Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l'expression des gènes

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les étapes au cours desquelles l'expression des gènes viraux est affectée par un traitement chimique. Pour ce faire, des cellules en culture tissulaire sont ensemencées et incubées jusqu'à confluence. Les cellules sont ensuite infectées soit par un virus de la vaccine porteur de trois marqueurs rapporteurs, soit par un virus contrôle dépourvu de promoteur.

Ensuite, les composés de traitement sont appliqués et les cellules sont incubées pendant 18 heures afin de permettre l'achèvement de toutes les étapes de l'expression des gènes viraux. La fluorescence résultante est ensuite mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant les variations relatives d'expression induites par les composés expérimentaux.

L'avantage principal de cette technique par rapport à l'infection par un virus exprimant une seule protéine de fusion fluorescente réside dans le fait que ce jeu de virus fournit davantage d'informations sur l'étape du cycle viral où un médicament thérapeutique spécifique agit, offrant ainsi un aperçu de son mécanisme d'action. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour identifier des inhibiteurs de l'infection virale, elle peut également servir à détecter l'étape de la réplication virale accomplie dans des lignées cellulaires non perméables ou dans des criblages par ARNi, permettant ainsi d'identifier les facteurs cellulaires nécessaires à l'infection. Ce protocole utilise le virus rapporteur multistade, ou virus TrpV (triple virus), dans lequel trois fluorophores spectralement distincts sont intégrés dans le génome double brin d'un seul virus vaccinia.

Chacun de ces fluorophores est contrôlé par un promoteur spécifique bien défini selon les stades. Le promoteur C 11 R pour l'expression précoce de Venus, le promoteur intermédiaire G eight R pour l'expression de m-cherry et le promoteur F 17 R pour l'expression tardive de tag BFP. Ainsi, Venus, m-Cherry et tag BFP sont exprimés de manière séquentielle durant l'infection.

En tant que témoin, un virus dépourvu de promoteur est utilisé. Le VPL contient un construct similaire à celui de la VpT, cependant, il ne possède pas de promoteur de transcription fonctionnel.

Commencez ce protocole en dissociant les cellules HeLa cultivées dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Diluez les cellules dans du milieu de croissance à environ 2,0 × 10⁵ cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez 100 µL dans chaque puits d'une plaque 96 puits transparente à fond plat et parois noires. Incubez les cellules pendant 24 heures dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu'à ce qu'elles soient confluentes. Pour diluer les virus, décongelez TrpV et PLV dans un bain-marie à 37 °C, puis soniquez pendant cinq minutes afin de les désagréger. Ensuite, diluez le stock viral à 1,0 × 10⁷ PFU/mL dans du milieu d'infection préchauffé à 37 °C.

Pour infecter les cellules, remplacez le milieu de croissance par 50 microlitres du virus dilué dans chaque puits. Pour chaque traitement, infectez trois puits en réplicat avec TrpV et trois autres avec PLV afin de tenir compte de la fluorescence de fond propre à chaque traitement. Ceci correspond à un temps égal à zéro heure post-infection. Par exemple, préparez 350 microlitres pour 6 puits de 96 puits avec 50 microlitres chacun. Chaque composé doit être dilué à une concentration double de la concentration finale, car il sera ajouté au volume d'inoculum déjà présent dans le puits. Ensuite, pour chaque condition de traitement, préparez un mélange maître à deux fois la concentration (2 x) en diluant les composés expérimentaux ou les solvants témoins comme le PBS ou le DMSO dans un volume suffisant de milieu d'infection pour tous les réplicats, plus un. Notez que la concentration de solvant doit être identique dans les témoins expérimentaux et les témoins sans vecteur. Par exemple, si vous utilisez de l'IBT à une microlitre par millilitre dans du DMSO, vous devez également utiliser du DMSO seul à une microlitre par mL comme témoin de vecteur. Immédiatement après l'ajout du virus, ajoutez 50 microlitres de milieu d'infection contenant les composés de traitement et de contrôle souhaités dans chaque puits, comme indiqué sur cette illustration.

Remarquez que chaque composé est testé avec TrpV et PLV en triple, et qu'un témoin véhicule est réalisé en triple pour chaque virus.

Incuber pendant 18 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, fixer les cellules en ajoutant 100 microlitres de paraformaldéhyde à 8 % dans le milieu d'infection déjà présent dans chaque puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 15 minutes, à l'abri de la lumière.

Ajouter deux fois le volume ou 8 % de paraformaldéhyde directement dans le milieu d'infection permettra d'éviter la formation d'aérosols viraux, phénomène qui pourrait survenir si le virus non fixé était directement renversé dans la coupelle de déchets. Une fois 15 minutes écoulées, éliminer le fixateur en renversant la plaque dans la coupelle de déchets. Puis ajouter 100 microlitres de PBS à température ambiante et sceller la plaque avec un film adhésif optiquement transparent.

Si la plaque ne doit pas être lue immédiatement, conservez-la à quatre degrés Celsius. Veillez à ramener les plaques scellées à température ambiante avant de les lire afin d'éviter que la condensation ne fausse les mesures du spectrophotomètre.

Pour quantifier la croissance virale, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la fluorescence en point final. Effectuez quatre mesures par puits en utilisant des réglages de gain optimisés pour chaque canal. Le lecteur de plaques TECAN Infinite M 1000 Pro utilisé dans cette vidéo exporte les mesures brutes de fluorescence vers un fichier Microsoft Excel. Une fois les mesures obtenues, ouvrez les données brutes dans Microsoft Excel.

Ensuite, copiez et collez les données dans une feuille de résultats GraphPad Prism. Dans Prism, déterminez la moyenne des puits TrpV et PLV en réplicats. Soustrayez ensuite la valeur moyenne des puits PLV de la valeur moyenne des puits TrpV pour chaque traitement. Pour faciliter la comparaison avec des expériences répétées, normalisez les données en divisant les données corrigées du fond par les puits TrpV contenant uniquement le véhicule. Une fois l'expérience répétée plusieurs fois, effectuez une analyse de variance à un facteur (ANOVA à un sens) et un test post-hoc de comparaisons multiples afin de déterminer si l'un des traitements diffère significativement du traitement DMSO pour chaque canal. Pour réaliser des dosages cinétiques, infectez les cellules et appliquez les composés testés comme précédemment ; il est particulièrement important d'utiliser un milieu tamponné afin de maintenir un pH adéquat sans ajout de 5 % de dioxyde de carbone.

Après avoir scellé la plaque avec un film adhésif, placez-la dans la chambre du lecteur de plaques équilibrée à 37 degrés Celsius. Une attention particulière doit être portée à maintenir les plaques constamment à 37 degrés Celsius. Cela permettra d'éviter tout stress cellulaire excessif et la condensation.

Régler manuellement le gain du lecteur de plaques afin d'éviter la saturation des points temporels ultérieurs. Enregistrer des mesures horaires pendant huit à 24 heures après l'infection et normaliser comme pour le dosage en point final. Les points temporels individuels peuvent être analysés pour leur signification statistique à l'aide de méthodes similaires à celles décrites précédemment pour le dosage en point final.

Pour comparer les points d'inhibition, des cellules HeLa infectées par le virus vaccinal TrpV ou PLV ont été cultivées en présence d'inhibiteurs de virus de la variole, à savoir l'AraC, l'IBT, la rifampicine et le ST 246. Ce film en accéléré montre l'expression séquentielle des fluorophores vert, rouge et bleu au cours de la croissance virale dans les cellules témoins. Lorsque l'infection a lieu en présence du médicament AraC, qui bloque la réplication de l'ADN, le fluorophore précoce vert est produit comme précédemment, mais la production intermédiaire et tardive des fluorophores rouge et bleu n'a pas lieu.

L’analyse quantitative par spectrométrie a révélé une augmentation de 210 % de l’expression des gènes précoces, mais une absence d’expression intermédiaire et tardive dans les cellules traitées avec l’araC. Les cellules infectées en présence d’IBT, qui favorise selon toute vraisemblance la poursuite de la transcription, présentaient des niveaux d’expression intermédiaire et tardive représentant respectivement 24,7 % et 2,9 % des niveaux témoins. Les cellules infectées en présence de ST246 et de rifampicine, qui inhibent l’expression après les gènes tardifs durant l’assemblage et la maturation des virions, ne présentaient pas de différence significative par rapport aux témoins. Ces résultats sont compatibles avec le mécanisme d’action connu de ces composés et suggèrent que le virus rapporteur TrpV peut être utilisé pour identifier l’étape spécifique d’inhibition virale de composés inconnus.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'inclure des témoins appropriés. Cela permet non seulement une normalisation correcte des résultats, mais aussi de déterminer un mécanisme potentiel pour votre composé expérimental. N'oubliez pas que le travail avec le virus de la vaccine peut être extrêmement dangereux ; portez toujours des équipements de protection individuelle adéquats et suivez les techniques recommandées de confinement de niveau BSL-2.