Le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les interactions hôte-pathogène dans un modèle bovin d'infection respiratoire. Cela est réalisé en induisant une infection respiratoire chez des veaux par inoculation intrabronchique avec le pathogène d'intérêt au cours de la maladie. L'animal est échantillonné à plusieurs reprises par lavage bronchoalvéolaire.

Ensuite, des brossages bronchiques et des biopsies pulmonaires transbronchiques sont obtenus afin de récupérer respectivement des cellules épithéliales et des échantillons de tissu alvéolaire ou pulmonaire. En fin de compte, une maladie respiratoire spécifique à un agent pathogène peut être confirmée, par exemple, par des modifications inflammatoires dans le lavage, par la cytologie, et par la détection immunohistochimique de l'agent pathogène. Dans les biopsies pulmonaires transbronchiques, le principal avantage de ce modèle animal de grande taille par rapport à d'autres modèles animaux existants et aux rongeurs est que, dans notre modèle, nous sommes en mesure d'étudier l'évolution de la maladie sur une longue période chez le même individu grâce à des prélèvements répétés.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions hôte-pathogène in vivo, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que des pathogènes alternatifs ou des espèces hôtes différentes. L'anesthésie devra être maintenue et l'échantillonnage sera assisté par une pêcheuse, qui est vétérinaire dans notre laboratoire. Avant de commencer la procédure, remplir trois seringues avec un, deux et cinq millilitres de l'inoculum, respectivement.

Ensuite, une fois l'anesthésie confirmée, sortez la langue de l'animal et tendez le cou. Puis, à l'aide de légers mouvements rotatifs, insérez un spéculum métallique dans la bouche du veau. Poussez le spéculum vers l'avant sous contrôle visuel, en utilisant une lampe de poche pour déterminer le moment où le larynx devient visible.

Ensuite, insérez un tube en téflon dans le canal opérationnel d'un endoscope. Le tube ne doit pas dépasser de l'extrémité de l'endoscope. Insérez l'endoscope à travers le spéculum.

De légers ajustements du spéculum peuvent être nécessaires pour permettre le passage de l'endoscope. Pour franchir le larynx, utilisez la bronche trachéale, qui se dirige vers le côté droit du poumon, afin d'aligner correctement l'image sur l'écran. Ensuite, fixez la seringue contenant cinq millilitres d'inoculum à l'extrémité du tube en téflon.

Introduisez le tube dans les branches où l'inoculum sera déposé et administrez la quantité appropriée d'inoculum. Ensuite, fixez la seringue contenant un millilitre d'inoculum au tube. Dirigez-vous vers le bronche trachéal et déposez l'inoculum dans la branche coddle.

Retirer l'endoscope et le spéculum. Puis fixer la dernière seringue à un actionneur et pulvériser un millilitre de l'inoculum dans chaque narine. Remettre l'animal dans son box en position ventrale pour qu'il reprenne connaissance.

Le box de récupération doit être climatisé. Étant donné que la capacité de thermorégulation de l'animal est réduite sous anesthésie générale, prélevez les échantillons valvulaires au moment souhaité en réchauffant cinq seringues contenant chacune 20 millilitres de sérum physiologique stérile dans un bain d'eau à 38 degrés Celsius. Insérez ensuite un cathéter de lavage dans le canal opérationnel du fibroscope, puis introduisez le fibroscope dans le spéculum métallique.

Ensuite, avancez dans la bronche principale du poumon gauche jusqu'à atteindre la position en coin, où l'endoscope ne peut plus être poussé plus avant. Puis, une par une, fixez les seringues contenant la solution chaude de chlorure de sodium au cathéter de lavage afin d'instiller le liquide et de l'aspirer directement.

Conserver le liquide de lavage broncho-alvéolaire dans des flacons en verre siliconés placés sur de la glace immédiatement après sa récupération, afin d'empêcher les macrophages alvéolaires de s'attacher à la surface du verre. Noter à la fois le volume de sérum physiologique instillé et celui du liquide récupéré. Ensuite, retirer le cathéter de lavage du canal opérateur pour recueillir les cellules épithéliales.

Ensuite, dirigez l'endoscope vers l'emplacement souhaité pour l'échantillonnage. Par exemple, dans cette expérience, jusqu'à la bifurcation trachéale ; lorsque l'endoscope est en place, recouvrez un brossette bronchique avec le tube et insérez-le dans le canal opératoire de l'endoscope jusqu'à ce que l'extrémité de la brosse apparaisse sur l'écran. Poussez la brosse et le tube en plastique d'environ cinq centimètres vers l'avant.

Ensuite, poussez la poignée de la brosse pour l’extraire du tube en plastique. Une fois la brosse en position, dirigez-la vers l’endroit à brosser. Puis, poussez et tirez doucement la brosse en avant et en arrière tout en manœuvrant l’endoscope.

Pour assurer le contact entre la brosse et la paroi du bronche afin de prélever les cellules épithéliales. Arrêter le frottement en cas de saignement. Ensuite, recouvrir la brosse avec le tube et la retirer du canal de travail.

Faites rouler doucement les poils recouverts de cellules épithéliales sur jusqu'à cinq lames de microscope et fixez les frottis dans du méthanol froid pendant 10 minutes. Ensuite, après avoir laissé les lames sécher à l'air libre, conservez-les à moins 20 degrés Celsius pour effectuer une biopsie pulmonaire transbronchique. Puis, dirigez l'endoscope vers l'emplacement d'échantillonnage souhaité.

Par exemple, la pars Alis des LOAs crans dans cette expérience, avant d'insérer la pince à biopsie dans le canal de travail, ouvrez et fermez-la plusieurs fois pour en assurer le bon fonctionnement, puis poussez la pince dans la branche coddle de la trachée bronchique jusqu'à ce qu'une légère résistance se produise. Maintenant, retirez-la de deux à trois centimètres et ouvrez la pince. Poussez à nouveau la pince vers l'avant, d'environ deux centimètres, puis refermez-la.

Reculer et retirer la pince du canal opératoire. Utiliser une aiguille pour retirer soigneusement le tissu des forceps à biopsie et le conserver dans un milieu de fixation approprié afin d'éviter la formation de processus autolytiques. Enfin, après avoir laissé le veau se remettre dans son box, surveiller à nouveau l'animal pour détecter un éventuel pneumothorax pendant les 24 heures suivantes, en lui fournissant de la nourriture et de l'eau fraîche.

Lorsque l'animal a retrouvé une conscience complète, des coupes congelées de biopsies pulmonaires transbronchiques peuvent être colorées par immunohistochimie. Pour visualiser l'agent pathogène inoculé, observer les inclusions brunes de chlamydia dans le poumon de cet animal ayant reçu une inoculation de chlamydia C quatre jours avant le prélèvement. La coloration immunohistochimique des cellules de lavage permet de visualiser les agents pathogènes intracellulaires.

Par exemple, sur cette image, des inclusions chlamydiennes sont présentes dans les macrophages alvéolaires prélevés sur un veau. Neuf jours après une inoculation intrabronchique avec Chlamydia, des CTAC peuvent être observées. Les cellules de lavage broncho-alvéolaire peuvent être différenciées par coloration cytologique.

Les macrophages alvéolaires constituent le type cellulaire prédominant dans le liquide de lavage. Toutefois, le nombre de granulocytes neutrophiles augmente en présence de processus inflammatoires. Une fois maîtrisée, l'inoculation peut être réalisée en 10 à 15 minutes et le prélèvement en 20 à 30 minutes, si les manipulations sont effectuées correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une inoculation intrabronchique chez les veaux, ainsi que comment prélever du liquide bronchoalvéolaire, des prélèvements par brosse bronchique et des biopsies pulmonaires transbronchiques chez l'animal anesthésié.