Name: Construction et caractérisation dun pli bioréacteur roman Vocal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Découvrez la construction d'un bioréacteur vocal innovant pour étudier l'effet des vibrations sur les cellules souches mésenchymateuses. Cette méthode permet d'analyser les réponses cellulaires dans un environnement biomimétique des cordes vocales.

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Nous remercions le Dr Jeffrey Caplan pour sa formation et des conseils sur l&#39;imagerie confocale. Nous remercions également le Keck microscopie électronique Lab et le Dr Chaoying Ni d&#39;assistance SEM. Ce travail est financé par les Instituts nationaux de la santé (NIDCD, R01DC008965 et R01DC011377). ABZ reconnaît NSF enseignement universitaire intégré et (IGERT) programme de financement la recherche de stage.

Assemblée bioréacteur 1. (Vidéo 1) <ol><li> Faire un moule en aluminium (de filière circulaire + entretoise broches) avec des dimensions intérieures et extérieures prédéterminées (Figure 1). </li><li> Utilisation du moule à partir de l&#39;étape 1.1, la fabrication d&#39;une membrane en silicone (diamètre: 42 mm, épaisseur: 1,5 mm, figure 1) avec un manchon retranché (diamètre: 12 mm, épaisseur ~ 0,25 mm, formée par la broche d&#39;écartement sur ​​la figure 1) en le milieu à l&#39;aide d&#39;un kit d&#39;élastomère de silicone disponible dans le commerce. </li><li> Faites une paire de blocs acryliques (Figure 2 (4, 5)) avec une ouverture circulaire (diamètre: 24 mm) au milieu, graver le haut (1,8 cm d&#39;épaisseur) et bas (0,9 cm d&#39;épaisseur) des blocs avec des crêtes correspondant et rainures 10. </li><li> Prendre en sandwich la membrane de silicone entre les blocs acryliques appariés. Fixez l&#39;ensemble avec quatre vis d&#39;angle à l&#39;aide d&#39;un tournevis dynamométrique micro fixé à une force constante (35 cN · m). En conséquence, un étanche à l&#39;eau, 24 mm de large et 18 mm chambre de vibration profonde est créée (figure 2C). </li><li> Monter une &quot;gamme étendue mini-woofer 3 (figure 2D, 8 Ω/20 W) sous la chambre de vibration par un autre jeu de vis de coin sur le bloc acrylique fond. A ce point, un module de vibration individuelle est assemblé. </li><li> Répliquer sept modules de vibration supplémentaires. Apposer quatre d&#39;entre eux à l&#39;une des deux barres d&#39;aluminium fixes (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) en plaçant les bases d&#39;enceintes dans des trous circulaires régulièrement espacées (diamètre: 7 cm, épaisseur: 2 cm) découpées dans les bars. Stabiliser chaque haut-parleur en insérant une vis dans le côté de la barre d&#39;aluminium dans chaque trou circulaire. </li><li> Contrôler individuellement les haut-parleurs par un sélecteur de haut-parleur. Connectez les enceintes individuelles pour le sélecteur de fixer des fils aux entrées positives et négatives sur le corps du haut-parleur, puis aux sorties correspondantes sur le sélecteur. Le sélecteur de haut-parleur permet au signal de til générateur de fonction, après avoir traversé un amplificateur de puissance, pour atteindre les huit haut-parleurs à la fois (figure 2E). </li><li> Placez les deux tableaux de la chambre, le sélecteur de haut-parleur et l&#39;électronique associée à un boîtier anti-humidité. Loger la totalité de l&#39;ensemble dans un incubateur de culture cellulaire du commerce. </li><li> Nourrir les câbles principaux (à travers un tube de PVC de qualité médicale) reliant l&#39;amplificateur de puissance et le sélecteur d&#39;enceinte à travers l&#39;ensemble de filtre à l&#39;arrière de l&#39;incubateur. </li></ol> 2. Fabrication d&#39;échafaudage et caractérisation <ol><li> Dissoudre pastilles PCL dans le chloroforme à une concentration de 15% en poids. Chargez la solution dans une seringue de 10 ml surmonté d&#39;une aiguille émoussée 21 G. </li><li> Verrouiller la seringue sur une pompe à seringue programmable et régler le débit à 1 ml / h. </li><li> Placez le collecteur de papier d&#39;aluminium aluminium en face de l&#39;aiguille horizontalement, avec une aiguille distance pointe-à-collecteur de ~ 18 cm. </li><li> Fixer le alli positifalligator clip pour le milieu de l&#39;aiguille, et la pince crocodile de terre au collecteur d&#39;aluminium, puis réglez la tension de l&#39;alimentation haute tension à 15 kV. ATTENTION: haute tension, maintenir la distance de l&#39;aiguille. </li><li> Activer de façon séquentielle sur la pompe à seringue et l&#39;alimentation électrique; nettoyer rapidement / retirer de la solution de polymère résiduel entourant la pointe de l&#39;aiguille à l&#39;aide d&#39;une serviette en papier avant jets de fibres stable et Taylor cône 19 sont formés. </li><li> Laisser les fibres de s&#39;accumuler sur le collecteur Al jusqu&#39;à une épaisseur de 250 à 300 um ~ (~ 7 h dans les conditions de filage de courant). Stocker les échafaudages obtenus dans un dessiccateur sous vide pendant 1 à 2 jours pour éliminer tout solvant résiduel. </li><li> Image, les échafaudages, applique par pulvérisation avec de l&#39;or, à l&#39;aide d&#39;un microscope électronique à balayage pour montrer cohérent morphologie de la fibre. 10 </li></ol> 3. Assemblée bioréacteur et caractérisation <ol><li> Percez un disque cylindrique (diamètre: 8 mm) avec quatre bras (longueur: 2mm) sur le tapis PCL à l&#39;état filé (figure 2A) en utilisant d&#39;abord un diamètre de 12 mm poinçon de biopsie pour couper le diamètre extérieur du disque. Ensuite, utilisez une deuxième, 8 mm biopsie punch pour faire quatre 2 mm de long encoches espacées uniformément autour de la lame circulaire de marquer où les armes sont à couper. Après avoir marqué avec le poinçon de 8 mm, utiliser une lame de scalpel pour couper les bords des bras vers l&#39;extérieur. Insérer l&#39;échafaudage dans la rainure de la membrane en silicone par l&#39;intermédiaire des bras étendus (vidéo 1). Aplatir l&#39;échafaud inséré en appuyant doucement sur la surface en utilisant des pinces à tête plate. </li><li> Attacher un petit morceau de feuille mince d&#39;Al (8 mm x 2 mm, forme orthogonale, figure 2B) à l&#39;échafaud PCL pour aider à la réflexion laser. </li><li> Bloquer la membrane silicone / PCL échafaudage assemblée (comme indiqué dans l&#39;étape 1.4) dans la chambre de vibration. Ajouter 1,5 ml d&#39;eau dans la chambre pour hydrater l&#39;échafaud PCL avant vibrations. </li><li> Utilisation du générateur de fonction, introduire le signe de vibrationsal (par exemple, 200 Hz ondes sinusoïdales avec une tension crête-à-crête, Vpp, de 0,1 V) à la chambre acrylique prise en sandwich. Utilisez un voltmètre pour mesurer avec précision la tension à chaque entrée du haut-parleur. Remarque: la lecture Vcc du générateur de fonction sera différente de la tension éventuelle livré à l&#39;orateur. </li><li> Assemblez le seul point LDV et sécuriser le laser tête de capteur à fibre optique sur un trépied à tête pan-tilt. Angle de la tête de capteur de sorte qu&#39;il est orienté perpendiculairement à la table. Raccorder la tête de capteur de LDV au module d&#39;acquisition de données par l&#39;intermédiaire d&#39;un câble coaxial ensuite le module à l&#39;ordinateur portable via USB. </li><li> Focaliser le faisceau laser perpendiculairement à différents points prédéterminés sur la membrane en silicone (figure 2B et la figure 3). </li><li> Utilisation du logiciel d&#39;acquisition de données, enregistrer le déplacement mi-membrane. Cliquez sur &quot;Paramètres d&#39;acquisition&quot; dans le menu &quot;Options&quot;; puis changer le mode de mesure à &quot;FFT221;. Ensuite, cliquez sur le &quot;mesure continue&quot; dans la barre d&#39;outils principale puis cliquez sur le pic qui se forme à la fréquence choisie (Figure 6D) pour enregistrer le déplacement. </li><li> Tracer le déplacement mi-membrane normal (w 0) en fonction de la position relative entre le substrat. Construire une palette de couleurs 3D du profil vibratoire de surface à l&#39;aide Origine logiciel d&#39;analyse de données 8.5. </li></ol> 4. Vibrante culture cellulaire <ol><li> MSC dérivées de moelle osseuse sous-culture T150 humain dans des flacons de culture de tissu avec une densité d&#39;ensemencement initiale de 4000-5000 cellules / cm 2 dans les milieux d&#39;entretien MSC. </li><li> Après 7-8 jours de culture cellulaire (à ~ 85% de confluence), trypsiniser les cellules avec un réactif de dissociation cellulaire tel que Accutase, compter l&#39;aide d&#39;un hématimètre, centrifugeuse (440 g pendant 5 min), et remettre en suspension le culot cellulaire dans milieu d&#39;entretien frais de MSC à une concentration de 4,5 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Plonger la Scaffo PCLld éthanol à 70% O / N. Après que le solvant est évaporé, exposer les deux côtés de l&#39;échafaudage à la lumière UV germicide (254 nm) pour 5-8 minutes. </li><li> Faire tremper l&#39;échafaud PCL dans une solution de fibronectine 20 pg / ml à 37 ° C pendant 1 heure. Insérer l&#39;échafaudage de fibronectine dans la membrane en silicone. Assemblez le bioréacteur tel que détaillé à l&#39;étape 1. </li><li> Distribuer 40 ul de la suspension cellulaire uniformément sur l&#39;échafaud PCL sécurisé. Permettent aux cellules de se fixer pour 1 à 1,5 h avant d&#39;ajouter encore 1,5 ml de milieu frais à la chambre de vibration. </li><li> Culture de l&#39;échafaud PCL MSC chargé statiquement pendant 3 jours et rafraîchir les médias à la fin de la culture statique. </li><li> Imposer des régimes de vibration sélectionnés pour les constructions cellulaires. Remarque: Par exemple, les cellules sont soumises à un 1-hr-sur-1-h-off (DE) vibrations à 200 Hz avec aw 0 de ~ 40 um pendant 12 heures par jour pour un maximum de 7 jours. Constructions soumises à des stimulations vibratoires sont désignés comme échantillons Vib et les culturouge statique dans des chambres de vibrations identiques servent de témoins statiques (STAT). </li></ol> 5. Évaluations biologiques <ol><li> Recueillir 200 ul de milieux de culture cellulaire à partir de chaque chambre tous les deux jours (jours 1, 3, 5 et 7) et en commun des fractions aliquotes d&#39;un même échantillon en même temps (800 ul chacun). </li><li> Quantifier la production cellulaire de la matrice métalloprotéinase-1 (MMP1) et HA en utilisant un kit ELISA MMP1 développement et un kit ELISA de compétition de l&#39;acide hyaluronique, respectivement, à la suite de la procédure des fabricants. Pendant ce temps, le dosage de la production de précurseur de l&#39;élastine soluble suivant la procédure ELISA précédemment rapporté. Huit </li><li> À la fin du dernier cycle de vibration au jour 7, supprimer rapidement les constructions cellulaires des chambres de vibrations à l&#39;aide de pinces acérées et brièvement les rincer avec de phosphate froid (PBS, 4 ° C). </li><li> Pour la coloration en direct / mort, incuber les constructions avec l&#39;iodure de propidium (1:2000 dans du PBS) etSyto-13 (1:1000 dans du PBS) en même temps pendant 5 min à température ambiante. Image Les constructions colorées avec un microscope confocal multiphotonique. </li><li> Séparément, enfichable geler les constructions cellulaires PBS rincés sur glace sèche et d&#39;extraire l&#39;ARN cellulaire total en suivant un protocole indiqué précédemment pour l&#39;analyse génétique. 9 </li><li> Vérifiez la quantité et la qualité de l&#39;ARN extrait à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre UV-Vis. échantillons d&#39;ARN avec des ratios de 1,8-2,2 A260/A280 et A260/A230 sont utilisées pour l&#39;analyse qPCR ultérieure. </li><li> N º de transcrire l&#39;ARN (500 ng / échantillon) en ADNc en utilisant un kit de transcription inverse disponible dans le commerce. </li><li> Effectuer la réaction de PCR sur un système de détection de séquence en temps réel en utilisant un mélange maître PCR disponible dans le commerce en suivant la procédure détaillée précédemment. 8 </li><li> Analyser les résultats de qPCR en utilisant un logiciel d&#39;analyse de données qPCR commerciale. Pour assurer la fiabilité de l&#39;analyse de données, plusieurs gènes de référence (YWHAZ, BPT, PPIA) sont utilisés comme intcontrôles ernal, et la variance de l&#39;efficacité des amorces spécifiques sont pris en compte. 8 </li></ol>

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Aucun intérêt financier concurrentes existent.

L&#39;ingénierie des tissus succès des cordes vocales fonctionnels in vitro nécessite la recréation d&#39;un pli comme micro vocal à la médiation des comportements de cellules multipotentes. Il est généralement admis que les structures de tissus ou d&#39;organes reflètent les fonctions qu&#39;ils sont appelés à exécuter. 22 Pour les tissus des cordes vocales, les vibrations de haute fréquence qui se produisent pendant la phonation sont proposées pour être important pour la maturation des tissus. Dans...

Le pli vocal humain, composé d&#39;une couche épithéliale, la lamina propria (LP) et le muscle vocalis, est un tissu mou spécialisé qui convertit le flux d&#39;air dans les poumons en ondes acoustiques pour produire des sons. 1 Cordes vocales oscillent régulièrement pendant la phonation normale, présentant des souches de jusqu&#39;à 30% à des fréquences fondamentales allant de 100-300 Hz. 2 adultes cordes vocales LP est une structure composée d&#39;un gradient superficiel (SLP), un intermédiaire (PLI) et un (DLP) couche profonde. D&#39;autres groupes de classification la épithélium et le SLP que la couche de muqueuse, et combine l&#39;ILP et DLP dans le ligament vocal. 3 La couche de SLP contient essentiellement une matrice amorphe avec des fibres de collagène peu dispersés, alors que le ligament est enrichie en collagène mature et les fibres d&#39;élastine pour offrir une résistance suffisante. 4 La structure et la mécanique des cordes vocales nouveau-nés varient considérablement de leurs homologues adultes. Bien que le mécanismes régulant le développement de cordes vocales et de la maturation ne sont pas encore entièrement compris, la preuve expérimentale a souligné les rôles qui définissent des contraintes mécaniques vocalisation dérivés. Plusieurs conditions médicales, y compris l&#39;abus de la voix, des infections, des produits chimiques irritants et des interventions chirurgicales, peuvent endommager la corde vocale. Troubles des cordes vocales affectent environ 3-9% de la population américaine. Méthodes actuelles de traitement pour les troubles des cordes vocales sont limitées 5 et un tissu approche d&#39;ingénierie à base de cellules souches est apparue comme une stratégie prometteuse pour la restauration de la fonction de cordes vocales. cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une alternative appropriée aux primaires fibroblastes des cordes vocales pour voix génie pli de tissu. 6-9 spécification du destin des cellules souches et le développement du tissu ultérieure sont médiés par le créneau spécifique qu&#39;ils résident dans, dont l&#39;état mécanique est un facteur essentiel. 10 forces mécaniques sont des régulateurs essentiels du tissu morphogenèse unnd homéostasie, en particulier pour les tissus qui sont couramment soumis à une charge. 11 Du point de vue de l&#39;ingénierie tissulaire, il a été démontré que l&#39;exposition à des stimulations mécaniques physiologiquement pertinentes favorise la différenciation des cellules souches et spécifique d&#39;un tissu remodelage de la matrice 12 à 15. bioréacteurs de culture de tissus sont conçus pour simuler l&#39;environnement physiologique désirée pour la croissance des cellules ou des tissus in vitro. Pour vocal génie pli de tissu, il est particulièrement important de recréer l&#39;environnement mécanique des cordes vocales phonating. Une corde vocale bioréacteur idéal devrait fournir efficacement des signaux vibratoires de cellules en culture, ce qui permet un contrôle facile sur la fréquence, l&#39;amplitude et la durée des vibrations. Et ses collègues ont conçu titze un pli bioréacteur vocal (T1 bioréacteur) 16 qui combine étirement statique à haute fréquence (20 à 200 Hz) des oscillations de stimuler la production cellulaire de protéines de la matrice. Using ce bioréacteur, Webb et ses collègues 17 ont étudié les effets de 10 jours, les vibrations de 100 Hz sur les fibroblastes dermiques cultivées dans un acide hyaluronique (HA) à base d&#39;hydrogel. Les constructions soumises à des vibrations présentaient une expression élevée de HA synthase-2 (HAS2), la décorine, la fibromoduline et la métalloprotéinase matricielle-1 (MMP1), par rapport aux témoins statiques. Les effets stimulants sont révélés être dépendants du temps. Plus récemment, notre groupe de 18 a réuni une fois bioréacteur vocal (J1 bioréacteur) en utilisant un amplificateur de puissance, un générateur de fonctions, un haut-parleur clos et une membrane de silicone circonférence ancrée qui transfère l&#39;air oscillant aux cellules attachées. Des fibroblastes de prépuce néonatal cultivées dans le bioréacteur à J1 ont été soumis à 1 h de vibration à 60, 110 ou 300 Hz, avec une déformation dans le plan d&#39;au plus 0,05%. Les résultats de qPCR ont suggéré que l&#39;expression de certains gènes de la MEC a été légèrement modifiée en réponse à des fréquences vibratoires variéeset amplitudes. Ces conceptions de bioréacteurs, tandis intrigante, présentent plusieurs limites. Par exemple, le système T1 nécessite un grand nombre de connecteurs et de barres de couplage mécanique, ce qui limite les fréquences maximales réalisables. De plus, les cellules peuvent être soumises à une agitation mécanique indésirable et fluide perturbation qui complique l&#39;interprétation des données. Le bioréacteur à J1, d&#39;autre part, présente une efficacité relativement faible de conversion d&#39;énergie et n&#39;est pas facile à utiliser. En outre, les vibrations se détache souvent les constructions cellulaires chargées de la membrane de silicone sous-jacent. Le J2 cordes vocales bioréacteur rapporté ici, conçu sur la base du même principe que la version J1, est optimisée pour l&#39;uniformité et la reproductibilité. Les vibrations de la phonation imitant sont générés aérodynamique dans des chambres de vibrations équipés individuellement où poly fibreux MSC-peuplé (ε-caprolactone) (PCL) échafaudages sont effectively fixé. Laser Doppler Vibrométrie (LDV) permet à l&#39;utilisateur de vérifier le profil vibratoire de l&#39;ensemble membrane / échafaud. Dans notre démonstration, les CSM sont exposés à 200 Hz vibrations sinusoïdales avec un (DE) modèle 1-hr-sur-1-h-off pour un total de 12 heures par jour pendant 7 jours. Les réponses cellulaires aux signaux vibratoires imposées sont étudiées systématiquement. Dans l&#39;ensemble, la corde vocale J2 fournit la plupart des fonctionnalités conviviales, permettant des études de culture cellulaire dynamique à être menées dans un débit élevé et de façon reproductible.

<table><tbody><tr><td>Kit élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Durcir la membrane à 100 &#176 ; C pour 2 hr</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa, dissous O/N</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td> CSM dérivées de la <td></td></tr><tr><td>moelle osseuse humaine</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Reçu avec passage 2</td></tr><tr><td>milieux d’entretien MSC</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10 % FBS dans le milieu basal supplémenté avec de la L-glutamine, de la gentamicine et de l’amphotéricine</td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire d’accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet Kit ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA ELISA kit</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp ; K-1200&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect kit de transcription inverse</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Haut-parleur de remplacement</td><td>DAYTON audio (via Parts Express)</td><td>DS90-8</td><td>Cône en papier, gamme complète (80-13 000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Ergo Micro tournevis dynamométrique</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>Plage de couple : 20-120 cN&#183 ; m</td></tr><tr><td>Sélecteur de haut-parleurs stéréo</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>Puissance maximale admissible 50 W</td></tr><tr><td>Fonction générateur&nbsp ;</td><td>Agilent&nbsp ;</td><td>33220A</td><td>Gamme de fréquences 1 & micro ; Hz-20 MHz</td></tr><tr><td>Amplificateur de puissance&nbsp ;</td><td>PYLE audio</td><td>PylePro PT2400</td><td>Réponse en fréquence : 10 Hz-50 kHz, deux canaux haut-parleurs </td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher&nbsp ;</td><td>Tire-seringue Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td></td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation haute tension</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>Tension de sortie : 0-30 kV</td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage&nbsp ;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>Bureau gold sputter coater</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>Vibromètre laser Doppler&nbsp ;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>Mesure de vitesse sans contact (0-22 kHz)</td></tr><tr><td>Système de détection de séquence PCR&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal multiphotonique</td><td>Zeiss Zeiss</td><td>510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrophotomètre&nbsp ;</td><td>Produits NanoDrop via Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition de données VibSoft Bande</td><td>passante d’acquisition Polytec</td><td></td><td></td> jusqu’à 40 MHz</tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données Origin 8.5&nbsp ;</td><td>Logiciel</td> d’analyse de données qPCR OriginLab <td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus&nbsp ;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>Alliage d’aluminium&nbsp ;</td><td>McMaster-Carr</td><td>Alliage 6061</td><td></td></tr><tr><td>Blocs acryliques</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre anti-humidité en polycarbonate</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>Résistant aux chocs&nbsp ; Vis en polycarbonate</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câble/fil</td><td></td><td></td><td></td>électronique</tr><tr><td>Tube en PVC de qualité médicale</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td><td>Clear, biocompatible</td></tr><tr><td>Seringue de 10 ml&nbsp ;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G Aiguille à extrémité émoussée</td><td>Petites pièces</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1/2" longueur</td></tr><tr><td>Adaptateurs de pince crocodile&nbsp ;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 8 mm</td> entièrement isolé <td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx ? DepartmentID=10& CategoryID=96">Sklar&nbsp ; Instruments chirurgicaux </a></td><td>96-1152</td><td>Poinçon de</td></tr><tr><td>biopsie</td> stérile et jetable de 12 mm <td>Acuderm (via Fisher Scientific)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture tissulaire</td><td>Corning</td><td></td><td>Culture cellulaire traitée</td></tr></tbody></table>

construction et caractérisation d&#39;un pli bioréacteur roman vocal

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

L’ingénierie in vitro des tissus mécaniquement actifs nécessite la présentation de conditions mécaniques physiologiquement pertinentes aux cellules cultivées. Pour émuler l’environnement dynamique des cordes vocales, un nouveau bioréacteur des cordes vocales capable de produire des stimulations vibratoires à des fréquences de phonation fondamentales est construit et caractérisé. L’appareil est composé d’un générateur de fonctions, d’un amplificateur de puissance, d’un sélecteur de haut-parleurs et de chambres de vibration parallèles. Les chambres de vibration individuelles sont créées en prenant en sandwich une membrane de silicone sur mesure entre une paire de blocs acryliques. La membrane de silicone sert non seulement de fond de chambre, mais fournit également un mécanisme pour sécuriser l’échafaudage chargé de cellules. Les signaux de vibration, générés par un haut-parleur monté sous le bloc acrylique inférieur, sont transmis à la membrane de manière aérodynamique par l’air oscillant. Huit modules de vibration identiques, fixés sur deux barres métalliques fixes, sont logés dans une chambre anti-humidité pour un fonctionnement à long terme dans un incubateur de culture cellulaire. Les caractéristiques vibratoires du bioréacteur des cordes vocales sont analysées de manière non destructive à l’aide d’un vibromètre laser Doppler (LDV). L’utilité du dispositif de culture dynamique est démontrée par la culture de constructions cellulaires en présence de vibrations sinusoïdales de 200 Hz avec un déplacement médian de la membrane de 40 μm. Les cellules souches mésenchymateuses cultivées dans le bioréacteur répondent aux signaux vibratoires en modifiant la synthèse et la dégradation des composants de la matrice extracellulaire pertinents pour les cordes vocales. Le nouveau système de bioréacteur présenté ici offre une excellente plate-forme in vitro pour l’étude de la mécanotransduction induite par les vibrations et pour l’ingénierie des tissus fonctionnels des cordes vocales.

Les échafaudages PCL fabriqués par électrofilage contiennent des pores interstitiels de taille micronique et des fibres enchevêtrées de manière aléatoire ayant un diamètre moyen de 4,7 pm (Figure 4A). A plus fort grossissement, rainures et pores nanométriques sont visibles sur fibres individuelles (figure 4B). Revêtement des échafaudages avec la fibronectine améliore le caractère hydrophile et facilite l&#39;adhérence cellulaire initiale / épandage sur l&#39;échafaudage PCL (observation...

Un nouveau bioréacteur des cordes vocales capable de fournir une stimulation vibratoire physiologiquement pertinente aux cellules cultivées est construit et caractérisé. Ce dispositif de culture dynamique, lorsqu’il est combiné à un échafaudage fibreux en poly(ε-caprolactone), crée un environnement mimétique des plis vocaux qui module les comportements des cellules souches mésenchymateuses.

Construction et caractérisation d&#39;un pli bioréacteur roman Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'examiner l'effet d'une stimulation vibratoire sur des cellules souches mésenchymateuses à l'aide d'un bioréacteur conçu pour imiter la phonation. Cela est réalisé en créant des échafaudages en poly-ε-caprolactone afin de fournir un substrat tridimensionnel pour les cultures cellulaires, similaire au ligament vocal. Dans un deuxième temps, les échafaudages sont intégrés dans des membranes en silicone, ce qui facilite la transmission des oscillations aux constructions cellulaires.Ensuite, la vibrométrie laser Doppler est utilisée pour déterminer les caractéristiques vibratoires de chaque combinaison de support membranaire. Enfin, des analyses par EISA et par RT-PCR quantitative peuvent être réalisées afin d'évaluer les réponses cellulaires aux niveaux protéique et traductionnel. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la laryngologie, telles que le processus de maturation des cordes vocales et les conséquences d'une mauvaise utilisation vocale.Les implications de cette technique s'étendent au traitement des troubles des cordes vocales en raison du niveau de contrôle cellulaire désormais possible grâce à cette méthode de fabrication du support : commencez par dissoudre des pastilles de PCL dans du chloroforme à une concentration de 15 pour cent en poids. Ensuite, chargez la solution obtenue dans une seringue de 10 millilitres munie d'une aiguille sans biseau de calibre 21. Fixez la seringue à une pompe à seringue programmable et réglez le débit à un millilitre par heure.Ensuite, placer un collecteur recouvert de papier d'aluminium en face de l'aiguille de manière horizontale, avec une distance d'environ 18 centimètres entre la pointe de l'aiguille et le collecteur. Puis, fixer une pince crocodile positive au milieu de l'aiguille et relier cette pince à la masse du collecteur. Régler la tension de l'alimentation haute tension à 15 kilovolts, en prenant soin de rester éloigné de l'aiguille.Ensuite, allumez la pompe à seringue et l'alimentation électrique. Utilisez une serviette en papier sèche pour retirer rapidement la solution polymère résiduelle entourant l'extrémité de l'aiguille avant que le jet de fibre stable et le cône d'ajustement ne se forment, afin de permettre l'accumulation des fibres sur le collecteur en aluminium pendant environ sept heures jusqu'à une épaisseur de 250 à 300 micromètres, puis conservez le résultat sous forme de supports dans un dessiccateur sous vide pendant un à deux jours pour éliminer tout solvant résiduel. Les supports en PCL présenteront des pores interstitiels de taille micrométrique et des fibres enchevêtrées de manière aléatoire avec un diamètre moyen d'environ 4,7 micromètres.À un grossissement plus élevé, des sillons et des pores à l'échelle nanométrique seront visibles sur les fibres individuelles permettant d'assembler le bioréacteur. Commencez par utiliser un poinçon de biopsie de 12 millimètres de diamètre pour découper le diamètre extérieur d'un disque circulaire de huit millimètres à partir d'une membrane de PCL récemment électrurie. Utilisez ensuite un second poinçon de biopsie de huit millimètres pour marquer l'emplacement où les bras doivent être découpés.Après le score, utilisez une lame de scalpel pour découper les bords des bras vers l'extérieur et insérez la structure porteuse dans la rainure de la membrane en silicone par l'intermédiaire des bras prolongés. Aplatissez la structure porteuse insérée en appuyant doucement sur la surface à l'aide de pinces plates, puis fixez un morceau de feuille d'aluminium fine de huit millimètres sur deux millimètres sur la structure porteuse en PCL. Pour faciliter la réflexion du laser, fixez l'ensemble membrane en silicone-structure porteuse en PCL dans la chambre de vibration.Ensuite, placez la membrane en silicone entre deux blocs acryliques appariés. Fixez l'ensemble à l'aide de quatre vis d'angle à l'aide d'un tournevis à couple micro réglé sur une force constante de 35 centinewtons-mètres, créant ainsi une chambre de vibration étanche de 24 millimètres de large et de 18 millimètres de profondeur. Puis, montez un mini haut-parleur à longue course de trois pieds sous la chambre de vibration à travers un autre jeu de vis d'angle situées sur le bloc acrylique inférieur, achevant ainsi l'assemblage d'un module de vibration individuel.Après avoir reproduit sept modules de vibration supplémentaires, fixez quatre de ces modules à l'une des deux barres d'aluminium fixes en plaçant les socles des haut-parleurs dans des trous circulaires espacés régulièrement. Découpez les barres, puis stabilisez chaque haut-parleur en insérant une vis sur le côté de la barre d'aluminium dans chacun des trous circulaires. Ensuite, reliez les haut-parleurs individuels au sélecteur en connectant des fils aux bornes positives et négatives du corps du haut-parleur et aux sorties correspondantes sur le sélecteur.Le sélecteur de haut-parleurs permet au signal du générateur de fonctions, après avoir traversé un amplificateur de puissance, d'atteindre simultanément les huit haut-parleurs. Ensuite, placez les deux réseaux de chambres, le sélecteur de haut-parleurs et l'électronique associée dans une enceinte anti-humidité, en logeant l'ensemble dans un incubateur de culture cellulaire commercial. Faites passer les câbles principaux à travers un morceau de tube en PVC de qualité médicale et reliez l'amplificateur de puissance et le sélecteur de haut-parleurs via l'ensemble du filtre situé à l'arrière de l'incubateur.Pour caractériser d'abord le bioréacteur, ajoutez 1,5 millilitre d'eau dans la chambre de vibration afin d'hydrater la structure en PCL avant la vibration. Ensuite, à l'aide du générateur de fonctions, appliquez des signaux de vibration à la chambre acrylique sandwich. Utilisez un voltmètre avec précision.Mesurez la tension à chaque entrée d'enceinte, puis assemblez le vibromètre laser à point unique. Fixez le capteur laser à fibre optique. Placez-le sur une tête tripod orientable et inclinez la tête du capteur de manière qu'elle soit perpendiculaire à la surface de la table.Ensuite, connectez la tête du capteur au module d'acquisition de données à l'aide d'un câble coaxial, puis reliez le module à un ordinateur portable via le port USB. Focalisez le faisceau laser perpendiculairement sur différents points prédéterminés de la membrane en silicone, puis, à l'aide du logiciel d'acquisition de données, cliquez sur Paramètres d'acquisition dans le menu des options. Ensuite, modifiez le mode de mesure en FFT, puis cliquez sur l'outil de mesure continue dans la barre d'outils principale.Cliquez sur le pic qui se forme à la fréquence choisie pour enregistrer le déplacement et tracer le déplacement normal au niveau de la membrane médiane en fonction de la position relative par rapport au substrat. Pour mettre en place une culture cellulaire vibratoire, commencez par repiquer des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine dans des flacons de culture tissulaire T150 à une densité initiale d'ensemencement de 4 à 5 × 10³ cellules par cm² dans un milieu de maintenance pendant sept à huit jours. La veille de l'expérience, immergez une matrice en PCL dans de l'éthanol à 70 % pendant toute une nuit.Le lendemain matin, détacher les cellules à l’aide d’Accutane, puis centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans un milieu de maintenance frais à une concentration de 4,5 × 10⁶ cellules par millilitre. Une fois l’éthanol évaporé, exposer les deux faces de la matrice à la lumière UV germicide pendant cinq à huit minutes. Ensuite, imbiber la matrice en PCL dans une solution de fibronectine à 20 µg/mL à 37 °C pendant une heure.Le bioréacteur tel que vient d'être démontré, puis répartir uniformément 40 microlitres de la suspension cellulaire sur le support fixé. Laisser les cellules s'attacher pendant une à 1,5 heure, puis ajouter 1,5 millilitre supplémentaire de milieu frais dans la chambre de vibration. Après avoir cultivé le support en PCL chargé de cellules souches mésenchymateuses statiquement pendant trois jours, renouveler le milieu, puis appliquer les régimes de vibration sélectionnés aux constructions cellulaires.Les fréquences de vibration sont choisies pour refléter les fréquences fondamentales de la parole humaine, et il existe une relation linéaire entre le déplacement normal et la tension crête à crête dans la plage de zéro à 0,125 volt pour toutes les fréquences testées ; à une tension crête à crête donnée, le déplacement normal diminue lorsque la fréquence augmente de 100 à 300 hertz. Les réponses cellulaires aux stimulations vibratoires, examinées au niveau de l'ARNm en termes d'expression des protéines essentielles de la muqueuse vocale, telles que l'élastine, la synthase de l'hyaluronane 1, le collagène de type III alpha 1 et la métalloprotéinase 1 de la matrice, montrent que la vibration cyclique d'une heure activée, une heure désactivée, entraîne une augmentation de 2,3 fois de l'expression de l'élastine par rapport aux témoins statiques.Au septième jour, les stimulations vibratoires augmentent également modérément l'expression du collagène. Il est à noter que l'expression des principales enzymes de remodelage de la matrice extracellulaire, l'hyaluronane synthase 1 et la métalloprotéinase matricielle 1, est significativement augmentée par les signaux de vibration du troisième au septième jour. Les cellules cultivées dynamiquement produisent 4,2 ± 0,1 µg/mg de poids sec du support en élastine soluble, comme détecté par ELISA après sept jours de vibrations.Alors que les contrôles statiques n'accumulent que 2,7 ± 0,2 microgrammes par milligramme d'élastine. En moyenne, des vibrations de sept jours, une heure allumée et une heure éteinte, entraînent des augmentations respectivement de 2,2 et 4,7 fois par rapport aux contrôles statiques correspondants pour la sécrétion d'acide hyaluronique et de MMP-1. Bien que notre système soit conçu pour étudier la physiologie de type VOCO, il peut également être appliqué à de nombreux autres systèmes.Par exemple, les tissus auriculaires et dermiques humains. Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec vos expériences.

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