Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules progénitrices de la crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines selon un protocole défini, reproductible et rapide. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées soit pour l'étude de maladies liées à la crête neurale in vitro, soit pour poursuivre leur différenciation en cellules descendantes. Ceci est réalisé en semant d'abord une forte densité de cellules souches pluripotentes humaines en monocouche sur du Matrigel.

La deuxième étape consiste à différencier les cellules en cellules neuro-épithéliales à l'aide d'une séquence définie et d'une combinaison de petites molécules qui affectent des voies de signalisation clés. Ensuite, les cellules neuro-épithéliales sont repiquées et différenciées davantage en cellules progénitrices de la crête neurale. La dernière étape consiste à isoler les cellules de la crête neurale par tri cellulaire activé par fluorescence.

En fin de compte, l'immunofluorescence et des tests fonctionnels, tels que la capacité des cellules à migrer, sont utilisés pour démontrer que des cellules de la crête neurale appropriées ont été générées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants pour l'obtention de cellules de la crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines réside dans sa brièveté. Elle dure seulement 18 jours.

Il est plus reproductible en raison de l'absence de cellules nourricières MS5. Il est facile à amplifier et il est hautement reproductible entre différentes lignées de cellules souches pluripotentes humaines. Les implications de cette technique s'étendent aux études des mécanismes des maladies humaines liées à la lignée neurore, et montrent un potentiel pour améliorer la modélisation in vitro détaillée et le criblage de médicaments pour ces maladies.

Avant de commencer ce protocole, vérifiez que les colonies de cellules souches pluripotentes humaines sont suffisamment grandes pour être visibles à l’œil nu et présentent encore des bords nets avec peu de cellules différenciées à leurs extrémités. Lorsque les CSPH sont prêtes à être divisées, aspirez le milieu, rincez une fois avec cinq millilitres de PBS 1X et ajoutez quatre millilitres de tripsine 0,05 % avec EDTA aux cellules. Secouez ensuite vigoureusement la boîte horizontalement pendant deux minutes, jusqu’à ce que les fibroblastes embryonnaires de souris se détachent de la plaque et apparaissent au microscope comme des cellules isolées.

Les colonies de HPSC resteront attachées à la boîte sous forme de colonies, puis aspirez immédiatement et complètement la trypsine et laissez la plaque à température ambiante pendant deux à quatre minutes. Ajoutez deux millilitres de milieu HES dans la plaque et utilisez une pipette P 1000 pour détacher les cellules. Si les cellules ne se détachent pas facilement, incubez la plaque pendant deux à trois minutes supplémentaires.

À température ambiante, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres contenant huit millilitres de milieu HES, supplémenté avec 10 micromolaire de Y 2 7 6 3 2 dihydrochlorure. Ensuite, aspirez le matrigel d'une plaque de 10 centimètres traitée précédemment et semez les cellules selon un rapport de un pour un ou un pour deux sur la plaque traitée au matrigel. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Alimentez les cellules quotidiennement avec le milieu HES jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour la différenciation. Commencez alors la différenciation neuronale lorsque les cellules présentent une confluence de 90 % à 100 %. Ce jour correspond au jour zéro.

Alimentez les cellules quotidiennement du jour zéro au jour trois avec 10 millilitres de milieu de différenciation KSR contenant 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 431542. Ensuite, aux jours quatre et cinq, alimentez les cellules avec 10 millilitres de milieu contenant 75 % de milieu de différenciation KSR et 25 % de milieu de différenciation And two, ainsi que 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 431542. Aux jours six et sept, alimentez les cellules avec un milieu ajusté pour contenir 50 % de milieu de différenciation KSR et 50 % de milieu de différenciation And two, en plus d’être supplémenté avec 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 431542.

Pour les jours 8 à 9, nourrissez les cellules avec un milieu de différenciation composé de 25 % de KSR et de 75 % de milieu de différenciation, contenant tous deux 0,1 micromolaire de LDN 193189 et 10 micromolaires de SB 4352. Ensuite, aux jours 9 et 10, préparez des boîtes de culture recouvertes de poly-L-ornithine, de laminine 1 et de fibronectine, comme décrit dans le protocole du texte, qui seront utilisées pour la repiquage des cellules. Au jour 11, nourrissez les cellules avec le milieu de différenciation N2, supplémenté de 0,1 micromolaire de LDN 193109 et de 10 micromolaires de SB 431542. Aux jours 10 et 11, aspirez la solution de laminine 1 et de fibronectine des boîtes de culture préalablement préparées et laissez-les sécher à température ambiante dans une hotte de culture tissulaire pendant 20 à 30 minutes.

Ensuite, retirez le milieu des cellules en différenciation et rincez les cellules une fois avec un XPBS. Ajoutez alors huit millilitres d'acuate par plaque de 10 centimètres et incubez les plaques pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, utilisez un détacheur cellulaire pour détacher les cellules, puis resuspendez-les dans la solution d'Accutane.

Avec une pipette de cinq millilitres, transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de PBS 1X dans le tube et centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 115 ×g. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot cellulaire dans 10 millilitres de PBS 1X. Puis, filtrez la suspension cellulaire à travers un tamis de 40 microns afin d'obtenir une suspension monocellulaire.

Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Centrifugez à nouveau les cellules pendant cinq minutes à 115 G et remettez en suspension les cellules à une concentration de 100 000 à 150 000 cellules par 10 microlitres de milieu de différenciation N deux complémenté. Utilisez une pipette répétitive pour déposer des gouttes de 10 microlitres de la suspension cellulaire dans des boîtes de culture de 15 centimètres préalablement traitées avec du poly L orhan.

Lamine un et fibronectine. Laisser les gouttes reposer à température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Ensuite, ajouter très soigneusement 30 millilitres du milieu de différenciation N deux supplémenté dans la plaque sans perturber les gouttes.

Incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Au jour 12, ajouter délicatement 20 millilitres de milieu de différenciation N2 contenant 200 micromolaire d'acide ascorbique, 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau, 100 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes huit et 20 nanogrammes par millilitre de sonic hedgehog par boîte de 15 centimètres.

Ensuite, du jour 14 au jour 17, nourrissez les cellules tous les deux à trois jours avec le milieu de différenciation N2 contenant uniquement 200 micromoles d'acide ascorbique, 20 nanogrammes par millilitre de facteur neurotrophique dérivé du cerveau et 100 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes huit. Préparez les plaques avec de la poly-L-ornithine, de la laminine et de la fibronectine respectivement aux jours 16 et 17, destinées à la resemis des cellules de la crête neurale.

Après l'analyse par fax au jour 18, une fois les cellules triées par trieur cellulaire à fluorescence activée, compter les cellules de la crête neurale, puis les centrifuger à 115 G pendant cinq minutes. Résuspender le culot cellulaire dans le milieu de différenciation N deux supplémenté avec 10 nanogrammes par millilitre.

FGF2 à 20 nanogrammes par millilitre, EGF et Y-27632 dihydrochlorure à 10 micromoles, à une concentration de 30 000 cellules par 10 microlitres. Sécher soigneusement les boîtes de culture préalablement préparées avec de la poly-L-ornithine, de la laminine 1 et de la fibronectine. Ensuite, déposer environ 50 à 70 gouttes de la suspension cellulaire par boîte de 10 centimètres.

Incuber les cellules à température ambiante pendant 15 à 20 minutes dans 20 millilitres de N deux. Milieu de différenciation supplémenté avec 10 nanogrammes par millilitre. FGF deux 20 nanogrammes par millilitre EGF et 10 micromolaire Y 2 7 6 3 2 dihydrochlorure dans chaque boîte de 10 centimètres sans perturber les gouttelettes.

Incuber ensuite les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, entretenir et repiquer les cellules de la crête neurale selon le protocole décrit dans le texte accompagnant ; les cellules de la crête neurale ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes humaines en 18 jours, en utilisant ce nouveau protocole de différenciation in vitro sans cellules nourricières.

L'analyse par FACS réalisée au jour 18 a identifié des cellules positives à la fois pour HNK-1 et P75, confirmant ainsi la présence de cellules de la crête neurale. Dans les deux protocoles, celui sans cellules nourricières et celui dépendant de cellules nourricières, les cellules de la crête neurale sont passées par un stade de rosette neurale. De plus, les cellules triées par FACS présentent une morphologie identique et expriment les marqueurs de la crête neurale, HNK-1 et P75 ; une comparaison de l'expression génique globale des cellules de la crête neurale issues de ces deux protocoles de différenciation a révélé que les deux populations cellulaires se regroupent étroitement.

L'analyse de la capacité de migration des cellules de la crête neurale obtenues à l'aide du protocole sans cellules nourricières a montré que les cellules migraient correctement dans la rayure après 48 heures. Ces cellules possèdent également le potentiel de se différencier en cellules du système nerveux autonome, comme confirmé par une coloration positive pour mash one et touch one après quatre jours supplémentaires de différenciation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de neuraliser des cellules souches pluripotentes humaines et d'obtenir in vitro des cellules progénitrices de la crête neurale.