Démonstration de protéolytique activation du canal sodique épithélial (ENaC) en combinant les mesures actuelles avec la détection de fragments de clivage

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier l'effet des protéases sur le canal sodique épithélial, ou ENaC, exprimé de façon hétérologue dans des ovocytes zap lava. Cette étude est réalisée en mesurant d'abord le courant total sensible à l'amorote dans un ovocyte. Après avoir laissé l'ovocyte se rétablir, celui-ci est exposé à une protéase et le courant est mesuré à nouveau.

Ensuite, en parallèle, les ovocytes sont biotinylés et soumis à un immunoblot afin de surveiller l'apparition de fragments de clivage de la gamma-ENaC à la surface cellulaire ; les résultats obtenus démontrent un lien causal entre le clivage du canal et son activation, sur la base d'une combinaison de la technique de blocage de tension à deux électrodes et de l'approche par biotine. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que la mesure non planifiée, est que la cellule peut être exposée à une protéase ou à d'autres agents pharmacologiques entre les deux mesures, pendant une durée variable, dans un petit volume de solution d'essai. Deux jours après l'isolement des cellules zap lava et leur injection de CN selon le protocole décrit dans le texte, utilisez du ND 96 pour remplir une seringue d'un système de perfusion par gravité, et du ND 96 contenant de l'amide pour remplir une deuxième seringue.

Après avoir fixé les seringues à 50 centimètres au-dessus de la chambre de bain, allumez une source lumineuse froide halogène de 150 watts et réglez-la à 10 centimètres au-dessus de la chambre de bain pour cellules, afin d'assurer une bonne visualisation au microscope binoculaire. Activez l'aspiration et placez le tube d'aspiration en face de l'adaptateur du tube de superfusion dans la chambre de bain pour ovocyte. Ensuite, à l'aide du dispositif de régulation du débit par gravité IV, ajustez la vitesse de superfusion de chaque solution à trois à cinq millilitres par minute. Puis, à l'aide d'un adaptateur, reliez les tubes de superfusion à la chambre de bain pour ovocyte en utilisant une micropipette polarisée pour tirer des capillaires en verre afin d'obtenir des diamètres de pointe inférieurs à un micromètre.

Ensuite, utilisez une solution de chlorure de potassium à trois molaire pour les remplir environ au quart. Insérez les capillaires dans les porte-électrodes de l'électrode de courant et de l'électrode de tension, puis, à l'aide des micromanipulateurs, placez-les dans du ND 96 contenant une solution d'amide à deux micromolaire. Pour mesurer les courants totaux sensibles à l'amide, commencez par régler le bouton de décalage VM à zéro afin de neutraliser le potentiel de l'électrode de tension, et le bouton de décalage VE à zéro pour neutraliser l'électrode de courant.

Placer un site de l'uretère distal dans la chambre de bain et à proximité de l'électrode de détection de tension. Ensuite, à l'aide des deux microélectrodes, piquer délicatement le site de l'uretère distal, régler le potentiel de maintien de l'amplificateur à moins 60 millivolts et enclencher l'enregistreur graphique. Puis mettre en marche la solution contenant l'amide.

Ensuite, commencez l'enregistrement et, si nécessaire, ajustez le gain. Une fois que le courant mesuré atteint un plateau stable, passez à la solution exempte d'amide. Lorsqu'un plateau de courant est atteint, rétablissez la perfusion avec la solution contenant l'amide. Puis, lorsque le courant du site UO retrouve le courant de base initial, désactivez le clampage de tension et retirez délicatement les électrodes pour permettre la reformation de la membrane plasmique aux sites d'insertion.

Placer le site Uoc dans un puits d'une plaque de 96 puits contenant 100 à 150 microlitres de solution ND 96 exempte de protéase pendant cinq minutes avant de transférer le site UOC vers une solution contenant de la protéase ou vers une solution témoin sans protéase. Trente minutes après l'incubation, répéter la mesure du courant, éliminer les ovocytes défectueux au microscope stéréo et préparer l'anti 96 avec et sans la protéase appropriée. Préparer des pipettes passées en les étiquetant et en chauffant brièvement leurs extrémités afin d'éviter d'endommager les ovocytes.

Remplir chaque puits d'une plaque à six puits avec 2,5 millilitres de ND 96 à température ambiante ou de ND 96 contenant une protéase. Ajouter ensuite 30 ovocytes par puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir ajouté 2,5 millilitres de ND 96 dans les puits d'une nouvelle plaque à six puits, transférer chaque groupe d'ovocytes dans un puits rempli de ND 96.

Déplacer les cellules successivement dans deux puits supplémentaires contenant du ND 96 afin d'éliminer toute protéase résiduelle, puis les incuber dans le dernier puits pendant cinq minutes. Préparer la biotine dans le tampon d'élution à la biotine selon le protocole indiqué dans le texte. Après avoir placé chaque groupe d'ovocytes dans un puits contenant 2,5 millilitres de tampon d'élution à la biotine, incuber pendant 15 minutes avec agitation douce. Ensuite, après avoir placé chaque groupe d'ovocytes dans un puits contenant 2,5 millilitres de tampon d'arrêt, afin de bloquer la réaction de biotinylation, les transférer dans un deuxième puits de tampon d'arrêt et les incuber pendant cinq minutes.

Avec une agitation douce, transférer chaque groupe d'ovocytes dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et, à l'aide d'un millilitre de tampon de lyse complété par des inhibiteurs de protéases, lyser les ovocytes en les faisant passer à travers une aiguille de calibre 27. Centrifuger les lysats pendant 10 minutes à 1500 × g. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant du TRITON X-100 et du MP-40, puis incuber les tubes sur de la glace pendant 20 minutes. Après avoir équilibre 100 microlitres de billes de sépharose par groupe d'ovocytes, les ajouter aux solutions protéiques contenant du détergent et incuber les échantillons avec rotation lente pendant une nuit à quatre degrés Celsius, tout en vortexant répétitivement les tubes pour dissoudre les protéines.

Le lendemain, centrifuger les échantillons pendant trois minutes à 1500 fois G. Transférer alors le surnageant dans un nouveau tube pour détecter les fragments de clivage de l'actine à la surface cellulaire. Récupérer les échantillons du gel en utilisant du tampon de lyse pour laver les billes trois fois, puis ajouter du tampon d'échantillonnage SDS-PAGE 2X. Après avoir centrifugé les échantillons pendant trois minutes à 20 000 fois G, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et le transférer dans de nouveaux tubes microcentrifuges.

Analyser les échantillons par immunobuvardage selon le protocole décrit pour étudier si la sérine protéase plasmine peut activer les courants dépendant de l'ENaC. La variation de IE (delta IE) des cytes exprimant individuellement l'ENaC a été déterminée avant et après une incubation de 30 minutes des cytes dans une solution sans protéase ou contenant de la plasmine. En utilisant la technique de blocage de tension par deux électrodes, comme illustré ici, l'exposition à la plasmine a augmenté le delta IE dans chacun des cytes mesurés.

En revanche, l'incubation dans une solution sans protéase a eu un effet négligeable. Cette figure compare l'effet de la chymotripsine sur l'ENaC de type sauvage et sur l'ENaC présentant des sites de clivage de la prostasine et du plasmin mutés. Comme on peut le voir ici, le canal muté retarde et réduit l'activation du courant médié par l'ENaC induite par la chymotripsine.

En outre, il génère un fragment de clivage à un taux réduit par rapport à l'ENaC de type sauvage. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment une combinaison des méthodes décrites peut être utilisée pour corréler l'effet stimulant des protéases sur l'occurrence interne avec l'apparition de produits de clivage à la surface cellulaire. Cela peut s'avérer utile pour un large éventail d'applications, par exemple pour répondre à des questions similaires concernant la régulation d'autres canaux ioniques, transporteurs ou récepteurs transmembranaires.