Un modèle de souris pour l'inflammation chronique induite par pathogène sur les sites locaux et systémiques

L’objectif général du protocole suivant est d’examiner les effets de l’infection microbienne sur l’inflammation chronique in vivo à l’aide d’un modèle animal physiologiquement pertinent. Ceci est réalisé en infectant oralement des souris avec porphyromonas gingivalis pour induire une inflammation chronique locale et systémique. L’IRM peut ensuite être utilisée pour mesurer la progression de l’inflammation systémique chez les animaux vivants, tandis que la perte osseuse inflammatoire locale est évaluée par micro-tomodensitométrie et que les plaques d’athérosclérose peuvent être visualisées par coloration des lipides sur le visage après le sacrifice.

En fin de compte, les différences de volume osseux alvéolaire et l’accumulation de plaques d’athérosclérose entre les souris infectées par P gingivalis et les témoins non infectés peuvent être mesurées sur la base de l’analyse micro-CT et de la coloration des lipides du visage respectivement. L’avantage majeur de notre modèle animal est qu’il permet d’examiner à la fois l’hôte et les mécanismes pathogènes impliqués dans l’inflammation chronique et plus particulièrement sur des sites éloignés de l’infection. Ainsi, vous pouvez examiner les sites systémiques ainsi que les sites locaux d’infection en utilisant des souris transgéniques et des mutants bactériens définis.

Ce modèle peut aider à identifier les aspects clés de la pathogenèse, tels que l’hôte et les facteurs microbiens contribuant à la maladie. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des mécanismes spécifiques de l’hôte et des agents pathogènes impliqués dans la perte osseuse inflammatoire et l’athérosclérose, elle peut également être adaptée à d’autres modèles murins de maladies, notamment la polyarthrite rhumatoïde, le diabète et le cancer. Il s’agit de la plateforme d’IRM à haut champ de l’Université de Boston, et mon boursier postdoctoral Ning va démontrer certains aspects de l’imagerie de la souris : commencer par tracer des tiges congelées de pêcher gingivalis 3 81 sur des plaques de gélose sanguine anaérobie, et incuber les plaques dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius.

Après trois à cinq jours, utilisez la plaque d’organismes cultivés pour inoculer cinq millilitres de cultures liquides de bouillon d’infusion cerveau-cœur, ou BHI. Après une croissance pendant la nuit, transférez les cultures dans 45 millilitres de BHI et incubez les cultures en anaérobie pendant 18 à 24 heures supplémentaires. À mi-log, récoltez les bactéries par centrifugation pendant 10 minutes à 7 000 GS et à température ambiante, puis remettez soigneusement en suspension la pastille dans cinq millilitres de PBS avec une pipette sérologique après avoir lavé la pastille trois fois dans 50 millilitres de PBS Resus, la pastille dans PBS de telle sorte qu’une dilution de un à 10 de la culture ait une densité optique de 1,0 à 660 nanomètres.

Ensuite, suffisamment de carboxyméthylcellulose de viscosité moyenne pour obtenir une solution de 2 % en poids par rapport au volume et ajoutez lentement la carbox éthylcellulose à la suspension bactérienne tout en vortex pour éviter l’agglutination. Pour mesurer la progression de l’inflammation en C deux. Placez d’abord un support d’animal avec la tête de la souris en position couchée dans une sonde verticale de 30 millimètres et dans l’alésage vertical d’un scanner TMRI de 11,7 mm.

Après les processus d’oscillation et de calage, utilisez une séquence rare pour acquérir des images scoutes le long de trois orientations orthogonales afin de créer des images coronales axiales et sagittales. Ensuite, après avoir utilisé l’angiographie par résonance magnétique à basse résolution pour confirmer que les images acquises se trouvent dans la région cible, effectuez une angiographie par résonance magnétique à haute résolution de l’artère innominée avec une séquence d’écho de gradient 3D non évaluée en utilisant les paramètres suivants. Une épaisseur de dalle de 1,5 centimètre, un angle de retournement de 45 degrés, un temps de répétition de 20 millisecondes, un temps d’écho de 2,2 millisecondes, un champ de vision de 1,5 par 1,5 par 1,5 centimètres, une matrice de 1 28 par 1 28 par 1 28 et un nombre de la moyenne de quatre pour un temps de balayage total d’environ 22 minutes.

Sélectionnez ensuite une image axiale de l’artère nominale 0,3 à 0,5 millimètre sous la bifurcation sous-clavière pour l’analyse du retour sur investissement afin de épingler l’aorte, en gardant le tissu couvert de PBS à tout moment. Commencez par poser l’aorte en position anatomique avec les bulbes de l’aorte à gauche. Placez ensuite des épingles mnucines temporaires consécutivement aux cinq endroits suivants, le haut de l’aorte sous la troisième branche de l’arc, au milieu de l’aorte descendante près de l’extrémité inférieure de l’aorte descendante et au-dessus de la branche de l’artère fémorale.

Ensuite, utilisez des ciseaux à ressort extra fins pour couper le côté gauche de l’aorte en commençant par la branche gauche de l’artère fémorale jusqu’en dessous de la branche la plus basse de l’aorte ascendante. Ensuite, après avoir coupé et épinglé chaque branche pour exposer sa surface interne, continuez à épingler le tissu. Toute la surface intérieure est exposée et clairement visible d’en haut et exempte d’interférences visuelles des goupilles.

Pour colorer les lipides et quantifier les lésions, commencez par recouvrir l’aorte épinglée avec une solution de Sudan four ou de O rouge d’huile fraîchement préparée. Après 50 minutes, lavez le tissu avec de l’isopropanol à 70 % pendant une à cinq minutes, puis rincez doucement l’aorte avec de l’eau doublement distillée jusqu’à ce que l’eau qui se détache du tissu ne soit plus rouge. Ensuite, couvrez l’aorte avec du PBS et placez une règle à côté du tissu pour aider à l’étalonnage de l’image.

Capturez ensuite des images du tissu avec la caméra haute résolution fixée à un microscope de dissection, en enregistrant les images sous forme de fichiers TIFF. Enfin, dans un logiciel d’analyse d’images, tracez manuellement chaque surface intimale pour déterminer sa surface. Ensuite, pour calculer la surface de la lésion à l’aide du seuillage automatique des couleurs, définissez un seuil pour chaque image afin de définir une intensité de couleur qui distingue les lésions des zones normales.

Le pourcentage de la surface intimale couverte par des lésions athéroscléreuses peut ensuite être calculé dans cette expérience représentative avec des souris infectées par p gingivalis. L’analyse volumétrique a révélé que les souris infectées présentent une perte osseuse significative par rapport aux témoins non infectés. L’inspection visuelle de l’hémi-maxillaire reconstruit illustre une augmentation de la surface exposée des racines molaires chez les souris infectées par rapport aux témoins sujets à l’athérosclérose.

Une souris déficiente en POE. P gingivalis induit une inflammation chronique qui entraîne une perte osseuse alvéolaire et un dépôt de plaque inflammatoire dans le sinus aortique et une artère nominale dès 24 heures après la dernière infection, qui peut être surveillée chez les souris vivantes par IRM in vivo en série à divers moments après l’infection, comme dans ces images représentatives. De plus, sur le visage, les mesures de l’aorte à quatre taches du Soudan démontrent que l’infection à p gingivalis augmente considérablement le dépôt de lipides et les zones lésionnelles sur la surface intimale.

De plus, l’analyse immunohistochimique des lésions du sinus aortique révèle une augmentation de l’infiltration de microphages et une expression élevée du récepteur immunitaire inné de type Toll receptor deux IV chez les souris infectées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de tenir compte de la durée expérimentale à laquelle l’inflammation est évaluée qui doit s’aligner correctement sur la progression de la maladie. Après l’imagerie par résonance magnétique d’autres, d’autres méthodes telles que la position debout du visage ou la chimie de l’histo immunitaire peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la charge athéroscléreuse globale ou les composants cellulaires de la lésion.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension d’un modèle de souris in vivo, qui vous permet d’examiner à la fois l’hôte et les facteurs pathogènes impliqués dans l’inflammation chronique. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation appropriée de l’EPI doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.