Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge

L’objectif général de cette procédure est de sonder la dynamique de la protonation et des changements de confirmation de deux protéines membranaires photosensibles à l’aide de la spectroscopie FTIR à balayage STEP résolue en temps. Ceci est accompli en formant d’abord un film protéique hydraté dont l’absorption infrarouge sera sondée soit dans une configuration de réflexion totale atténuée pour l’opsine bactérienne, soit dans une configuration de transmission pour le canal Rodin deux. La deuxième étape consiste à exciter l’échantillon avec un flash laser nanoseconde de longueur d’onde appropriée pour initier une réaction photocyclique dans la protéine en détectant les changements résolus en temps de l’intensité de la lumière infrarouge interagissant avec l’échantillon.

Ensuite, le processus ci-dessus est répété à des positions discrètes du miroir mobile d’un interféromètre qui contrôle la différence de chemin optique entre deux faisceaux divisés jusqu’à ce qu’un interférogramme résolu dans le temps complet soit enregistré. La dernière étape consiste à transformer l’interférogramme résolu en temps en un spectre d’absorption de différence IR résolu dans le temps en utilisant la transformée de Fourier et la loi de la bière de Lambert. En fin de compte, l’évolution temporelle des bannissements, en particulier dans les régions carboxyliques à double liaison MI et CO, est inspectée pour obtenir la dynamique des changements de confirmation et de protonation dans la protéine.

Le principal avantage de la technique de la plupart des méthodes expérimentales existantes est qu’elle résout les changements de protonation transitoires dans les protéines. De plus, il le fait sur des échelles de temps de l’ordre du micro et de la milliseconde, la plage de temps la plus pertinente pour sonder la fonctionnalité des protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biophysique moléculaire et de la science des protéines, telles que quels résidus du protonate et quand ils le font au cours du mécanisme fonctionnel d’une protéine ou lorsque des changements majeurs dans les protéines se produisent.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Victor Ria, associé de recherche de mon laboratoire, le premier montage, la réflectance totale atténuée ou un accessoire TR dans le compartiment d’échantillonnage du spectromètre FTIR. Mesurez un large spectre d’énergie à quatre centimètres inverses. La résolution de la surface propre de l’élément de réflexion interne par spectroscopie FTIR à balayage rapide conventionnelle recouvre la surface de l’A TR avec 20 microlitres du tampon à haute force ionique utilisé ultérieurement pour réhydrater l’échantillon.

Mesurez ensuite l’absorption IR du tampon. Ensuite, retirez le tampon et rincez la surface à l’eau sans la toucher. Éliminez le liquide résiduel par un flux d’air intense étalé environ trois microlitres d’une solution protéique de six milligrammes par millilitre de bactéries Rodin en membrane violette sur le dessus de la surface.

Faites sécher la suspension protéique sous un léger jet d’air sec jusqu’à l’obtention d’un film. Mesurez ensuite le spectre d’absorption du film sec. Ensuite, ajoutez doucement 20 à 40 microlitres de tampon à haute force ionique pour réhydrater le film sec.

Couvrez le support A TR avec un couvercle pour éviter l’évaporation de l’eau et le spectre absorbant. Estimez le pourcentage d’échantillon restant près de la surface après la réhydratation du film en soustrayant le spectre d’absorption du tampon. À ce stade, ajoutez 10 microlitres de canal d’opsine deux dissous en décembre dans un tampon de faible force ionique au centre d’une fenêtre de fluorure de baryum de 20 millimètres de diamètre.

Étalez la solution à l’aide de la pointe de la micropipette sur un diamètre de six à huit millimètres en utilisant un léger flux d’air sec, un film chaud homogène dont le diamètre correspond à peu près à la taille du faisceau IR à la plus grande ouverture. Ensuite, utilisez un joint torique plat en silicone d’un millimètre d’épaisseur. Hydratez le film en ajoutant trois à cinq microlitres d’un mélange de glycérol et d’eau réparti en trois à cinq gouttes autour du film sec et fermez-le hermétiquement avec une deuxième fenêtre.

Insérez les fenêtres en sandwich au fluorure de baryum dans un support. Placez ensuite le support dans le compartiment à échantillons. Mesurez un spectre d’absorption.

Vérifiez que l’absorption maximale dans la région de l’amide un est comprise entre 0,6 et 1,0 pour la configuration A TR. Utilisez une fibre optique placée sur le couvercle de l’A TR pour coupler le laser à l’échantillon. Ajustez la densité d’énergie du laser sur l’échantillon à deux à trois millijoules par centimètre carré par impulsion.

À l’aide d’un wattmètre ou des expériences de transmission, utilisez des miroirs pour amener le laser vers l’échantillon et, si nécessaire, des lentilles pour assembler ou dévier le faisceau laser vers un diamètre légèrement supérieur à la taille du film de l’échantillon. Synchronisez l’impulsion laser avec l’enregistrement des données à l’aide de l’interrupteur Q. Synchronisez l’impulsion TTL de l’électronique du laser à grenat d’aluminium atrium de néodyme pour déclencher le convertisseur analogique-numérique du spectromètre.

Réglez le taux d’excitation du laser pour effectuer la résolution du temps. Mesures de balayage pas à pas dans la gamme spectrale de 1800 à 850 centimètres inverses. Placez dans le chemin optique un filtre passe-bas opaque au-dessus de 1 950 centimètres inverses et avec une bonne transmission en dessous de 1800 centimètres inverses.

Changez ensuite le détecteur du mode couplé AC au mode couplé DC. À ce stade, ramenez le niveau DC de l’INTERFÉROGRAMME à zéro en appliquant une polarisation de courant au détecteur. Réajustez le gain électronique pour mieux utiliser la plage dynamique du convertisseur analogique-numérique.

Ensuite, démarrez le menu de balayage par étapes du spectromètre FTIR. Définissez la bande passante spectrale cible pour la mesure de balayage par paliers sur un huitième du nombre d’ondes laser hélium-néon. Réglez la résolution spectrale et la résolution de phase sur huit centimètres inverses et 64 centimètres inverses respectivement.

Sélectionnez une fonction appe. Réglez ensuite le mode d’acquisition INTERFÉROGRAMME sur un seul côté vers l’avant. Réglez le taux d’échantillonnage du convertisseur analogique-numérique au plus élevé disponible dans le spectromètre.

Définissez le déclencheur de l’expérience sur externe. Définissez ensuite le nombre de points de données espacés linéairement à enregistrer, y compris 100 points de déclenchement prédéfinis. Ensuite, réglez le nombre de co-éditions ou le nombre de moyennes de la photoréaction par position de miroir et démarrez l’expérience.

Enfin, répétez l’expérience 10 fois pour les bactéries, redsin, et 35 fois sur trois films d’échantillons différents pour le canal redsin deux pour avoir environ 200 ajouts de co par position de miroir. Lors de l’utilisation de tampons à faible force ionique, le film se dilate excessivement, réduisant la quantité de protéines sondées par le champ évanescent. La dépendance exacte entre le gonflement du film et la force ionique tampon dépendra entre autres facteurs de la nature des lipides.

Le gonflement du film après l’hydratation nécessite du temps pour atteindre la stabilisation des bactéries de dosine. Dans la membrane violette, le processus est mono exponentiel avec une constante de temps de 12 minutes. Un tracé 3D à partir d’un balayage par étapes résolu en temps typique, expérience FDIR sur des bactéries.

Redsin est montré ici. Les spectres peuvent être extraits à des moments précis. Par exemple, lorsque les états intermédiaires du photocycle de la bactérie redsin devraient atteindre leur population la plus élevée.

Dans le temps de photocycle de la tige bactérienne Dossin, les traces d’absorbance changent à 1 762 centimètres inverses. Rapports sur la dynamique de déprotonation de la protonation de l’aspartate 85 et à 1 741 centimètres inverses sur les changements de liaison hydrogène et la dynamique de reproduction de la déprotonation de l’acide aspartique.96. Le temps s’arrête à 1 670 et 1 555 centimètres inversés.

Rendre compte des changements dans les vibrations MI un et deux, qui sont toutes deux sensibles à la confirmation du squelette peptidique. En suivant cette méthode, d’autres techniques telles que la neurogenèse dirigée ou la spectroscopie enzymatique rétinienne peuvent être effectuées afin d’attribuer une bande vibratoire à des résidus spécifiques dans la protéine après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biophysique moléculaire pour explorer le mécanisme fonctionnel de nombreuses protéines différentes entraînées par la lumière.