Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l'expression des gènes

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les étapes où l’expression des gènes viraux est affectée par le traitement chimique. Pour ce faire, les cellules de culture tissulaire sont plaquées et incubées. Jusqu’à ce qu’elles soient confluentes, les cellules sont infectées soit par un virus de la vaccine à triple rapport, soit par un virus de la liste des promoteurs de contrôle.

Ensuite, des composés de traitement sont appliqués et les cellules sont incubées pendant 18 heures pour permettre la réalisation de toutes les étapes de l’expression des gènes viraux. La fluorescence résultante est ensuite déterminée à l’aide d’un lecteur de plaques. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent les changements relatifs d’expression causés par les composés expérimentaux.

Le principal avantage de cette technique par rapport à l’infection par un virus qui exprime une seule protéine de fusion fluorescente est que cet ensemble de virus fournit plus d’informations sur l’endroit du cycle de vie viral où agit un médicament thérapeutique spécifique, ce qui donne un aperçu de son mécanisme d’action. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour identifier les inhibiteurs de l’infection virale, elle peut également être utilisée pour détecter le stade de réplication virale terminé dans des lignées cellulaires non permissives ou dans des cribles d’ARNi, en identifiant les facteurs cellulaires nécessaires à l’infection. Ce protocole utilise le virus triple ou virus rapporteur à plusieurs étages Trip V, dans lequel trois fluoro-quatre spectralement distincts sont incorporés dans le génome double brin d’un seul virus de la veine.

Chacun de ces quatre fluoros est contrôlé par un promoteur bien défini spécifique à l’étape. Le promoteur C 11 R pour l’expression précoce de Vénus, le promoteur intermédiaire G eight R pour l’expression de m cherry et le promoteur F 17 R pour l’expression tardive de l’étiquette BFP. Ainsi, Venus m Cherry et l’étiquette BFP sont exprimés séquentiellement au cours de l’infection.

Comme contrôle, un virus de liste de promoteurs est utilisé. La PLV contient une construction veineuse similaire à celle du Trip V.Cependant, elle n’a pas de promoteur de transcription fonctionnel. Commencez ce protocole en vous dissociant.

Les cellules Hela cultivées sur une boîte de 10 centimètres diluent les cellules dans le milieu de croissance à environ 2,0 fois 10 à la cinquième cellules par millilitre. Ensuite, distribuez 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à paroi noire, incubez les cellules pendant 24 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient confluentes pour diluer les virus, décongelez Tripp V et PLV dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius, puis sonicez pendant cinq minutes pour désagréger. Ensuite, diluez le stock de virus à 1,0 fois 10 au septième PFU par millilitre dans un milieu d’infection qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius pour infecter les cellules.

Remplacez le milieu de culture par 50 microlitres du virus dilué dans chaque puits pour chaque traitement. Infectez trois puits de réplication avec Tripp V et trois autres avec PLV pour tenir compte de la fluorescence de fond spécifique à chaque traitement. Ceci est défini comme le temps est égal à zéro heure.

Après l’infection, par exemple, faites 350 microlitres pour 6 96 puits de 50 microlitres chacun. Chaque composé doit être dilué à deux fois la concentration finale, car il sera ajouté au volume d’inoculum déjà dans le puits. Ensuite, pour chaque condition de traitement, faites un mélange double en diluant les composés expérimentaux ou les solvants de contrôle des véhicules tels que le PBS ou le DMSO dans une quantité suffisante de milieu d’infection pour toutes les répétitions.

De plus, notez que la concentration de solvant dans vos contrôles expérimentaux et vectoriels uniquement doit être la même. Par exemple, si vous utilisez IBT à raison d’un microlitre par mil dans le DMSO, vous devez également utiliser le DMSL seul à raison d’un microlitre par mil comme contrôle vectoriel. Immédiatement après l’ajout du virus, ajoutez 50 microlitres de milieu infectieux contenant les composés de traitement et de contrôle souhaités à chaque puits, comme indiqué dans cette illustration.

Il est à noter que chaque composé est testé en trois exemplaires avec Tripp V et PLV, et qu’un contrôle du véhicule est exécuté en trois exemplaires pour chaque virus. Incuber pendant 18 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius plus 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres d’aldéhyde paraforme à 8 % au milieu infectieux déjà dans chaque puits, incubez la plaque à température ambiante pendant 15 minutes à l’abri de la lumière.

L’ajout de deux x ou 8 % d’aldéhyde paraforme directement dans le milieu d’infection empêchera l’aérosolisation du virus, qui pourrait autrement se produire si le virus non fixé est directement inversé dans la boîte à déchets. Après 15 minutes, retirez le fixateur en inversant la plaque dans le bac à déchets. Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS à température ambiante et scellez la plaque avec un film adhésif optiquement transparent.

Si la plaque ne doit pas être lue immédiatement, rangez-la à quatre degrés Celsius. Assurez-vous de ramener les plaques scellées à température ambiante avant de les lire afin d’éviter que la condensation ne déforme les mesures du spectrophotomètre. Pour quantifier la croissance du virus, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la fluorescence finale.

Prenez quatre mesures par puits à l’aide des paramètres de gain optimisés pour chaque canal. Le lecteur de plaques TAN Infinite M 1000 Pro utilisé dans cette vidéo exporte les mesures de fluorescence brutes vers un fichier Microsoft Excel. Une fois les relevés obtenus, ouvrez les données brutes dans Microsoft Excel.

Ensuite, copiez-le et collez-le dans un prisme GraphPad. La feuille de résultats dans Prism détermine la moyenne des puits Tripp v et PLV répliqués. Soustrayez ensuite la valeur moyenne de la PLV de la valeur moyenne de Tripp V pour chaque traitement.

Pour faciliter la comparaison avec les expériences répétées, normalisez les données en divisant les données d’arrière-plan soustraites par le véhicule uniquement Tripp v Wells. Une fois qu’une expérience a été répétée plusieurs fois, effectuez une analyse de variance unidirectionnelle ou un test NOVA unidirectionnel et un post-test de comparaison multiple pour déterminer si l’un des traitements est significativement différent du traitement DMSO. Pour que chaque canal puisse effectuer des tests cinétiques infecter les cellules et appliquer les composés d’essai comme auparavant, il est particulièrement important d’utiliser un milieu tamponné pour maintenir un pH approprié sans ajout de 5 % de dioxyde de carbone.

Après avoir scellé la plaque avec un film adhésif, placez-la dans la chambre de lecture de plaque à 37 degrés Celsius. Des précautions particulières doivent être prises pour maintenir les plaques constamment à 37 degrés Celsius. Cela évitera une contrainte et une condensation excessives des cellules.

Réglez manuellement le gain du lecteur de plaques pour éviter la saturation des points temporels ultérieurs. Obtenez des lectures horaires pendant huit à 24 heures après l’infection et normalisez-vous. En ce qui concerne le dosage du point final, la signification statistique de chaque point temporel peut être analysée à l’aide de méthodes similaires à celles du test du point final décrit précédemment.

Pour comparer les points d’inhibition, les cellules heela infectées par le TPV ou le PLV vaccine ont été cultivées en présence des inhibiteurs du virus de la variole, Aris, CIBT, rifampicine et ST 2 46. Cette fois, le film en lapse montre l’expression séquentielle des quatre fluoros verts, rouges et bleus pendant la croissance du virus dans les cellules de contrôle lorsqu’elles sont infectées en présence du médicament bloquant la réplication de l’ADN aee. Le fluoro quatre vert précoce est produit comme précédemment, mais la production intermédiaire et tardive de fluorescence rouge et bleue ne se produit pas.

L’analyse quantitative par spectrométrie a montré une augmentation de 210 % de l’expression précoce des gènes, mais une absence d’expression intermédiaire et tardive dans les cellules traitées avec des cellules C infectées en présence d’IBT, ce qui favoriserait l’IBT. Les cellules infectées en présence de ST 2 46 et de rifampicine inhibent l’expression tardive après l’expression tardive des gènes pendant l’assemblage et la maturation du virion n’étaient pas significativement différentes de celles des témoins. Ces résultats sont cohérents avec le mécanisme d’action compris de ces composés et suggèrent que le virus rapporteur Trip V peut être utilisé pour identifier le stade spécifique d’inhibition virale pour des composés inconnus.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’inclure les contrôles appropriés. Cela permet non seulement de normaliser correctement les résultats, mais aussi de déterminer un mécanisme potentiel pour votre composé expérimental. N’oubliez pas que travailler avec le virus de la vaccine peut être extrêmement dangereux, portez toujours un équipement de protection individuelle approprié et suivez les recommandations BSL.

Deux techniques de confinement.