Name: Le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et In Vivo Techniques déchantillonnage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez les techniques bronchoscopiques pour étudier les interactions hôte-pathogène dans un modèle bovin d'infection respiratoire. Cette méthode permet l'inoculation intrabronchique, le lavage bronchoalvéolaire et les biopsies pulmonaires répétées chez le veau.

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Les auteurs sont très reconnaissants envers le ministère fédéral de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) d’Allemagne pour le financement de leurs travaux. De plus, les auteurs remercient Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolf Rücknagel et tous les autres collègues travaillant dans l’équipe de l’animalerie (FLI, Allemagne) pour leur assistance technique avec les bronchoscopies. Ils sont très reconnaissants envers Maria-Christina Haase (FLI, Allemagne) pour son aide dans la fourniture de littérature. De plus, les auteurs souhaitent exprimer leur gratitude à la Dre Angela Berndt (FLI, Allemagne) et à Nicolette Bestul (Université du Wisconsin-River Falls) pour la lecture critique du manuscrit.

Déclaration d&#39;éthique Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec le droit européen et national pour le soin et l&#39;utilisation des animaux. Le protocole a été approuvé par le Comité d&#39;éthique de l&#39;expérimentation animale et la protection des animaux dans l&#39;Etat de Thuringe, Allemagne (numéro de permis: 04-004/11). Toutes les expériences ont été réalisées sous la supervision de l&#39;agent institutionnel autorisé pour la protection des animaux. Bronchoscopie était strictement réalisée sous anesthésie générale. Au cours de l&#39;étude, tous les efforts ont été faits pour minimiser l&#39;inconfort ou la souffrance. Remarques générales Les techniques décrites ont été mises au point pour veaux d&#39;environ 6 à 8 semaines d&#39;âge, pesant environ 60-80 kg. Pour l&#39;utilisation dans d&#39;autres espèces animales ou grands veaux différence d&#39;âge et le poids corporel, les techniques doivent être adaptées à la taille et le poids et prendre en compte l&#39;anatomie du poumon de l&#39;espèce animale particulière. Tousle matériel utilisé doit être stérile. Chlamydia psittaci est une bactérie zoonotique qui peuvent causer des maladies respiratoires et générale chez l&#39;homme. Le C. non-aviaire souche psittaci DC15 utilisée dans le présent protocole doit être traitée sous le niveau de biosécurité 2. Tout travail avec le pathogène et avec des animaux infectés doivent être effectués de porter un équipement de protection individuelle, comme un masque, une combinaison étanche de démarrage, des bottes de caoutchouc et des gants. Le port d&#39;un appareil respiratoire approprié est d&#39;une grande importance, étant donné que la voie naturelle de l&#39;infection à C. psittaci est aerogen. Emballage et étiquetage des échantillons doit être la preuve désinfectant puisque toutes les choses doivent être traités avec un désinfectant efficace contre Chlamydia selon les instructions du fabricant avant de quitter l&#39;unité de logement des animaux. 1. Préparation de l&#39;animal pour la bronchoscopie <ol><li> Déterminer le poids du veau pour le dosage des anesthésiques. </li><li> Placez une intraveineuse (IV) l&#39;accès in la veine jugulaire gauche. </li><li> En premier lieu, injecter lentement xylazine (0,2 mg / kg de poids corporel) pendant environ 30 secondes, puis, après une sédation se produit, injecter de la kétamine (2,0 mg / kg de poids corporel). </li><li> Soulever l&#39;animal sur la table et placer en décubitus latéral droit. Une fois l&#39;animal est positionné correctement sur la table, vérifiez si l&#39;accès IV est toujours en place et réajuster si nécessaire. Pendant l&#39;anesthésie, consultez régulièrement le réflexe de la paupière pour déterminer la profondeur de l&#39;anesthésie. </li><li> Une fois l&#39;animal respire régulièrement, avoir quelqu&#39;un tirer la langue et étirer le cou. Placer un spéculum de tube métallique dans la bouche de l&#39;animal, à l&#39;aide de légers mouvements de rotation. Poussez le spéculum avant sous le contrôle de la vue, en utilisant une lampe de poche, jusqu&#39;à la larynx est visible. </li><li> Maintenir l&#39;anesthésie pendant toute la procédure endoscopique par injection d&#39;un bolus de 7 mg de xylazine et de kétamine à 70 mg selon les besoins. </li></ol> . 2 inoculation (Sites inoculation: Figure 1) </p&gt; <ol><li> Préparer trois seringues avec des inoculum, contenant 1, 2, et 5 ml de l&#39;inoculum. </li><li> Insérez un tube de Teflon dans le canal de travail de l&#39;endoscope. Le tube ne doit pas dépasser de la pointe de l&#39;endoscope. </li><li> Insérez l&#39;endoscope à travers le spéculum de métal. Légers réajustements du spéculum peut être nécessaire pour permettre le passage du larynx. La trachée bronches, qui bifurque à droite, permet d&#39;aligner l&#39;image sur le moniteur. </li><li> Fixer la seringue avec 5 ml d&#39;inoculum à l&#39;extrémité du tube en Téflon. Naviguer dans le tube dans les branches où l&#39;inoculum est déposé et appliquer la quantité souhaitée (du poumon droit: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml et 1,0 ml; Poumon gauche: cranialis Lobus, Pars cranialis : 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Fixer la seringue avec 1 &amp;# 160; ml d&#39;inoculum dans le tube, puis accédez à la trachée des bronches et du dépôt de l&#39;inoculum (de cranialis Lobus, Pars caudalis: 1,0 ml). Il est utile d&#39;aborder toujours les localisations dans le même ordre. </li><li> Retirer l&#39;endoscope et le spéculum. </li><li> Pulvériser 1 ml de l&#39;inoculum dans chaque narine d&#39;un actionneur. </li><li> Apportez le dos de l&#39;animal à l&#39;écurie et le placer en décubitus ventral pour se réveiller. Ne pas laisser l&#39;animal sans surveillance ou en compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternal. L&#39;écurie de récupération devrait être de l&#39;air conditionné, car la capacité de l&#39;animal pour la thermorégulation est réduite sous anesthésie générale. REMARQUE: Les premiers signes cliniques devraient se produire sur 24-36 h après l&#39;inoculation, en fonction de l&#39;agent pathogène utilisé. </li></ol> . 3 procédures d&#39;échantillonnage (Sites d&#39;échantillonnage: Figure 2) <ol><li> Préparer l&#39;animal comme décrit dans les étapes 01.01 à 01.06. </li><li> Lavage bronchoalvéolaire <ol><li> Placez 5 seringues contenant chacune 20 ml de soluté isotonique stérile, dans un bain-marie et les laisser se réchauffer à environ 38 ° C. </li><li> Insérer un cathéter de lavage dans le canal de travail de l&#39;endoscope, puis insérez l&#39;endoscope dans le spéculum de métal et naviguer vers l&#39;avant dans la bronche principale du poumon gauche jusqu&#39;à la position &quot;coin&quot; est atteint lorsque l&#39;endoscope ne peut être poussé plus loin en avant. </li><li> Un après l&#39;autre, attachent les seringues avec la solution de NaCl chaud au cathéter de lavage, instiller le liquide et aspirer directement. Le fluide de lavage broncho-alvéolaire doit être stocké dans des bouteilles en verre siliconé et mise sur de la glace immédiatement après récupération pour empêcher les macrophages alvéolaires de se fixer à la surface du verre. Notez la fois la quantité de solution saline et instillé la quantité de fluide récupéré. </li><li> Retirer le cathéter de lavage du canal de travail. </li></ol></li><li> Brossage bronchique<ol><li> Naviguez dans l&#39;endoscope à l&#39;emplacement d&#39;échantillonnage désirée, dans le protocole décrit c&#39;est le Bifurcatio trachées. </li><li> Couvrir la brosse avec le tube avant de l&#39;insérer dans le canal de travail de l&#39;endoscope jusqu&#39;à ce que la pointe du pinceau apparaît sur l&#39;écran. </li><li> Poussez la brosse avec le tube de plastique avant d&#39;environ 5 cm et de découvrir à partir du tube en plastique en appuyant sur la poignée, puis accédez à l&#39;emplacement qui doit être brossé. </li><li> Frottez les appels épithéliales en poussant doucement et en tirant la brosse d&#39;avant en arrière lors de la navigation de l&#39;endoscope pour assurer le contact entre la brosse et la paroi de la bronche. Arrêtez de frotter lorsque le saignement se produit. Couvrir la brosse avec le tube avant de la retirer du canal de travail. </li><li> Préparez-vous à cinq frottis sur des lames de microscope en roulant doucement le pinceau sur la diapositive. Fixer les frottis dans du méthanol froid pendant 10 min, l&#39;air sec et conserver à -20 ° C. </li><li> La brosse peut être rincé à l&#39;divers médias, selon le but des cellules prélevées. Si vous prenez plusieurs brossages avec le même pinceau, assurez-vous de ne rincer dans les médias qui ne sont pas irriter la muqueuse. </li></ol></li><li> Biopsie pulmonaire transbronchique <ol><li> Naviguez dans l&#39;endoscope à l&#39;emplacement d&#39;échantillonnage désirée, dans le protocole décrit c&#39;est le caudalis Pars des cranialis Lobus. Avant d&#39;insérer la pince à biopsie dans le canal de travail ouvert et fermer une couple de fois pour s&#39;assurer qu&#39;il fonctionne bien. </li><li> Poussez les pinces à biopsie dans la branche caudale des bronches trachée jusqu&#39;à ce qu&#39;une légère résistance se produit. Tirez 2-3 cm, ouvrir la pince, faire avancer d&#39;environ 2 cm, fermer la pince, retirer et retirer la pince du canal de travail. Cela nécessite un peu de pratique. </li><li> Retirez délicatement le tissu de la pince à biopsie, en utilisant une aiguille ou une petite pince. Selon l&#39;utilisation ultérieure du tissu, de la stocker dans nitr liquidedu fibrinogène ou un milieu de fixation approprié. Cela devrait se faire juste après l&#39;enlèvement de prévenir les processus d&#39;autolyse. </li></ol></li><li> Le traitement post-opératoire <ol><li> Apportez le dos de l&#39;animal à l&#39;écurie et le placer en décubitus ventral pour se réveiller. Ne pas laisser l&#39;animal sans surveillance ou en compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternal. L&#39;écurie de récupération devrait être de l&#39;air conditionné, car la capacité de l&#39;animal pour la thermorégulation est réduite sous anesthésie générale. </li><li> Surveillance de l&#39;animal de près les signes de pneumothorax pour le 24 heures suivant. Fournir des aliments et de l&#39;eau douce lorsque l&#39;animal a retrouvé la pleine conscience. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Procédé endoscopique d&#39;inoculation a été développé et diverses méthodes d&#39;échantillonnage bronchoscopiques été adapté pour être utilisé dans les grands animaux dans des conditions expérimentales. Les techniques décrites sont faciles à apprendre, même pour les examinateurs ayant peu d&#39;expérience en endoscopie. Le processus de la bronchoscopie est peu invasive et sans effets indésirables associés aux méthodes de l&#39;inoculation, ainsi que les méthodes d&#39;échantillonnage décrites (BAL, biopsie pulmonaire transbronchique, brossage bronchique), n&#39;a jamais été vu dans aucun des animaux. Les complications associées à des biopsies pulmonaires transbronchiques chez l&#39;homme sont les saignements et de pneumothorax 48, aucune n&#39;a été vu dans les veaux qui ont subi cette procédure. La biopsie pulmonaire transbronchique prend plus de temps et nécessite plus de matériel que la méthode transcutanée, mais il est moins invasive et ne porte pas le risque d&#39;infection de la plaie. La méthode endoscopique contrôlée visuellement de inoculation permet le dépôt d&#39;une quantité définie de l&#39;agent pathogène dans des sites spécifiques du poumon. Ainsi, il résulte des constatations cliniques et pathologiques très cohérentes dans tous les animaux inoculés 32-34. Toutefois, il ne ressemblait pas à toutes les caractéristiques de l&#39;infection naturelle chez les veaux. Dans un modèle de C. respiratoires infection psittaci, la technique décrite d&#39;inoculation a conduit à des lésions pulmonaires associées aux sites de placement de l&#39;agent pathogène 34, alors que, dans les infections acquises naturellement veaux développent habituellement une pneumonie des lobes apicaux. Ce fait doit être pris en compte lors de l&#39;interprétation de la pertinence des résultats expérimentaux dans le contexte des infections pulmonaires acquises naturelles chez les bovins. Vidéoendoscopique BAL permet l&#39;échantillonnage d&#39;une zone définie du poumon. A des fins expérimentales, il s&#39;agit d&#39;un avantage par rapport à l&#39;utilisation d&#39;un cathéter nasal en aveugle. En raison de l&#39;anatomie du poumon bovin, le cathéter inséré aveuglément serait pousséeed au lobe diaphragmatique droite dans la plupart des cas 53,54 et l&#39;examinateur n&#39;a aucune influence sur la zone du poumon qui est lavaged. Un autre avantage de la BAL endoscopique chez les veaux anesthésiés en décubitus latéral est le taux de récupération moyen élevé de fluide inculqué de plus de 80%. Une comparaison avec d&#39;autres études révèlent que, en position debout, les veaux sous sédation, une reprise de 133,3 ± 1,6 ml 46 et 127,13 ± 3,53 ml 45 après l&#39;instillation de 240 ml de liquide dans le lobe caudal est rapporté. Chez les veaux sédation en décubitus sternal 51% du fluide insufflé peut être récupéré à partir du lobe cranial et 62% par rapport au lobe caudal 43. Cela signifie que la moitié environ du liquide instillé a pu être retrouvé en position verticale du mollet. Selon la quantité de BALF nécessaire à la poursuite préparation de l&#39;échantillon, cela pourrait ne pas laisser suffisamment de matière pour effectuer toutes les expériences souhaitées. BAL chez les bovins a été utilisé par de nombreux groupes de recherche et de nombreuxdifférents paramètres ont été examinés dans différentes conditions. La plupart des auteurs ont effectué le lavage des lobes basilaires 43,45,46, mais la quantité de liquide utilisée pour le lavage diffère entre les groupes de recherche. Cela conduit à des incohérences dans la dilution des cellules récupérées, de protéines et d&#39;autres substances, ce qui rend difficile de comparer les résultats de différentes publications. Par conséquent, l&#39;utilisation chez les bovins, il est recommandé de lavage avec cinq fractions de 20 ml (soit 100 ml au total) corps chaud, une solution saline isotonique, qui sont récupérés immédiatement après l&#39;instillation. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un cathéter à un lavage avec un grand diamètre (par exemple&gt; 2 mm), le volume de chaque fraction a besoin d&#39;être augmenté légèrement, en fonction de la quantité de fluide qui reste dans le cathéter. L&#39;anatomie très segmenté du poumon bovine conduit à une limitation méthodique; les résultats obtenus à partir d&#39;une partie du poumon peuvent ne pas être vrai pour le reste du poumon. Comme il n&#39;y a pas d&#39;contrôle de la vue de l&#39;ensemble de la zone du poumon sondé par biopsie transbronchique et lavage, l&#39;examinateur ne peut pas savoir si les zones échantillonnées étaient en bonne santé ou malade. Par conséquent, il est très important d&#39;échantillonner les endroits où l&#39;agent pathogène a été inoculé avant afin d&#39;avoir un taux de récupération élevé de l&#39;agent pathogène et d&#39;avoir une plus grande possibilité d&#39;échantillonner les zones pulmonaires malades. Une autre limite est le risque anesthésique augmenté chez les animaux de mauvais état clinique. Les méthodes décrites ne doivent être utilisés dans les modèles d&#39;intensité légère à modérée de la maladie de maintenir la charge pour les animaux aussi bas que possible. L&#39;anesthésie générale chez les ruminants doivent toujours être aussi court que possible, comme le développement de gaz dans le rumen augmente le risque anesthésique dans ces espèces. Les animaux doivent être placés en décubitus ventral immédiatement après la bronchoscopie pour permettre l&#39;écoulement du gaz mis au point et doivent être étroitement surveillés jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient complètement récupéré de l&#39;anesthésie. En outre, les techniques décrites ne sont pas Suitable pour échantillonner des intervalles de moins de 24 heures. Le protocole décrit peut être adapté à d&#39;autres agents infectieux. Inoculation endoscopique de divers agents pathogènes a été décrite, par exemple C. psittaci 32-34, haemolytica 38-40,42, Haemophilus somni 55, et le virus de la diarrhée virale bovine 44. En outre, les sites de dépôt des agents pathogènes dans les poumons peuvent être adaptées au modèle désiré. Lors du choix des sites d&#39;échantillonnage, quelques faits importants doivent être pris en compte: les sites (i) d&#39;échantillonnage doivent être choisis en fonction de l&#39;emplacement de l&#39;inoculation et sur les résultats attendus pathologiques. (Ii) Lorsque l&#39;autopsie doit être effectuée, il faut veiller à laisser suffisamment de zones pulmonaires non échantillonnées pour ex échantillonnage in vivo. (Iii) l&#39;emplacement des sites d&#39;échantillonnage doivent être choisis de telle sorte qu&#39;ils puissent être atteints avec l&#39;équipement. En particulier pour biopsie pulmonaire transbronchique, il existe des limitations dues à la longueur des pinces à biopsie. (Iv) Til commande l&#39;échantillonnage est important, brossage bronchique et une biopsie pulmonaire transbronchique pourraient conduire à un saignement mineur, qui contaminerait l&#39;BALF. Par conséquent, BALF doit toujours être obtenu en premier. Lors de l&#39;utilisation du protocole chez d&#39;autres espèces, l&#39;anatomie du poumon spécifique de l&#39;espèce doit être prise en compte.

Les valeurs des grandes modèles animaux en recherche biomédicale En recherche biomédicale interdisciplinaire moderne, les modèles animaux sont encore indispensables pour élucider les interactions complexes - en matière de santé ou d&#39;un état de maladie - dans les organismes de mammifères. Malgré 17 prix Nobel étant attribués à des scientifiques qui ont étudié les bovins, les chevaux, les moutons, ou de la volaille en tant que modèles pour la recherche biomédicale 1, de nos jours la grande majorité des expériences sur les animaux sont entrepris avec des rongeurs, alors que moins de 1% des études travaillent avec des animaux domestiques ou le bétail. Les petits animaux offrent de nombreux avantages pratiques (c. low cost, malléabilité génétique, haut débit, la disponibilité de nombreux génétique, et les outils et les kits immunologiques), et des modèles murins génétiquement modifiés sont généralement acceptées pour effectuer des études mécanistiques découverte voies moléculaires particulières. Dans la recherche biomédicale de systèmes complexes, til pertinence biologique et l&#39;utilité clinique de modèles de souris est de plus en plus discutable. Ils pourraient être trompeuse et assumer le risque d&#39;une simplification excessive de la complexité biologique 2-9. En raison de particularités inter-espèces, aucune espèce animale simples seront complètement refléter la situation humaine, et l&#39;utilisation de plus d&#39;un modèle qui semble être bénéfique dans une approche interdisciplinaire de la recherche biomédicale. Dans le cadre de la médecine translationnelle, les grands animaux offrent la possibilité de servir de modèles comparatifs fournir des résultats présentant un intérêt biologique élevé de double usage à la fois humaine et la santé animale 1. Remarquablement, le génome humain est plus étroitement ressemblait par le génome bovin que par le génome des rongeurs de laboratoire. Il a également été confirmé récemment que, par rapport à d&#39;autres taxa, le génome de la souris est beaucoup plus réarrangé 10-12. Dans une conception de l&#39;étude complexe, l&#39;utilisation de l&#39;élevage offre la uniqoccasion ue du commerce intra-individuelles, des études à long terme par la collecte répétée d&#39;une variété d&#39;échantillons in vivo d&#39;un-et-le-même individuum sans sacrifier l&#39;animal. Par conséquent, des modifications fonctionnelles, inflammatoires et morphologiques peuvent être suivis dans le même sujet sur ​​une certaine période de temps 13. Le bovine poumon comme un modèle respiratoire approprié En raison du nombre élevé de différences significatives dans l&#39;anatomie du poumon, de la physiologie respiratoire et d&#39;immunologie pulmonaire, les souris ne reproduisent pas de nombreux aspects physiopathologiques importants de la maladie pulmonaire humain. Ceci doit être pris en compte lors de leur utilisation en tant que modèles animaux de maladie respiratoire 2,9,14-16. Bien que les particularités de l&#39;anatomie et la structure existent pour chaque poumon chez les mammifères, les caractéristiques fonctionnelles (c. volumes pulmonaires, les débits d&#39;air et la mécanique respiratoire) sont mieux comparables entre les humains adultes et les veaux en raison de poids de corps similaires(50-100 kg). Les spécifiques aux espèces caractéristiques du poumon bovin se résument comme suit: le poumon gauche se compose de deux lobes (de cranialis de Lobus, qui est divisé en deux segments, et lobus caudalis), tandis que le poumon droit est composé de quatre lobes (lobus cranialis, lobus medius, lobus caudalis, et lobus accessorius). Contrairement à l&#39;anatomie du poumon de la plupart des autres mammifères, la bronche droite des branches du lobe crânien directement à partir de la face latérale droite de la trachée. En ce qui concerne subgross anatomie, le poumon de bovin présente un haut degré de lobulation et un pourcentage élevé de tissu interstitiel 17,18 conduisant à une compliance pulmonaire spécifique relativement faible et une résistance du tissu pulmonaire supérieure 19. Par conséquent, l&#39;activité respiratoire nécessaire est relativement élevé par rapport à d&#39;autres espèces 20,21. Le degré élevé de lobulation conduit à une forte indépendance des segments. Ainsi, inflammatory processus sont limités par des cloisons de tissu conjonctif, et les segments malades et sains sont souvent à l&#39;intérieur du même lobe. En raison du manque de voies aériennes collatérales, le poumon de bovin est particulièrement adapté pour refléter les dysfonctionnements pulmonaires obstructives 13. En ce qui concerne le système vasculaire dans les poumons bovine, les petites artères pulmonaires montrent des couches musculaires lisses très importants. Par conséquent, le veau peut également servir de modèle animal bien établi de l&#39;hypertension pulmonaire ou vasculaire remodelage 22-24. En ce qui concerne les infections respiratoires, les maladies d&#39;origine naturelle existent dans le bétail qui partagent de nombreuses similitudes avec la maladie comparable chez l&#39;homme. Des exemples typiques sont la tuberculose bovine 25, le virus respiratoire syncytial (VRS) chez les veaux des infections 26-28, ou des infections de chlamydia naturellement acquis 29. Ainsi, les grands modèles animaux ne se ressemblent de près la situation dans l&#39;hôte naturel. Par conséquent, elles sont plus useful pour étudier les interactions hôte-pathogène et la physiopathologie complexe de la maladie correspondante des êtres humains 30,31. Comme un modèle biologiquement pertinente respiratoire infection à Chlamydia psittaci, les veaux ont été choisis car les bovins représentent hôtes naturels de cet agent pathogène 32-35. Les informations obtenues à partir de ce modèle, par rapport à la pathogenèse de la maladie ou les voies de transmission possibles entre les animaux et les humains, aidera à élargir notre connaissance des impacts dans le bétail et l&#39;homme. Le modèle peut également aider à vérifier que les options thérapeutiques alternatives généralement reconnus et pour l&#39;élimination de la pulmonaire C. infections psittaci, ce qui est, encore une fois, de l&#39;intérêt pour la médecine humaine et vétérinaire. Techniques appliquées aux échantillons et Disponible auprès de l&#39;appareil respiratoire bovine Cet article décrit et illustre les techniques et les méthodes de diagnostic applicable pour le poumon de bovin et utilisé dans notre modèle pour évaluer à la fois les effets de l&#39;agent pathogène sur le poumon de mammifère et l&#39;efficacité de l&#39;intervention thérapeutique. Bronchoscopie a été réalisée en médecine humaine depuis les années 1960 et est considéré comme une procédure sûre 36. Chez les veaux, la bronchoscopie expérimentale a été décrite en 1968 pour la première fois 37. L&#39;application intrabronchique des agents pathogènes a été suggéré par Potgieter et al. Comme une méthode fiable pour produire une maladie des voies respiratoires inférieures chez les veaux 38 et est maintenant une méthode très répandue dans la recherche bovine 34,39,40. Intrabronchique inoculation d&#39;une quantité définie de l&#39;agent pathogène sous contrôle vidéoendoscopique permet un placement sélectif de l&#39;agent infectieux dans le poumon. Cela conduit à des résultats cliniques et pathologiques cohérentes dans tous les animaux 34 et permet l&#39;échantillonnage ciblé des régions pulmonaires qui devraient être modifiées en raison de l&#39;exposition de l&#39;agent pathogène. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) est un indicateur bien décrit la présence et la sévérité de l&#39;inflammation du poumon. Le lavage broncho-alvéolaire (BAL) est une procédure standard en médecine humaine pour le diagnostic d&#39;une variété de maladies respiratoires 41. Chez les bovins vivants, BAL a été introduit par Wilkie et Markham à la fin des années soixante-dix du siècle dernier 42. Il a été considéré comme une technique sûre et reproductible pour étudier les voies respiratoires inférieures des bovins. En raison de l&#39;absence de données suffisantes sur les paramètres de BALF chez les animaux sains, en 1988 Pringle et al. Effectuée BAL sur des veaux en bonne santé avec un fibroscope souple. Les auteurs ont également souligné la nécessité de normaliser les protocoles BAL dans des conditions expérimentales d&#39;acquérir des résultats comparables 43. BAL est encore utilisé comme une méthode d&#39;échantillonnage in vivo chez les veaux de 44 à 46. Brossage bronchique est couramment utilisé en médecine humaine en tant queoutil de diagnostic pour déguster lésions néoplasiques ou pour l&#39;analyse microbiologique 36. Pour des fins de recherche, des cultures de cellules primaires de cellules épithéliales récoltées par brossage cytologique peuvent être obtenus 47. Chez les bovins, l&#39;utilisation de brossages bronchiques pour l&#39;analyse microbiologique a été décrit pour caractériser l&#39;environnement microbien du poumon 43. Biopsie pulmonaire transbronchique fournit des échantillons de tissus pulmonaires et est un outil diagnostique utile pour diffuser les maladies pulmonaires chez les humains. Pneumothorax iatrogène et une hémorragie liée à l&#39;intervention sont les complications associées à cette technique. Leur incidence est signalé comme étant à moins de un pour cent 48 chez les patients humains. Biopsie pulmonaire transbronchique n&#39;est pas une méthode courante pour l&#39;utilisation chez les bovins, en raison du coût élevé de l&#39;équipement nécessaire et le temps nécessaire pour obtenir des biopsies. Au lieu de cela, des biopsies transcutanées pulmonaires sont plus pratiques dans des conditions réelles de 49 à 51.

<table><tbody><tr><td>Vidéo-endoscope vétérinaire</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Allemagne</td><td>PV-SG 22&ndash ; 140</td><td>Diamètre : 9 mm, canal de travail : 2,2 mm, longueur de travail 140 cm</td></tr><tr><td>Cathéter de lavage</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Allemagne</td><td></td><td>Diamètre : 2 mm ; longueur : 180 cm, adaptateur Luer-lock</td></tr><tr><td>Actionneur</td><td>WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Allemagne</td><td>32660</td><td>longueur : 60 mm</td></tr><tr><td>Pince à biopsie</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Allemagne</td><td>REF 60180LT</td><td>1,8 mm, dentelé, ovale</td></tr><tr><td>Omnifix 20 ml, Luer-Lock</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td>4617207V</td><td></td></tr><tr><td>Brosse de cytologie</td><td>mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Allemagne</td><td>110240-10</td><td>longueur de travail 180 cm, longueur de la brosse : 15 mm, diamètre 1,8 mm</td></tr><tr><td>iv acess</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hambourg, Allemagne</td><td>370-211</td><td>Diamètre : 1,2 mm ; longueur : 43 mm</td></tr><tr><td>Rompun 2 % (xylazine)</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Allemagne</td><td></td><td>0,2 mg/kg poids corporel</td></tr><tr><td>Kétamine 10 % (kétamine)</td><td>bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Allemagne</td><td></td><td>2,0 mg/kg de poids corporel</td></tr><tr><td>Solution saline isotonique</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td></td><td></td>3200950</tr><tr><td>SUB 6 bain d’eau</td><td>CLF analytische Laborger&auml ; te GmbH, Emersacker, Allemagne</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tube métallique</td><td>speculum n/a</td><td>n/a</td><td>diamètre : 3,5 cm ; longueur : 35 cm</td></tr><tr><td>Lampe de poche</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles en verre siliconé</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>siliconé avec Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix Luer 5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Allemagne</td><td>4616057V</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons d’étanchéité</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hambourg, Allemagne</td><td>900-3057</td><td></td></tr><tr><td>Inoculum</td><td></td><td>n/a</td><td>pathogène dilué dans un tampon de 8 ml</td></tr></tbody></table>

le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et<em&gt; in vivo</em&gt; techniques d&#39;échantillonnage

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Il ya une recherche constante de modèles animaux de substitution dans la recherche de la médecine respiratoire. Selon le but de la recherche, de grands animaux comme modèles de maladie pulmonaire ressemblent souvent la situation du poumon humain beaucoup mieux que les souris font. Travailler avec de grands animaux offre aussi l&#39;occasion de goûter le même animal plusieurs reprises sur une certaine ligne de temps, ce qui permet des études à long terme sans pour autant sacrifier les animaux. L&#39;objectif était d&#39;établir des méthodes d&#39;échantillonnage in vivo dans pour l&#39;utilisation dans un modèle de bovin d&#39;un infection à Chlamydia psittaci respiratoire. L&#39;échantillonnage doit être effectué à divers points de temps dans chaque animal au cours de l&#39;étude, et les échantillons doivent être appropriés pour étudier la réponse de l&#39;hôte, ainsi que de l&#39;agent pathogène dans des conditions expérimentales. Bronchoscopie est un outil diagnostique utile en médecine humaine et vétérinaire. Il est une procédure sûre et peu invasive. Cette article décrit l&#39;inoculation intrabronchique des veaux ainsi que les méthodes d&#39;échantillonnage pour les voies respiratoires inférieures. Vidéoendoscopique, inoculation intrabronchiale conduit à des résultats cliniques et pathologiques très cohérentes dans tous les animaux inoculés et est, par conséquent, bien adapté pour une utilisation dans des modèles de maladie infectieuse du poumon. Les méthodes d&#39;échantillonnage décrites sont lavage broncho-alvéolaire, brossage bronchique et une biopsie pulmonaire transbronchique. Tous ces éléments sont des outils de diagnostic précieux en médecine humaine et pourraient être adaptés à des fins expérimentales à veaux âgés de 6-8 semaines. Les échantillons obtenus ont été adaptés à la fois pour la détection et la caractérisation d&#39;agents pathogènes de la gravité de l&#39;inflammation pulmonaire chez l&#39;hôte.

Évolution de la maladie L&#39;effet de l&#39;agent pathogène sur la santé des animaux peut être évaluée par un examen clinique. Dans nos modèles d&#39;infection des voies respiratoires, les animaux ont été examinés deux fois par jour et des observations cliniques ont été enregistrés en utilisant un système de notation. Informations complémentaires a été capturé par l&#39;exécution d&#39;autres méthodes in vivo dans d&#39;échantillonnage, par exemple, la collecte de sang et de prélèvements ou de mesure de la fonction pulmonaire. Des examens pathologiques ont été effectuées à différents points de temps après l&#39;inoculation pour décrire l&#39;état d&#39;avancement de l&#39;infection de 32 à 34. BALF Taux de récupération Le débit du fluide inculqué de récupération était 83,05 ± 4,58% (moyenne ± écart-type). détection de pathogènes La remise en culture de l&#39;agent pathogène peut être effectuée à partir de brossages bronchiques. En outre, le criblage par PCR des différents échantillons est possible de détecter l&#39;agent pathogène, par exemple tibiopsie ssu, échantillon de brosse de cytologie, BALF cellules 52 ou pharyngée écouvillon. La visualisation de l&#39;agent pathogène est possible en effectuant immunohistochimie de coupes congelées de biopsies de poumon et de préparations de sédimentation des cellules BALF (Figure 3). Dans les expériences précédentes, la PCR d&#39;échantillons de sang et d&#39;écouvillons (conjonctival, les selles, nasales) ont été réalisées pour caractériser la propagation et l&#39;excrétion de l&#39;agent pathogène 32. Marqueurs de l&#39;inflammation locale des tissus pulmonaires Dans le BALF, différents paramètres de l&#39;inflammation pulmonaire peuvent être étudiés. Le nombre total de cellules et le pourcentage de neutrophiles augmente généralement lorsque l&#39;inflammation pulmonaire est présent. Pour la différenciation des cellules, des préparations de sédimentation de BALF cellules peuvent être colorées selon Giemsa et différenciées en utilisant immersion dans l&#39;huile (figure 4). Proportions cellulaires et liquide du BALF sont séparées par centrifugation (300 x g, 20 min). Le BALF-Surnageant contient divers marqueurs qui changent au cours des processus inflammatoires dans les poumons et peuvent être étudiés dans des conditions expérimentales. Les exemples sont des protéines totales et 29,34 eicosanoïdes. Une vue d&#39;ensemble schématique de la poursuite de l&#39;utilisation potentielle des échantillons décrits est représenté sur la figure 5. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Schéma du poumon de bovin avec des sites d&#39;inoculation (en jaune). Les nombres indiquent l&#39;ordre dans lequel l&#39;inoculum est administré dans l&#39;autre bronches. R: right; L: gauche. Poumon droit: 1 Lobus medius: 0,5 ml, 2 Lobus accessorius: 0,5 ml, 3 Lobus caudalis: 0,5 ml et 1,0 ml 4; Poumon gauche: cranialis Lobus, <strong&gt; 5 Pars cranialis: 0,5 ml, 6 Pars caudalis: 0,5 ml, 7 Lobus caudalis: 1,5 ml, 8 cranialis de Lobus, Pars caudalis: 1,0 ml. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig2highres.jpg" width="500" /> . Figure 2 Schéma du poumon bovin avec des sites d&#39;inoculation (de jaune) et les sites d&#39;échantillonnage:. Lavage broncho-alvéolaire (bleu), brossage bronchique (vert), et la biopsie pulmonaire (orange) Notez que tous les échantillons sont obtenus à partir des régions où le pathogène a été déposé avant. R: droite, L: gauche. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. A) la biopsie pulmonaire à partir d&#39;un veau inoculé avec Chl<html> amydia psittaci 4 jours après l&#39;inoculation (dpi), b) les sédiments cellulaire de BALF partir d&#39;un veau inoculé avec C. psittaci 9 dpi. Marquage immunohistochimique pour les chlamydiae. Les inclusions (flèches) sont présentes dans le poumon (a) et dans des macrophages alvéolaires (b). Hematoxylin de contraste. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Des sédiments cellulaire de BALF partir d&#39;un veau inoculés avec C. psittaci 9 dpi. macrophages alvéolaires (n) sont le type cellulaire prédominant dans la BALF. Le montant des granulocytes neutrophiles (*) augmente lorsque les processus inflammatoires sont présents. Modifié coloration Pappenheim. ES.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figure 5. Des méthodes possibles pour la préparation de l&#39;échantillon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51557/51557fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Cet article décrit les techniques endoscopiques dans les poumons de bovins dans des conditions expérimentales, c&#39;est à dire l&#39;inoculation bronchoscopie guidée, lavage broncho-alvéolaire, brossage bronchique et une biopsie pulmonaire transbronchique.

Le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et<em&gt; In Vivo</em&gt; Techniques d&#39;échantillonnage

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les interactions hôte-pathogène dans un modèle bovin d'infection respiratoire. Cela est réalisé en induisant une infection respiratoire chez des veaux par inoculation intrabronchique avec le pathogène d'intérêt au cours de la maladie. L'animal est échantillonné à plusieurs reprises par lavage bronchoalvéolaire.Ensuite, des brossages bronchiques et des biopsies pulmonaires transbronchiques sont obtenus afin de récupérer respectivement des cellules épithéliales et des échantillons de tissu alvéolaire ou pulmonaire. En fin de compte, une maladie respiratoire spécifique à un agent pathogène peut être confirmée, par exemple, par des modifications inflammatoires dans le lavage, par la cytologie, et par la détection immunohistochimique de l'agent pathogène. Dans les biopsies pulmonaires transbronchiques, le principal avantage de ce modèle animal de grande taille par rapport à d'autres modèles animaux existants et aux rongeurs est que, dans notre modèle, nous sommes en mesure d'étudier l'évolution de la maladie sur une longue période chez le même individu grâce à des prélèvements répétés.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions hôte-pathogène in vivo, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que des pathogènes alternatifs ou des espèces hôtes différentes. L'anesthésie devra être maintenue et l'échantillonnage sera assisté par une pêcheuse, qui est vétérinaire dans notre laboratoire. Avant de commencer la procédure, remplir trois seringues avec un, deux et cinq millilitres de l'inoculum, respectivement.Ensuite, une fois l'anesthésie confirmée, sortez la langue de l'animal et tendez le cou. Puis, à l'aide de légers mouvements rotatifs, insérez un spéculum métallique dans la bouche du veau. Poussez le spéculum vers l'avant sous contrôle visuel, en utilisant une lampe de poche pour déterminer le moment où le larynx devient visible.Ensuite, insérez un tube en téflon dans le canal opérationnel d'un endoscope. Le tube ne doit pas dépasser de l'extrémité de l'endoscope. Insérez l'endoscope à travers le spéculum.De légers ajustements du spéculum peuvent être nécessaires pour permettre le passage de l'endoscope. Pour franchir le larynx, utilisez la bronche trachéale, qui se dirige vers le côté droit du poumon, afin d'aligner correctement l'image sur l'écran. Ensuite, fixez la seringue contenant cinq millilitres d'inoculum à l'extrémité du tube en téflon.Introduisez le tube dans les branches où l'inoculum sera déposé et administrez la quantité appropriée d'inoculum. Ensuite, fixez la seringue contenant un millilitre d'inoculum au tube. Dirigez-vous vers le bronche trachéal et déposez l'inoculum dans la branche coddle.Retirer l'endoscope et le spéculum. Puis fixer la dernière seringue à un actionneur et pulvériser un millilitre de l'inoculum dans chaque narine. Remettre l'animal dans son box en position ventrale pour qu'il reprenne connaissance.Le box de récupération doit être climatisé. Étant donné que la capacité de thermorégulation de l'animal est réduite sous anesthésie générale, prélevez les échantillons valvulaires au moment souhaité en réchauffant cinq seringues contenant chacune 20 millilitres de sérum physiologique stérile dans un bain d'eau à 38 degrés Celsius. Insérez ensuite un cathéter de lavage dans le canal opérationnel du fibroscope, puis introduisez le fibroscope dans le spéculum métallique.Ensuite, avancez dans la bronche principale du poumon gauche jusqu'à atteindre la position en coin, où l'endoscope ne peut plus être poussé plus avant. Puis, une par une, fixez les seringues contenant la solution chaude de chlorure de sodium au cathéter de lavage afin d'instiller le liquide et de l'aspirer directement.Conserver le liquide de lavage broncho-alvéolaire dans des flacons en verre siliconés placés sur de la glace immédiatement après sa récupération, afin d'empêcher les macrophages alvéolaires de s'attacher à la surface du verre. Noter à la fois le volume de sérum physiologique instillé et celui du liquide récupéré. Ensuite, retirer le cathéter de lavage du canal opérateur pour recueillir les cellules épithéliales.Ensuite, dirigez l'endoscope vers l'emplacement souhaité pour l'échantillonnage. Par exemple, dans cette expérience, jusqu'à la bifurcation trachéale ; lorsque l'endoscope est en place, recouvrez un brossette bronchique avec le tube et insérez-le dans le canal opératoire de l'endoscope jusqu'à ce que l'extrémité de la brosse apparaisse sur l'écran. Poussez la brosse et le tube en plastique d'environ cinq centimètres vers l'avant.Ensuite, poussez la poignée de la brosse pour l’extraire du tube en plastique. Une fois la brosse en position, dirigez-la vers l’endroit à brosser. Puis, poussez et tirez doucement la brosse en avant et en arrière tout en manœuvrant l’endoscope.Pour assurer le contact entre la brosse et la paroi du bronche afin de prélever les cellules épithéliales. Arrêter le frottement en cas de saignement. Ensuite, recouvrir la brosse avec le tube et la retirer du canal de travail.Faites rouler doucement les poils recouverts de cellules épithéliales sur jusqu'à cinq lames de microscope et fixez les frottis dans du méthanol froid pendant 10 minutes. Ensuite, après avoir laissé les lames sécher à l'air libre, conservez-les à moins 20 degrés Celsius pour effectuer une biopsie pulmonaire transbronchique. Puis, dirigez l'endoscope vers l'emplacement d'échantillonnage souhaité.Par exemple, la pars Alis des LOAs crans dans cette expérience, avant d'insérer la pince à biopsie dans le canal de travail, ouvrez et fermez-la plusieurs fois pour en assurer le bon fonctionnement, puis poussez la pince dans la branche coddle de la trachée bronchique jusqu'à ce qu'une légère résistance se produise. Maintenant, retirez-la de deux à trois centimètres et ouvrez la pince. Poussez à nouveau la pince vers l'avant, d'environ deux centimètres, puis refermez-la.Reculer et retirer la pince du canal opératoire. Utiliser une aiguille pour retirer soigneusement le tissu des forceps à biopsie et le conserver dans un milieu de fixation approprié afin d'éviter la formation de processus autolytiques. Enfin, après avoir laissé le veau se remettre dans son box, surveiller à nouveau l'animal pour détecter un éventuel pneumothorax pendant les 24 heures suivantes, en lui fournissant de la nourriture et de l'eau fraîche.Lorsque l'animal a retrouvé une conscience complète, des coupes congelées de biopsies pulmonaires transbronchiques peuvent être colorées par immunohistochimie. Pour visualiser l'agent pathogène inoculé, observer les inclusions brunes de chlamydia dans le poumon de cet animal ayant reçu une inoculation de chlamydia C quatre jours avant le prélèvement. La coloration immunohistochimique des cellules de lavage permet de visualiser les agents pathogènes intracellulaires.Par exemple, sur cette image, des inclusions chlamydiennes sont présentes dans les macrophages alvéolaires prélevés sur un veau. Neuf jours après une inoculation intrabronchique avec Chlamydia, des CTAC peuvent être observées. Les cellules de lavage broncho-alvéolaire peuvent être différenciées par coloration cytologique.Les macrophages alvéolaires constituent le type cellulaire prédominant dans le liquide de lavage. Toutefois, le nombre de granulocytes neutrophiles augmente en présence de processus inflammatoires. Une fois maîtrisée, l'inoculation peut être réalisée en 10 à 15 minutes et le prélèvement en 20 à 30 minutes, si les manipulations sont effectuées correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une inoculation intrabronchique chez les veaux, ainsi que comment prélever du liquide bronchoalvéolaire, des prélèvements par brosse bronchique et des biopsies pulmonaires transbronchiques chez l'animal anesthésié.

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Lavage broncho-alvéolaire (LBA) pour la recherche; obtention adéquate rendement de l&#39;échantillon

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Le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et In Vivo Techniques déchantillonnage (Vidéo) | JoVE Journal

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