Name: Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez un protocole sans chargeur pour dériver des cellules progénitrices de la crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode de 18 jours utilise des petites molécules et le tri cellulaire pour étudier les maladies liées à la crête neurale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une bourse pour chercheurs avancés du Fonds national suisse de la science et par des subventions de NYSTEM (C026446; C026447) et l&#39;initiative sur les cellules souches Tri-institutionnel (Fondation Starr).

1. Préparation de milieux de culture, des boîtes recouvertes et entretien de hPSCs Préparation 1.1 Médias Remarque: Filtrez tous les médias pour la stérilisation et conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 2 semaines. noms de réactifs, la société et numéros de catalogue sont répertoriés dans le tableau des matières. <ol><li> DMEM/10% de FBS: Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml de L-glutamine. </li><li> HES-moyen: Mélanger 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-glutamine, 5 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution essentielle d&#39;acides aminés, de 1 ml β-mercaptoéthanol. Ajouter 10 ng / ml de FGF-2 après filtration du milieu. ATTENTION: β-mercaptoéthanol est toxique, éviter l&#39;inhalation, ingestion et contact avec la peau. </li><li> Moyen KSR-différenciation: Mélanger 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution d&#39;acides aminés essentiels et 1 ml β-mercaptoéthanol. </li><li> N2-differentiatisur le milieu: Dissoudre 12 g de poudre dans DMEM/F12 980 ml ​​dH 2 O, ajouter 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonate de sodium et 100 mg APO transferrine humaine. Mélanger 2 ml dH 2 O: 25 mg d&#39;insuline humaine et 40 ul de NaOH 1 N, ajouter la solution dissoute dans le milieu. Ajouter 100 pi de dichlorhydrate de putrescine, 60 pl sélénite, 100 pi de la progestérone et porter le volume à 1 L avec dH 2 O. </li></ol> 1.2 Revêtement de boîtes de culture <ol><li> Matrigel revêtement: Dégel 1 ml gelés matrigel aliquote par aspiration 19 ml DMEM/F12 sur l&#39;aliquote jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit dissous. Éliminer les grumeaux en le faisant passer à travers un tamis cellulaire de 40 um et la plaque 8 ml/10 cm plat. Incuber les boîtes pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le matrigel immédiatement avant l&#39;étalement des cellules. Remarque: Travaillez rapidement avec matrigel car il peut s&#39;agglutiner à des températures supérieures à 4 ° C. </li><li> Revêtement PO / Lam / FN: Ajouter 10 ml de 1 x PBS contenant 15 ug / ml de bromhydrate de poly-L ornithine dans un plat de 10 cm. Incuber le plat pendant une nuit à 37 ° C. Laver les plaques avec du PBS 1x fois et ajouter 10 ml/10 cm plat de 1x PBS contenant 2 pg / ml souris laminine-I et 2 pg / ml de fibronectine. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C. Avant l&#39;étalement des cellules, enlever complètement la solution et laisser les plaques sécher complètement à température ambiante pendant 15-20 min en les debout sur le mur de la hotte de culture de tissus sans le couvercle. Remarque: Les plats sont complètement sec et prêt pour le placage de la cellule où l&#39;on peut voir des structures cristallines sur la surface (visible à l&#39;œil nu). Les plaques peuvent être conservées à température ambiante pendant quelques heures dans cet état séché. Plats PO / Lam / FN doivent être préparés deux jours à l&#39;avance. En cas d&#39;urgence Lam / FN peut être incubé pendant 2-4 heures seulement. Toutefois, cela risquerait résultats différenciation / de survie sous-optimales. </li></ol> 1.3 Maintien de hPSCs Remarque: hPSCs sont maintenus sur 0,1% de gélatine et de la souris mitotique inactivé fibroblastes embryonnaires (MFE) à la HES-milieu supplémenté avec 10 ng / ml de FGF-2 comme décrit précédemment 10,12. Les cellules doivent être divisés tous les 6-8 jours. <ol><li> Manteau un plat de 10 cm avec 8 ml de 0,1% de gélatine (PBS 1x sans en magnésium ou calcium) à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Décongeler MEF congelés rapidement dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Ajouter 1 million MEF à 10 ml DMEM/10% de FBS. </li><li> Aspirer la gélatine et plaquer les cellules. Incuber à 37 ° C pendant au moins 6 heures. </li><li> Aspirer le DMEM/10% de FBS de la plaque MEF prêt, laver la plaque avec PBS 1x fois et ajouter 10 ml de la HES-milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate. Laisser le milieu se réchauffer à 37 ° C pendant 20 min. Remarque: Pour fendage manuel de hPSCs une hotte à flux laminaire avec un microscope intégré est utilisé. Cependant, les cellules peuvent être soumises à des passages en utilisant des méthodes de substitution appropriées. </li><li> Sous une hotte à flux laminaire avec un microscope intégré, détachez colonies distinctes en utilisant un levier de cellule et les laisser flotter. </li><li> Utilisez unSeringue de 1 ml pour aspirer les colonies flottantes et les dépêcher sur le, plaque MEF chaud frais. Transférer environ un quart des cellules de la nouvelle antenne. Incuber à 37 ° C. </li><li> Nourrir les cellules quotidien avec le milieu HES frais. </li></ol> 2. Placage de hPSCs pour la différenciation Remarque: hPSCs devraient être divisée ou plaqué de différenciation lorsque les colonies sont grandes, mais qui ont encore des arêtes vives avec aussi peu que possible cellules qui se différencient au niveau de leurs frontières (voir la figure 1B). Lorsque les cellules sont maintenues en utilisant des passages manuel, les colonies doivent être suffisamment grandes pour être facilement vu par les yeux. Pour obtenir la bonne idée de ce point de temps on peut conserver un plat HPSC séparée pendant deux semaines sans repiquer et regarder les cellules atteignent et passer le point de moment idéal pour passages / les différencier. <ol><li> Préparer boîtes de 10 cm avec matrigel 1 heure avant de commencer la différenciation. Revêtement de matrigel réussie peut êtregarantie à un grossissement de 4x. </li><li> Lorsque les hPSCs sont prêts à être divisé, aspirer le milieu et ajouter 4 ml de 0,05% de trypsine-EDTA pour les cellules. </li><li> Secouez le plat horizontalement pendant 2 min vigoureusement jusqu&#39;à ce que l&#39;on peut voir sur les FAE comme des cellules individuelles soulevant la plaque sous le microscope. Les colonies HPSC restent attachés comme des colonies. </li><li> Immédiatement et abondamment, aspirer la trypsine et laissez la plaque reposer à température ambiante pendant 2-4 min. </li><li> Ajouter 2 ml d&#39;HES-support à la plaque et à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000, détacher les cellules. Remarque: Si les cellules ne peuvent pas être levées facilement de la surface, la plaque peut être incubée vide à température ambiante pour un autre 2-3 min. </li><li> Transférer les cellules à 8 ml HES-milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate. </li><li> Aspirer le matrigel d&#39;un préalablement préparé de 10 cm. Plaquer les cellules à un ratio de 1:1 ou 1:2 (par exemple: Les cellules d&#39;un plat de 10 cm sont divisés en deux boîtes de 10 cm) sur la plaque de Matrigel. Incuber à 37 °C pendant une nuit. Note: Ce revêtement devrait aboutir à environ 100 000 cellules / cm 2. </li></ol> 3. L&#39;induction de la différenciation neurale Remarque: La différenciation peut être initiée (jour 0) lorsque les cellules sont de 90-100% de confluence (voir figure 1C), généralement le lendemain. Si la confluence exacte n&#39;est pas encore atteinte, les cellules peuvent être nourris quotidiennement avec HES-moyen jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts pour la différenciation. En variante, le nombre initial de cellules étalées peut être augmentée. <ol><li> Au jour 0 à 3, nourrir les cellules quotidien avec 10 ml/10 cm bomber moyen KSR-différenciation contenant 0,1 uM LDN193189 et 10 uM SB431542. </li><li> Le jour 4 et 5 aliments les cellules avec 75% de milieu KSR-différenciation et 25% de milieu N2 différenciation à la fois contenant et LDN193189 SB431542. </li><li> Au jour 6 et 7 d&#39;alimentation des cellules avec 50% de milieu KSR-différenciation et 50% de milieu N2 différenciation à la fois contenant LDN193189 et SB431542. </li><li> Le jour 8 et 9 alimenter les cellules avec 25% de milieu KSR-différenciation et 75% de milieu N2 différenciation à la fois contenant et LDN193189 SB431542. </li><li> Le jour 9 et 10 de la préparation des plats PO / Lam / FN comme indiqué au point 1.2.2 de réensemencement des cellules sur 11 jours. </li><li> Le jour 10 cellules d&#39;alimentation avec un milieu N2 différenciation contenant LDN193189 et SB431542. </li></ol> 4. Replacage en gouttelettes pour Spécification NC <ol><li> Le jour 11 aspirer Lam / FN des plaques préalablement préparés et laissez-les sécher complètement à température ambiante pendant 20-30 minutes, comme expliqué au point 1.2.2. </li><li> Éliminer le milieu des cellules qui se différencient, se laver les cellules une fois avec PBS 1x et ajouter 8 ml accutase/10 cm plat. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de levage de la cellule, détacher les cellules et les remettre en suspension dans Accutase avec une pipette de 5 ml. Transférer la suspension dans un tube de 15 ml. </li><li> Ajouter 5 ml de PBS 1x et tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 10 ml 1x PBS. Pour assurer une suspension de cellules individuelles, les filtrer à travers un tamis cellulaire de 40 pm et compter les cellules en utilisant un hématimètre ou une technique équivalente. </li><li> Faire tourner les cellules vers le bas et les remettre en suspension dans un milieu N2-différenciation contenant 200 pM d&#39;acide ascorbique (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632, dichlorhydrate à la concentration de 100 000 -150 000 cellules/10 ul. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un repeat-pipette, plaque 10 pi gouttelettes proches les uns des autres, sans les toucher sur le PO séché / Lam / FN 15 cm plats. Remarque: Un plat de 10 cm de cellules différenciées aboutit normalement à environ 2-3 fois 15 cm plats ou environ 100 x 10 pi droplets/15 cm plat. </li><li> Laissez les gouttelettes s&#39;élèvent à température ambiante pendant 20-30 minutes, puis très soigneusement (ne pas déranger les gouttelettes) ajouter 30 ml d&#39;N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y et incuber à 37 ° C. </li><li> Le jour 12, nourrir soigneusement les cellules avec 20 ml/15 cm plat N2/AA/BDNF/FGF8/SHH. </li><li> De day 14-17 nourrir les cellules chaque deuxième ou troisième jour de N2/AA/BDNF/FGF8. </li><li> Le jour 16 et 17 préparer PO / plaques Lam / FN à Réensemencement cellules NC après tri FACS. </li></ol> 5. Cellulaire activé par fluorescence (FACS) des cellules NC Remarque: La préparation des cellules pour FACS nécessite environ 2 h. <ol><li> Le jour 18 moyen de supprimer, laver les cellules une fois avec PBS 1x dans le plat et ajouter 12 ml Accutase. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de levage de la cellule, détacher les cellules de la surface et laisser flotter. Introduire à la pipette les cellules en suspension en utilisant une pipette de 5 ml, transférer à un tube de 50 ml et ajouter 30 ml de PBS 1x. Faites tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g. </li><li> En utilisant une pipette P1000, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 2% de FBS / HBSS (la HBSS contient 15 mM de HEPES). Ajouter 19 ml de 2% de FBS / HBSS et de filtrer des cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour assurer une suspension cellulaire unique. Incuber les cellules sur la glace pour 15 mdans de blocage d&#39;anticorps puis les compter en utilisant un hématimètre. </li><li> Faire tourner les cellules vers le bas et les remettre en suspension à la concentration de 10 millions de cellules / ml dans 2% de FBS / HBSS. </li><li> Mettre de côté 1 million de cellules par la tache, unique teinté (HNK-1 seulement et p75 seulement) et l&#39;anticorps secondaire taché seulement (APC seulement et 488 uniquement) FACS contrôle. </li><li> Ajouter 5 ul de HNK-1 et 5 pi de p75 anticorps primaire par 10 millions de cellules dans 1 ml de suspension pour les échantillons appropriés et incuber pendant 20 min sur la glace. </li><li> Laver les cellules dans 10 ml de PBS 1x (centrifugeuse 5 min à 114 x g) et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Ajouter 2 ul d&#39;une APC et 488 ul de l&#39;anticorps secondaire par 10 millions de cellules dans 1 ml de suspension appropriés pour les échantillons et incuber pendant 20 min sur de la glace dans l&#39;obscurité. Remarque: APC et 488 sont les anticorps secondaires utilisés ici pour la coloration HNK-1 et p75, respectivement. </li><li> Laver les cellules dans 10 ml 1x PBS deux fois, remettre en suspension 10 millions de cellules dans 500 ul de2% de FBS / HBSS contenant DAPI (0,5 ng / ul) ou alternatif coloration de cellules vivantes appropriées d&#39;exclure les cellules mortes de l&#39;analyse FACS. </li><li> Transférer les échantillons de s&#39;approprier tubes FACS. </li><li> Préparer des tubes FACS avec 0,5 ml de 2% de FBS / HBSS à la collecte de cellules. Remarque: Les cellules et les tubes de prélèvement sont conservés sur de la glace dans l&#39;obscurité pendant le temps de tri. </li><li> En utilisant une machine de tri cellulaire avec des lasers qui peuvent détecter DAPI, APC et 488 tri DAPI-/HNK-1 + / P75 + cellules doubles positives. Note: Temps de préparation et de manipulation des cellules conduit à un faible pourcentage de la mort cellulaire, taches DAPI des cellules mortes permet seulement et donc pour ces cellules doivent être exclues de la population triée. Toute tache en direct / morts de remplacement fonctionne aussi bien à cette fin. DAPI lui-même ne provoque pas de cytotoxicité dans la population de cellules vivantes. </li></ol> 6. Replacage de cellules triées, NC Agrandissement et entretien Remarque: les cellules triées par FACS doit être la mainconduit avec un soin particulier pour assurer la survie optimale. Gardez-les sur de la glace jusqu&#39;à ce que leur réensemencement. Ne pas vortex ou la pipette avec dureté. Les cellules peuvent être remises en suspension par agitation du tube. <ol><li> Après tri FACS, compter les cellules NC, puis tournez-les vers le bas et remettre en suspension dans un milieu N2 différenciation complété avec 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml d&#39;EGF et 10 uM Y-27632 dichlorhydrate dans le volume approprié de les Réensemencement à 30 000 cellules / 10 ul de gouttelettes. </li><li> Bien sécher préalablement préparé PO / plaques Lam / FN et plaque environ 50-70 gouttes par boîte de 10 cm. Laissez les plats s&#39;élèvent à température ambiante pendant 20-30 min. </li><li> Ajouter très soigneusement 20 ml/10 cm plat de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sans déranger les gouttelettes. Incuber les cellules à 37 ° C. </li><li> Nourrir les cellules tous les 2-3 jours avec N2/FGF2/EGF. Remarque: les cellules NC sont développés ou des passages environ tous les 4-5 jours ou quand ils commencent à s&#39;accumuler dans les gouttelettes. </li><li> Pour le passage des cellules NC, supprimer le support, wash les cellules une fois avec PBS 1x et ajouter 8 ml accutase/10 cm plat. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Introduire à la pipette les cellules de la plaque à l&#39;aide d&#39;une pipette de 5 ml et transférer dans un tube de 15 ml. Ajouter 6 ml 1x PBS. </li><li> Faites tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un milieu N2-différenciation supplémenté avec 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml d&#39;EGF et 10 uM Y-27632, dichlorhydrate afin d&#39;avoir 20 000 cellules/10 ul gouttelette. </li><li> Réensemencement les cellules dans 10 gouttes de pi sur des plaques PO / Lam / FN secs. Laissez les plats s&#39;élèvent à température ambiante pendant 20-30 min. </li><li> Ajouter avec précaution 20 ml/10 cm plat de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Incuber à 37 ° C. Remarque: les cellules NC peuvent être maintenues ou développées pour 2 semaines en tant que population de progéniteurs relativement homogène. Culture plus peut les amener à se différencier en divers types de cellules de la descendance. </li></ol>

<ol><li>Lee, G., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease.</a> Nat Methods. 7, 25-27 (2010).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+using+familial+dysautonomia+induced+pluripotent+stem+cells+identifies+compounds+that+rescue+IKBKAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression.</a> Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).</li>
<li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+developmental+toxicants+and+signaling+pathways+in+a+functional+test+based+on+the+migration+of+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells.</a> Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).</li>
<li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+progenitors+and+stem+cells%3A+from+early+development+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Dev Biol. 366, 83-95 (2012).</li>
<li>McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%3A+a+developmental+disorder+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).</li>
<li>Slaugenhaupt, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+a+splicing+mutation+in+the+IKBKAP+gene+causes+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia.</a> Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).</li>
<li>Cheung, N. K., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+developmental+biology%2C+cancer+genomics+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+establishment+of+hemopoietic+supportive+stromal+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow.</a> Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).</li>
<li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+subtype+specification+of+fertilization+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells+and+application+in+parkinsonian+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice.</a> Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).</li>
<li>Elkabetz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes Dev. 22, 152-165 (2008).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neural+crest+induction%2C+melanocyte+specification%2C+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).</li>
<li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi-1+dependence+distinguishes+neural+stem+cell+self-renewal+from+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.</a> Nature. 425, 962-967 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt à divulguer contradictoires.

Pour la différenciation réussie de cellules R-NC de CSEh / hiPSCs les considérations suivantes doivent être prises. Il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles à tout moment. En particulier, il est important de tester les cultures HPSC pour contamination par des mycoplasmes régulièrement, depuis cette contamination va entraver la différenciation réussie, mais ne peut pas être facilement détecté visuellement dans les cultures HPSC. La différenciation R-NC doit être instauré à la densité cellula...

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) ont montré un immense potentiel, en particulier pour l&#39;enquête et le traitement futur des maladies humaines, pour laquelle aucun des modèles animaux de bonnes ni de tissus primaires sont disponibles. Exemples d&#39;applications pour la technologie CSEh / hiPSC sont les suivantes: les cellules d&#39;intérêt particulier peuvent être générés à partir de CSEh / hiPSCs pour la médecine régénérative à une quantité illimitée. Les cellules peuvent être produites à partir de patients porteurs d&#39;une maladie spécifique et utilisées pour établir des modèles in vitro de la maladie 2,3. Ces modèles de la maladie peuvent alors être utilisés pour le dépistage de drogues à grande échelle dans la recherche de nouveaux composés médicamenteux 4 ainsi que les essais de médicaments existants pour l&#39;efficacité et la toxicité du 5. Dans des modèles de maladie in vitro peuvent conduire à l&#39;identification des mécanismes de la maladie de nouveaux. Pour toutes les applications de la technologie CSEh / iPSC il est important de travailler avec spécifique, bien définirtypes d cellulaires touchées dans la maladie d&#39;intérêt. Ainsi, la disponibilité de protocoles de différenciation in vitro solides et reproductibles est essentiel pour toutes les applications de la technologie CSEh / hiPSC. Protocoles sont souhaitables qui montrent une variabilité minimale, dépense de temps, d&#39;efforts, la difficulté et le coût ainsi que la reproductibilité maximale entre les lignes CSEh / hiPSC et différents chercheurs. Cellules de la crête neurale (NC) apparaissent pendant la neurulation vertébrés entre l&#39;épiderme et l&#39;épithélium neural. Elles prolifèrent et migrent largement tout au long de l&#39;embryon en développement et donnent lieu à une impressionnante diversité de types de cellules de la descendance, y compris des os / du cartilage, du squelette cranio-facial, les nerfs sensoriels, les cellules de Schwann, les mélanocytes, les cellules musculaires lisses, les neurones entériques, neurones autonomes, des cellules chromaffines , les cellules du septum cardiaque, des dents et des surrénales / thyroïde cellules glandulaires 6. Ainsi, des cellules NC sont un type de cellule attractive pour le domaine des cellules souches et important pour lemodélisation d&#39;une variété de maladies, telles que la maladie de Hirschsprung 7, dysautonomie familiale 8, ainsi que les cancers tels que le neuroblastome 9. En outre, ils offrent la possibilité d&#39;étudier les aspects du développement embryonnaire humain in vitro. Actuellement disponibles et largement utilisés dans le protocole de différenciation in vitro pour la dérivation de cellules NC à partir de CSEh 10,11 nécessite jusqu&#39;à 35 jours de différenciation et il implique l&#39;induction neurale sur les cellules stromales de connexion telles que les cellules MS5 et est donc effectuée dans des conditions mal définies. Alors qu&#39;il peut être mis à échelle pour produire de grandes quantités de cellules NC, par exemple nécessaire pour haut débit médicament dépistage 4, c&#39;est la main-d&#39;œuvre et coûteux. En outre, elle implique des passages manuel de rosettes de neurones, ce qui peut être difficile à reproduire, et donc est soumis à une variabilité dans l&#39;ensemble, en particulier lorsqu&#39;elle est appliquée à une grande variété de hESC ou hiPSClignes. Ici, la dérivation progressive des cellules NC dans un protocole de 18 jours qui est libre de cellules nourricières est affiché. Cette méthode est plus courte et plus défini que le protocole actuellement utilisé. En outre, il est très robuste dans la génération de cellules NC entre les différentes lignes de hiPSC. Surtout, il est démontré que les cellules NC produites par les deux protocoles émergent à la frontière de rosettes neurales (ci-après appelé rosette-NC ou R-NC). Les cellules dérivées en utilisant soit des deux protocoles semblent morphologiquement identiques, ils expriment les mêmes marqueurs NC et se regroupent dans l&#39;analyse des microréseaux. Des cellules NC obtenues à l&#39;aide du nouveau protocole (R-NC) sont fonctionnels, semblables à des cellules dérivées NC en utilisant l&#39;ancien protocole (MS5-R-NC) de telle sorte qu&#39;ils peuvent migrer et se différencier en neurones supplémentaire. Par conséquent, les cellules peuvent être utilisées en même temps que les cellules MS5-R-CN. Le protocole de la cellule R-NC pour la dérivation de cellules NC à partir de CSEh / iPSC sera utile pour toutes les applications de la technologie CSEh / iPSC impliquant la lignée NC. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de veau (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Remplacement du sérum knockout</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Le lot doit être testé</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pénicinline/Streptomycine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acides aminés essentiels minimaux MEM&nbsp ;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>toxique</td></tr><tr><td>Recombinant humain FGF basique (FGF2)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 poudre&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>APO transfert humain</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Insuline humaine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de putriscine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrice</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L Bromhydrate d’ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminine-I de souris</td><td>R& ampère; D Systems</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Dispase dans la solution saline équilibrée de Hank 5 U/ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>R& D Systems</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante sonic hedgehog (SHH)</td><td>R& D Systems</td><td>464SH</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1563-080</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain recombinant</td><td>R& Gélatine D Systems</td><td>236EG</td><td></td></tr><tr><td>(PBS sans Mg/Ca)</td><td>interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td><td>Sigma</td><td>C6680-100TST</td><td>le lot doit être testé</td></tr><tr><td>Anti-p75 mIgG1 (récepteur du facteur de croissance nerveuse)</td><td>Advanced Targeting Systems</td><td>AB-N07</td><td>le lot doit être testé</td></tr><tr><td>APC rat anti-mIgM</td><td>BD Parmingen</td><td>550676</td><td>lot doit être testé</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 chèvre anti-souris IgG1&nbsp ;</td><td>Le lot d’Invitrogen</td><td>A21121</td><td>doit être testé</td></tr><tr><td>Anti Oct4 mIgG2b (utilisé à une dilution de 1:200)</td><td>Le lot Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>doit être testé</td></tr><tr><td>Matériel/Équipement :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris (7 millions de cellules/flacon)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6105M</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire : plaques de 10 cm et 15 cm, tubes à centrifuger, tubes FACS, pipettes, pipette </td> Hématocytomètre <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>en verre</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>de culture cellulaire</tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire (CO2, humidité et température contrôlées)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire de culture cellulaire avec microscope</td><td></td><td></td><td></td>intégré</tr><tr><td>Capot</td><td></td><td></td> <td>de biosécurité pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Trieuse cellulaire, i.e. MoFlo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td>inversé</tr><tr><td>1 ml TB seringue 27Gx1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Élévateur de cellules Polyéthylène</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr></tbody></table>

dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont un grand potentiel pour l&#39;étude du développement embryonnaire humain, pour la modélisation des maladies humaines dans le plat et comme une source de cellules transplantables pour des applications de régénération après la maladie ou les accidents. Les cellules de la crête neurale (CN) sont les précurseurs pour une grande variété de cellules somatiques adultes, comme les cellules du système nerveux périphérique et les cellules gliales, les mélanocytes et les cellules mésenchymateuses. Ils sont une source précieuse de cellules pour étudier les aspects du développement embryonnaire humaine, y compris la spécification du destin cellulaire et la migration. En outre la différenciation de cellules progénitrices CN en types de cellules à différenciation terminale offre la possibilité de modéliser les maladies humaines in vitro, étudier les mécanismes de la maladie et de générer des cellules pour la médecine régénératrice. Cet article présente l&#39;adaptation d&#39;un protocole in vitro de différenciation actuellement disponibles pour la dérivation de cellules NC de hPSCs. Ce nouveau protocole nécessite 18 jours de différenciation, est facilement extensible et hautement reproductible entre cellules embryonnaires humaines (CSEh souches) des lignes ainsi que les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) des lignes sans chargeur. Les anciens et les nouveaux protocoles donnent des cellules NC de l&#39;identité égale.

Les deux améliorations les plus importantes du protocole R-NC-dessus du protocole MS5-R-CN 11 sont les conditions de différenciation, définies libre-desserte et le raccourcissement global de l&#39;exigence de délai. MS5 cellules nourricières 13 sont des cellules murines de moelle osseuse provenant stromales qui ont été présentés à l&#39;appui différenciation neurale de CSEh 14. HESCs cultivées sur des cellules nourricières MS5 à former des structures épithéliales de faible densité et des...

Crête neurale (NC) des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation du développement humain et de la maladie et des thérapies de remplacement cellulaire. Ici, une adaptation libre-alimentation de l&#39;a largement utilisé<em&gt; In vitro</em&gt; Protocole de différenciation pour la dérivation de cellules NC de hPSCs est présenté.

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules progénitrices de la crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines selon un protocole défini, reproductible et rapide. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées soit pour l'étude de maladies liées à la crête neurale in vitro, soit pour poursuivre leur différenciation en cellules descendantes. Ceci est réalisé en semant d'abord une forte densité de cellules souches pluripotentes humaines en monocouche sur du Matrigel.La deuxième étape consiste à différencier les cellules en cellules neuro-épithéliales à l'aide d'une séquence définie et d'une combinaison de petites molécules qui affectent des voies de signalisation clés. Ensuite, les cellules neuro-épithéliales sont repiquées et différenciées davantage en cellules progénitrices de la crête neurale. La dernière étape consiste à isoler les cellules de la crête neurale par tri cellulaire activé par fluorescence.En fin de compte, l'immunofluorescence et des tests fonctionnels, tels que la capacité des cellules à migrer, sont utilisés pour démontrer que des cellules de la crête neurale appropriées ont été générées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants pour l'obtention de cellules de la crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines réside dans sa brièveté. Elle dure seulement 18 jours.Il est plus reproductible en raison de l'absence de cellules nourricières MS5. Il est facile à amplifier et il est hautement reproductible entre différentes lignées de cellules souches pluripotentes humaines. Les implications de cette technique s'étendent aux études des mécanismes des maladies humaines liées à la lignée neurore, et montrent un potentiel pour améliorer la modélisation in vitro détaillée et le criblage de médicaments pour ces maladies.Avant de commencer ce protocole, vérifiez que les colonies de cellules souches pluripotentes humaines sont suffisamment grandes pour être visibles à l’œil nu et présentent encore des bords nets avec peu de cellules différenciées à leurs extrémités. Lorsque les CSPH sont prêtes à être divisées, aspirez le milieu, rincez une fois avec cinq millilitres de PBS 1X et ajoutez quatre millilitres de tripsine 0,05 % avec EDTA aux cellules. Secouez ensuite vigoureusement la boîte horizontalement pendant deux minutes, jusqu’à ce que les fibroblastes embryonnaires de souris se détachent de la plaque et apparaissent au microscope comme des cellules isolées.Les colonies de HPSC resteront attachées à la boîte sous forme de colonies, puis aspirez immédiatement et complètement la trypsine et laissez la plaque à température ambiante pendant deux à quatre minutes. Ajoutez deux millilitres de milieu HES dans la plaque et utilisez une pipette P 1000 pour détacher les cellules. Si les cellules ne se détachent pas facilement, incubez la plaque pendant deux à trois minutes supplémentaires.À température ambiante, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres contenant huit millilitres de milieu HES, supplémenté avec 10 micromolaire de Y 2 7 6 3 2 dihydrochlorure. Ensuite, aspirez le matrigel d'une plaque de 10 centimètres traitée précédemment et semez les cellules selon un rapport de un pour un ou un pour deux sur la plaque traitée au matrigel. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.Alimentez les cellules quotidiennement avec le milieu HES jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour la différenciation. Commencez alors la différenciation neuronale lorsque les cellules présentent une confluence de 90 % à 100 %. Ce jour correspond au jour zéro.Alimentez les cellules quotidiennement du jour zéro au jour trois avec 10 millilitres de milieu de différenciation KSR contenant 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 431542. Ensuite, aux jours quatre et cinq, alimentez les cellules avec 10 millilitres de milieu contenant 75 % de milieu de différenciation KSR et 25 % de milieu de différenciation And two, ainsi que 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 431542. Aux jours six et sept, alimentez les cellules avec un milieu ajusté pour contenir 50 % de milieu de différenciation KSR et 50 % de milieu de différenciation And two, en plus d’être supplémenté avec 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 431542.Pour les jours 8 à 9, nourrissez les cellules avec un milieu de différenciation composé de 25 % de KSR et de 75 % de milieu de différenciation, contenant tous deux 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 4352. Ensuite, aux jours 9 et 10, préparez des boîtes de culture recouvertes de poly-L-ornithine, de laminine 1 et de fibronectine, comme décrit dans le protocole du texte, qui seront utilisées pour la repiquage des cellules. Au jour 11, nourrissez les cellules avec le milieu de différenciation N2, supplémenté de 0,1 micromolaire de LDN 193109 et de 10 micromolaires de SB 431542. Aux jours 10 et 11, aspirez la solution de laminine 1 et de fibronectine des boîtes de culture préalablement préparées et laissez-les sécher à température ambiante dans une hotte de culture tissulaire pendant 20 à 30 minutes.Ensuite, retirez le milieu des cellules en différenciation et rincez les cellules une fois avec un XPBS. Ajoutez alors huit millilitres d'acuate par plaque de 10 centimètres et incubez les plaques pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, utilisez un détacheur cellulaire pour détacher les cellules, puis resuspendez-les dans la solution d'Accutane.Avec une pipette de cinq millilitres, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de PBS 1X dans le tube et centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 115 ×g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot cellulaire dans 10 millilitres de PBS 1X. Puis, filtrez la suspension cellulaire à travers un tamis de 40 microns afin d'obtenir une suspension monocellulaire.Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Centrifugez à nouveau les cellules pendant cinq minutes à 115 G et remettez en suspension les cellules à une concentration de 100 000 à 150 000 cellules par 10 microlitres de milieu de différenciation N deux complémenté. Utilisez une pipette répétitive pour déposer des gouttes de 10 microlitres de la suspension cellulaire dans des boîtes de culture de 15 centimètres préalablement traitées avec du poly L orhan.Lamine un et fibronectine. Laisser les gouttes reposer à température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Ensuite, ajouter très soigneusement 30 millilitres du milieu de différenciation N deux supplémenté dans la plaque sans perturber les gouttes.Incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Au jour 12, ajouter délicatement 20 millilitres de milieu de différenciation N2 contenant 200 micromolaire d'acide ascorbique, 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau, 100 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes huit et 20 nanogrammes par millilitre de sonic hedgehog par boîte de 15 centimètres.Ensuite, du jour 14 au jour 17, nourrissez les cellules tous les deux à trois jours avec le milieu de différenciation N2 contenant uniquement 200 micromoles d'acide ascorbique, 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau et 100 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes huit. Préparez les plaques avec de la poly-L-ornithine, de la laminine et de la fibronectine respectivement aux jours 16 et 17, destinées à la resemis des cellules de la crête neurale.Après l'analyse par fax au jour 18, une fois les cellules triées par trieur cellulaire à fluorescence activée, compter les cellules de la crête neurale, puis les centrifuger à 115 G pendant cinq minutes. Résuspender le culot cellulaire dans le milieu de différenciation N deux supplémenté avec 10 nanogrammes par millilitre.FGF2 à 20 nanogrammes par millilitre, EGF et Y-27632 dihydrochlorure à 10 micromoles, à une concentration de 30 000 cellules par 10 microlitres. Sécher soigneusement les boîtes de culture préalablement préparées avec de la poly-L-ornithine, de la laminine 1 et de la fibronectine. Ensuite, déposer environ 50 à 70 gouttes de la suspension cellulaire par boîte de 10 centimètres.Incuber les cellules à température ambiante pendant 15 à 20 minutes dans 20 millilitres de N deux. Milieu de différenciation supplémenté avec 10 nanogrammes par millilitre. FGF deux 20 nanogrammes par millilitre EGF et 10 micromolaire Y 2 7 6 3 2 dihydrochlorure dans chaque boîte de 10 centimètres sans perturber les gouttelettes.Incuber ensuite les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, entretenir et repiquer les cellules de la crête neurale selon le protocole décrit dans le texte accompagnant ; les cellules de la crête neurale ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes humaines en 18 jours, en utilisant ce nouveau protocole de différenciation in vitro sans cellules nourricières.L'analyse par FACS réalisée au jour 18 a identifié des cellules positives à la fois pour HNK-1 et P75, confirmant ainsi la présence de cellules de la crête neurale. Dans les deux protocoles, celui sans cellules nourricières et celui dépendant de cellules nourricières, les cellules de la crête neurale sont passées par un stade de rosette neurale. De plus, les cellules triées par FACS présentent une morphologie identique et expriment les marqueurs de la crête neurale, HNK-1 et P75 ; une comparaison de l'expression génique globale des cellules de la crête neurale issues de ces deux protocoles de différenciation a révélé que les deux populations cellulaires se regroupent étroitement. L'analyse de la capacité de migration des cellules de la crête neurale obtenues à l'aide du protocole sans cellules nourricières a montré que les cellules migraient correctement dans la rayure après 48 heures. Ces cellules possèdent également le potentiel de se différencier en cellules du système nerveux autonome, comme confirmé par une coloration positive pour mash one et touch one après quatre jours supplémentaires de différenciation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de neuraliser des cellules souches pluripotentes humaines et d'obtenir in vitro des cellules progénitrices de la crête neurale.

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Pour cultiver des cellules souches neurales de crête (NCSC) in vitro, un milieu spécial (NCSCM) est nécessaire. Partie essentielle de NCSCM est extrait d'embryon de poulet (PECO). Nous décrivons ici les techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO, y compris des détails comme l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration.

Production d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet pour la culture des neurones murins Cellules souches Crest

Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

Isolement de la crête neurale embryonnaire à partir du tube neural facilite l'utilisation...

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

Les protocoles de différenciation neuronale des cellules souches humaines pluripotentes (hPSCs) sont souvent beaucoup de temps et nécessitera d'importantes compétences de culture cellulaire. Ici, nous avons adapté une procédure de différenciation petite molécule à base d'un format de plaque multititre, permettant la génération simple, rapide et efficace des neurones humains d'une manière contrôlée.

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Ce travail décrit un protocole de différenciation in vitro pour produire pigmentées, mélanocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines par une crête neurale et mélanoblaste étape intermédiaire en utilisant un protocole de 25 jours sans alimentation.

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

Nous présentons un protocole de différenciation in vitro tridimensionnel (3D) générant des neurosphères de taille reproductible pour produire des cellules de crête neurale crânienne à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Nous montrons que cette méthodologie réduit la variabilité par rapport aux protocoles précédents et comment elle peut être utilisée pour le dosage multiplexé afin d’étudier le développement des cellules de la crête neurale crânienne.

Cellules de crête neurale crânienne : protocole de différenciation in vitro tridimensionnelle pour le dosage multiplexé

Découvrez un protocole sans chargeur pour dériver des cellules progénitrices de la crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode de 18 jours utilise des petites molécules et le tri cellulaire pour étudier les maladies liées à la crête neurale.

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Explorer plus de vidéos