce protocole détaille une méthode robuste et reproductible pour évaluer la capacité de réplication des virus chimériques Gag-MJ4 sur une lignée de cellules T à base de CEM. Cette méthode a été utilisée pour l’étude des virus chimériques Gag-MJ4 dérivés de 149 Zambiens gravement infectés de sous-type C, et a permis d’identifier les résidus dans Gag qui affectent la réplication. Plus important encore, la mise en œuvre de cette technique a permis de mieux comprendre comment la réplication virale définit les paramètres de la pathogenèse précoce du VIH-1, tels que la charge virale au point de consigne et le déclin longitudinal des lymphocytes T CD4+.

Pour exécuter correctement ce protocole, ce qui crée un plasmide proviral capable d&#39;assembler entièrement fonctionnels, infectieuses chimères Gag-MJ4, un grand soin doit être pris pour générer des amplicons PCR appropriées. Déterminer si le PCR a généré l&#39;amplicon gag de taille appropriée est cruciale. Les produits doivent être à moins de 100 paires de bases (pb) de l&#39;amplicon d&#39;environ 1700 pb représenté sur la figure 1A. La longueur exacte de ce fragment sera variable en fonct...

La pathogenèse du VIH-1 est définie à la fois par les caractéristiques virales et les facteurs génétiques de l’hôte. Nous décrivons ici une méthode robuste qui permet d’effectuer des mesures reproductibles pour évaluer l’impact de la variation de la séquence du gène gag sur la capacité de réplication in vitro du virus.

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

L'objectif général de cette procédure est d'insérer des gènes gag provenant de personnes infectées par le VIH-1 sous-type C dans un plasmide de VIH-1 doté d'une capacité de réplication, afin d'évaluer l'effet des polymorphismes de la séquence gag sur la capacité de réplication du VIH-1 in vitro. Cette approche consiste d'abord à amplifier le gène gag à partir du plasma du patient. La deuxième étape consiste à cloner la séquence gag provenant du patient dans le clone moléculaire infectieux et réplicatif MJ-quatre. Ensuite, le plasmide chimérique gag-MJ-quatre est transfecté afin de produire des stocks viraux infectieux, puis titrés pour évaluer l'infectiosité sur une lignée cellulaire indicatrice. La dernière étape consiste à mesurer la capacité de réplication in vitro dans la lignée cellulaire T GXR-25. En définitive, un dosage de la transcriptase inverse marquée au radio-isotope est utilisé pour quantifier la production de virions au fil du temps et visualiser la cinétique de réplication virale.La méthode que nous allons décrire aujourd'hui peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du VIH. Celles-ci incluent la définition des déterminants de la capacité de réplica

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Source : Claiborne, D. T. et al. Une méthode de clonage basée sur les enzymes de restriction pour évaluer la capacité de réplication in vitro des virus chimériques de sous-type C du VIH-1 Gag-MJ4. J. Vis. Exp. (2014)Ce vidéo montre l'évaluation de la capacité de réplication virale à l'aide d'un dosage de la transcriptase inverse radiomarquée. Des surnageants de culture contenant des virions progéniteurs sont ajoutés à un mélange de transcription inverse contenant un nucléotide radiomarqué. Le...

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La méthode décrite ici est établie pour déterminer l’étendue de la restriction du VIH-1 par la protéine inhibitrice cellulaire SAMHD1. Les cellules U937 de la lignée myéloïde humaine sont transduites avec un vecteur d’expression SAMHD1 co-exprimant YFP, différenciées puis contestées avec la RFP VIH. Le niveau de restriction est déterminé par analyse par cytométrie de flux.

Analyse de la restriction SAMHD1 par cytométrie en flux dans les cellules myéloïdes humaines U937

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

Découvrez une méthode de clonage par enzyme de restriction pour évaluer la capacité de réplication du VIH-1 sous-type C in vitro. Cette technique permet d'incorporer des gènes gag dérivés de patients dans le plasmide MJ4 et de quantifier la production de virions.

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la In vitro Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus (Vidéo) | JoVE Journal

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