Name: Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Découvrez la spectroscopie infrarouge FTIR step-scan résolue en temps pour étudier les transferts de protons et changements conformationnels dans les protéines membranaires photosensibles. Cette méthode offre une résolution temporelle microseconde-millisecondes essentielle à la biophysique moléculaire.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). Nous remercions Tom Resler et Björk Süss pour leurs commentaires utiles.

1. Aspects généraux de l&#39;échantillon et préparation Instrument <ol><li> Utilisez un spectromètre FT-IR commercial équipé pour l&#39;étape de balayage des mesures résolues en temps. Pour de meilleurs résultats placent le spectromètre FT-IR sur le dessus d&#39;une table de vibration découplé. </li><li> Évacuer le compartiment optique de quelques mbar. Purger le compartiment d&#39;échantillon avec de l&#39;air sec ou de l&#39;azote. </li><li> Placer un matériau transparent au rayonnement IR opaque visible à l&#39;avant du détecteur MCT du spectromètre FT-IR. Cette précaution est indispensable pour éviter des artefacts de l&#39;impulsion laser excitant au cours des expériences étape de numérisation. Remarque: Nous utilisons un germanium (Ge) fenêtre de 25 mm de diamètre. Son indice de réfraction élevé provoque intensité indésirable perd, en grande partie évité en utilisant un filtre Ge avec revêtement antireflet. </li><li> Refroidir le détecteur MCT Dewar d&#39;azote liquide. Remarque: L&#39;utilisation de détecteurs photovoltaïques MCT est préféré à cause de leur photoconductives réponse linéaire et, par conséquent, supérieure photometric exactitude et la fiabilité de référence 31,53. </li><li> Pré-concentrer l&#39;échantillon utilisé pour les expériences est d&#39;au moins 2 mg de protéine / ml dans un tampon de faible (&lt;20 mM) de force ionique pour prévenir la formation de cristaux de sel, tout en séchant la suspension de protéines pour former un film de protéine homogène. Pour les échantillons qui sédimentent, laver / les concentrer en appliquant ultracentrifugation (par exemple, les protéines de la membrane dans une liposomes ou dans des parcelles de la membrane cellulaire). Utilisation centricons de coupure appropriée pour des protéines qui ne sont pas des sédiments (par exemple, les protéines membranaires solubilisées de détergent). </li><li> Pour des résultats optimaux utilisation: a) des préparations de protéines pure et active que possible; b) les rapports lipide / protéine ≤ 3 en poids de protéines dans des patches de la membrane cellulaire ou dans des liposomes reconstitués; c) les rapports détergent / protéine ≤ 1 de poids pour les protéines de détergent solubilisé. Éviter l&#39;utilisation de détergents ou de lipides dont les bandes de vibration se chevaucher avec celles de la protéine (par exemple, CHAPS). </li></ol&gt; 2. Préparation de totale atténuée expériences de réflexion sur la bactériorhodopsine <ol><li> Montez l&#39;accessoire ATR dans le compartiment du spectromètre FT-IR échantillon. Remarque: Nous utilisons un ATR ZnSe / diamant avec 5 réflexions actifs. Eviter les matériaux semi-conducteurs tels que le germanium ou le silicium comme élément de réflexion interne (IRE) de l&#39;accessoire ATR, alors que leurs propriétés optiques sont affectées par le laser visible excitant. </li><li> Mesurer une large gamme (env. 4,000-800 cm -1) spectre d&#39;énergie à 4 cm -1 résolution de la surface IRE propre par spectroscopie classique FT-IR balayage rapide. Utiliser ce spectre comme un spectre de référence pour calculer le spectre d&#39;absorption à un stade ultérieur. </li><li> Couvrez la surface IRE de l&#39;ATR avec 20 ul du tampon utilisé plus tard pour réhydrater l&#39;échantillon (par exemple, 4 M de NaCl et 100 mM NaPi à pH 7,4). Mesurer l&#39;absorption infrarouge de la mémoire tampon. </li><li> Retirez le tampon et rincer la surface IRE wie l&#39;eau. Évitez de toucher la surface. Enlever le liquide résiduel de la surface IRE par un flux d&#39;air intense. </li><li> Étaler ~ 3 pi de bactériorhodopsine (BR) dans les membranes pourpres (~ protéine de 6 mg / ml dans de l&#39;eau déminéralisée) au-dessus de la surface IRE (~ 0,2 cm 2 de surface). Sécher la suspension de protéines sous un léger courant d&#39;air sec jusqu&#39;à ce que le film est atteint. </li><li> Mesurer le spectre de la pellicule sèche d&#39;absorption (voir figure 1). </li><li> Ajouter délicatement 20-40 ul d&#39;un tampon de force ionique élevée pour réhydrater le film sec (par exemple, 4 M de NaCl et 100 mM NaPi à pH 7,4). Remarque: La force ionique élevée empêche un gonflement excessif de la pellicule de membrane, ce qui permet de conserver autant de protéine que possible à proximité de la surface palpée (Figure 2). </li><li> Couvrir le support ATR muni d&#39;un couvercle pour empêcher l&#39;évaporation de l&#39;eau. Éventuellement, placer un couvercle-veste relié à un bain circulatoire fixé à 25 ° C pour le contrôle de la température. Pour les protéines avec de longues photocycles (&amp; #62; secondes), contrôle de la température pourrait augmenter la stabilité de base. </li><li> Mesurer un spectre d&#39;absorbance. Estimer le pourcentage de l&#39;échantillon restant à proximité de la surface après la réhydratation de la pellicule en soustrayant le spectre d&#39;absorption du tampon (Figure 3). </li><li> Confirmer la stabilisation du film de gonflement en enregistrant les spectres d&#39;absorption à des intervalles de 5 à 20 min après réhydratation (figure 4). Cette étape est facultative mais recommandée. </li></ol> 3. Réaliser des expériences de transmission sur Détergent solubilisé channelrhodopsin-2 <ol><li> Ajouter 10 ul de CHR2 (~ 10 mg de protéine / ml) dissous dans 5 mM de NaCl, 5 mM d&#39;HEPES (pH 7,4) et décyl-maltoside (DM) au centre d&#39;une fenêtre BaF 2 de 20 mm de diamètre. L&#39;étaler à l&#39;aide de la pointe de la micropipette à un diamètre de 8.6 mm (de densité de surface de la protéine de ~ 200 pg / cm 2). </li><li> Former une USI de filmng un léger flux d&#39;air sec. Pour obtenir les meilleurs résultats en sorte que le film est homogène et a un diamètre correspondant à peu près la taille du faisceau IR à la plus grande ouverture. </li><li> Hydrater le film en ajoutant 3-5 pl d&#39;un mélange de glycérol / eau distribuée dans 3-5 gouttes dans le film sec, et fermer hermétiquement avec une deuxième fenêtre à l&#39;aide d&#39;un joint torique en silicone plat de ≥ 1 mm d&#39;épaisseur. Note: Le rapport du mélange glycérol / eau contrôle le taux d&#39;humidité relative entre les fenêtres 54. Pour les échantillons hygroscopiques utilisent un rapport 3/7 ou 2/8 glycérol / eau (w / w). Les gouttes de glycérol / eau ne doit jamais être en contact direct avec le film de protéine. </li><li> Insérez les BaF 2 fenêtres en sandwich dans un support. Empêcher la lumière rectiligne d&#39;atteindre le détecteur, en recouvrant la fenêtre d&#39;échantillonnage d&#39;une matière opaque IR, tel que du papier, avec un trou correspondant à la taille de la pellicule hydratée. Placer le support dans le compartiment à échantillons. </li><li> Contrôler la température du support à 25 °C par une chemise thermostatique reliée à une température contrôlée de bain circulatoire. </li><li> Mesurer un spectre d&#39;absorption. Assurez-vous que le maximum d&#39;absorption dans la région amide I (~ 1,700-1,620 cm -1) est de l&#39;ordre de 0,6-1,0. </li><li> Estimer la masse et le rapport molaire de la protéine / détergent / eau à partir du spectre de la pellicule hydratée de l&#39;absorption (figure 5) en utilisant le coefficient d&#39;extinction des spectres de référence pour l&#39;eau, DM, et des protéines membranaires de représentation (figure 6). </li><li> Attendez que le niveau d&#39;hydratation se stabilise avant de réaliser des expériences pas-scan (≥ 1 h). </li></ol> 4. Réglage et synchronisation du laser d&#39;excitation Pour les expériences sur bR utilisent la seconde harmonique de l&#39;émission d&#39;un laser pulsé Nd: YAG (λ = 532 nm) pour déclencher le photocycle. Pour les expériences impliquant ChR2, utiliser une excitation λ = 450 nm fournie par un oposcillateur paramétrique tique (OPO) tirée par la troisième harmonique (λ = 355 nm) d&#39;un laser Nd: YAG. Assurez-vous que l&#39;impulsion laser est suffisamment court (~ 10 ns) pour minimiser secondaire photo-excitation. Remarque: L&#39;énergie des impulsions laser soit aussi constante que possible. Dans notre configuration, l&#39;intensité du laser fluctue ≤ 10% autour de la valeur moyenne, comme confirmé par la mesure d&#39;un réflexe du laser par une photodiode reliée à un enregistreur de transitoires et de l&#39;intégration de la réponse (Figure 8). <ol><li> Coupler le laser à l&#39;échantillon. Régler la densité d&#39;énergie du laser sur l&#39;échantillon à 2-3 mJ / cm 2 par impulsion à l&#39;aide d&#39;un wattmètre. <ol><li> Pour la configuration ATR, utiliser une fibre optique placée au sommet du couvercle ATR. </li><li> Pour les expériences de transmission, utiliser des miroirs pour amener le laser à l&#39;échantillon et, si nécessaire, des lentilles soit à collimater ou diverger le faisceau laser à un diamètre légèrement supérieur à la taille de l&#39;échantillon de film. </li></ol></li><li> Synchroniser le laser impulsion avec l&#39;enregistrement des données par le spectromètre. Utilisez la synchronisation à impulsion TTL Q-switch de l&#39;électronique du laser Nd: YAG pour déclencher le spectromètre. Fixer le taux de la Nd d&#39;excitation: YAG laser à 10 Hz pour le BR et 0,25 Hz pour ChR2, respectivement. </li><li> Utiliser un générateur de retard d&#39;impulsion (PDG) pour contrôler le taux d&#39;excitation laser si la fréquence de répétition du laser Nd: YAG n&#39;est pas facilement réglable. <ol><li> Connectez la lampe de synchronisation sur le laser Nd: YAG à l&#39;entrée de déclenchement externe PDG. Le PDG fournit une sortie ~ 190 ps impulsion TTL retardé à la Q-switch de synchronisation en entrée du laser Nd: YAG pour déclencher l&#39;effet laser. Porte le PDG d&#39;accepter un déclenchement externe seulement après un certain laps de temps depuis le dernier déclenchement acceptée (100 ms pour Br ou 4 secondes pour ChR2). </li></ol></li></ol> 5. Préparation et réglages Étape-scan en temps résolu <ol><li> Placer un filtre optique passe-bas dans le chemin optique. Pour effectuer l&#39;étape de balayage des mesures résolues en temps dans la 1,800-850 cm -1 gamme spectrale, utilisent un filtre opaque ci-dessus 1,950 cm -1 et avec une bonne transmission (&gt; 50-80%) en dessous de 1800 cm -1 (figure 7). </li><li> Changer le détecteur de CA en mode couplage DC. Remarque: Après le réglage du signal d&#39;interférogramme ne sera plus osciller autour de zéro, mais autour d&#39;une valeur connue sous le niveau DC. </li><li> Utiliser la plus grande ouverture possible du faisceau du spectromètre pour ultérieure flux de photons, et donc un meilleur rapport signal-sur-bruit, mais dans les limites de linéarité du détecteur. </li><li> Apportez le niveau DC de l&#39;interférogramme à zéro et réajuster le gain électronique à faire un meilleur usage de la plage dynamique du convertisseur analogique numérique converti (ADC). DC atteindre le niveau de décalage en appliquant une tension de polarisation au signal fourni par le pré-amplificateur. Remarque: Cette option est incluse dans les spectromètres FT-IR modernes. Sinon, un dispositif externe fait maison peut être utilisé à la place, placé entre le préamplificateur et l&#39;ADC 38. Soins est alorsnécessaire pour faire en sorte que l&#39;électronique du dispositif sont telles rapide et linéaire. </li><li> Lancer le menu étape de balayage du spectromètre FT-IR. Régler la largeur de bande spectrale cible pour la mesure à l&#39;étape de balayage 1,975.3-0 cm -1. Ajuster la largeur de bande spectrale à une fraction du nombre d&#39;onde de laser He-Ne (1/8 ème dans le cas présent), légèrement supérieure à la fréquence de coupure du filtre optique. </li><li> Désactiver un filtre électronique passe-haut pour éviter les distorsions de la cinétique à un moment ultérieur. Un filtre électronique passe-bas peut être bénéfique lorsque sa fréquence de coupure est de l&#39;ordre ou au-dessus du taux de l&#39;ADC (réduit le bruit aliasing) d&#39;échantillonnage. </li><li> Régler la résolution spectrale et de phase à 8 cm -1 et 64 cm -1, respectivement. Réglez le mode d&#39;acquisition de l&#39;interférogramme à un seul côté de l&#39;avant. Avec ces options, un interférogramme nécessite environ 500 points. </li><li> Régler la vitesse de l&#39;ADC d&#39;échantillonnage à la plus élevée disponible dans le spectromètre (par exemple, 160 kHz, ou 6,25 ps). Définir le «déclencheur pour l&#39;expérience&quot; sur &quot;externe&quot;, c&#39;est à dire, le laser est le maître. Définissez le nombre de points de données linéairement espacées pour être enregistrées: 7000 BR (jusqu&#39;à 42 ms) et 20 000 pour ChR2 (jusqu&#39;à 125 ms). Remarque: plus longues échelles de temps peuvent être couverts sans débordement de la mémoire de l&#39;ADC à l&#39;aide d&#39;un quasi-logarithmique impulsions TTL externes espacés dans le temps à partir d&#39;un générateur d&#39;onde pour déclencher l&#39;acquisition de données 38, ou à l&#39;aide de deux enregistreurs de transitoires parallèles comme substituts de l&#39;ADC interne 31, 32. </li><li> Enregistrer environ 100 points de pré-déclenchement comme une référence pour l&#39;état sombre de l&#39;échantillon. Remarque: Dans l&#39;échelle de temps de la milliseconde la qualité des données est souvent limitée par les fluctuations dans le miroir mobile. L&#39;augmentation des points de pré-déclenchement au-dessus de 100 est, par conséquent, ne devrait pas s&#39;améliorer de façon significative la qualité des données. </li><li> Définissez le nombre de co-ajouts, à savoir, le nombre de moyennes de la réaction photochimique par miroir position. Pour BR, utiliser 20 co-additions (20 min de mesurer le temps à 10 taux d&#39;excitation Hz). Pour ChR2 utiliser deux co-additions (70 min de mesurer le temps à 0,25 le taux d&#39;excitation Hz) </li><li> Répétez l&#39;expérience 10x pour BR, et 35x sur trois films différents échantillons pour ChR2, d&#39;avoir enfin ~ 200 co-additions par la position du miroir. </li></ol> 6. Traitement des données <ol><li> Confirmer l&#39;état de l&#39;échantillon en comparant le spectre IR de la différence induite par la lumière obtenue à partir de la première et de la dernière mesure. Considérons en supprimant toutes les mesures où l&#39;intensité du spectre de différence tombe en dessous de 60% de la première mesure. </li><li> Moyenne des interférogrammes enregistrés. <ol><li> Utilisation du logiciel OPUS du spectromètre FTIR sélectionner les interférogrammes résolues en temps à la moyenne et les ajouter à la &quot;Spectrum Calculator&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;=&quot; pour obtenir la moyenne des interférogrammes. Remarque: Lors de la phase de l&#39;interférogrammeest constante au cours de la mesure, il est indifférent à interférogrammes moyenne ou spectres mono-canal. Une phase constante peut être confirmée par le calcul et la comparaison du spectre de phase pour le premier et le dernier interférogramme enregistré. </li></ol></li><li> Effectuer la transformée de Fourier des interférogrammes résolues en temps moyennées pour obtenir la moyenne des spectres de seul canal en temps résolu. <ol><li> En utilisant le même logiciel que dans l&#39;étape 6.2.1, sélectionnez l&#39;interférogramme résolue dans le temps moyenne et cliquez sur l&#39;icône &quot;interférogramme à des spectres&quot;. Utilisez la méthode Mertz correction de phase, un facteur zéro remplissage de 2 (deux points numériques par la résolution instrumentale), et une fonction d&#39;apodisation (par exemple, triangle, Blackman-Harris 3-plan, etc.) </li><li> Cliquez sur le fond &quot;convertir&quot; à transformer l&#39;interférogramme en temps résolu en spectres en temps résolu. </li></ol></li><li> Exporter les données de canal unique résolues en temps comme un &quot;tableau de points de données&quot; ou un &quot;; &quot;Fichier en utilisant le&quot; matlab enregistrer sous &quot;icône dans le logiciel OPUS. Poursuivre le traitement de données dans un programme externe. <ol><li> Moyenne des spectres de canal unique avant le laser, et de convertir les données d&#39;un seul canal résolue en temps de la différence de spectres d&#39;absorption résolue en temps. </li><li> Calculer un vecteur pour l&#39;écart type du bruit prévu dans les spectres de différence en fonction du nombre d&#39;onde (figure 12), en utilisant l&#39;écart type de bruit, ε, et signifie, S 0 (ν), des spectres de seul canal 100 qui précède le laser: ε / S 0 (ν). La valeur de ε est estimée en soustrayant les spectres consécutive à un seul canal et le calcul de la déviation standard corrigée par √ 2. </li><li> Retirer les régions spectrales trop bruyants pour être d&#39;utilisation (par exemple, au-dessus 1825 cm-1 et en dessous de 850 cm -1). </li><li> Effectuez une moyenne quasi-logarithmique (par exemple, 20 spectres / heure décennie). Le appearanCE des données permettra d&#39;améliorer et le nombre de spectres sera réduit de 10 ~ 4 à ~ 10 2 sans aucune information significative perdu (figure 9). </li><li> Augmenter quatre fois la densité spectrale de points (1 point / cm -1) en utilisant l&#39;interpolation de Fourier (poster zéro de remplissage). Note: Nous effectuons les étapes 6.4.1 à 6.4.4 dans un programme fait maison en cours d&#39;exécution dans MATLAB. </li></ol></li><li> Traiter les spectres en temps résolu obtenu (Figure 10A) avec décomposition de valeur singulière, SVD, (figure 13). Réaliser un débruitage de données par la reconstruction des données avec un nombre limité de composants de SVD significatifs (Figure 10B). Note: Nous effectuons SVD dans MATLAB, en utilisant la fonction intégrée &quot;svd&quot;. </li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrent.

L&#39;un des premiers aspects qui doivent considération lors de l&#39;exécution l&#39;étape de balayage des expériences FT-IR à résolution temporelle sur une protéine est la préparation d&#39;un échantillon sous une forme appropriée pour la spectroscopie IR. L&#39;absorption IR à partir de substances autres que la protéine d&#39;intérêt doit être réduite, en particulier celle de l&#39;eau. L&#39;approche la plus courante consiste à évaporer l&#39;eau de la masse de l&#39;échantillon pour former un film. Le film peut être réhydraté soit en ajoutant quelques gouttes d&#39;une solution aqueuse ou par exposition du film à une atmosphère d&#39;humidité contrôlées. Nous avons montré que, dans les deux cas, il est possible d&#39;estimer le niveau d&#39;hydratation obtenu au moyen de la spectroscopie d&#39;absorption infrarouge (voir figure 3 et figure 5). Bien que les niveaux d&#39;hydratation obtenus peuvent apparaître faibles par rapport à ceux de solution, ils sont en fait proches de ceux trouvés dans les cellules vivantes 70, ce qui rend l&#39;étude de films hydratés de protéines fonctionnellement pertinents. Outre l&#39;eau, ilest également important de connaître et de contrôler la quantité de lipide ou de détergent dans l&#39;échantillon. Les deux doivent être conservés assez faible pour avoir un impact spectroscopique réduite à l&#39;absorption IR, mais suffisamment élevé pour préserver l&#39;intégrité et la fonctionnalité de la protéine d&#39;intérêt. Spectroscopie étape-scan en temps résolu n&#39;est carrément applicable aux protéines qui présentent des réactions réversibles qui peuvent être déclenchés de manière reproductible par la lumière (mais voir des progrès dans le couplage étape-scan avec échange de tampon rapide) 71. Dans l&#39;étape-scan de la réaction doit être reproductible au moins ~ 500x, le nombre minimum d&#39;achever un interférogramme couvrant la 1,800-850 cm -1 à 8 cm -1 résolution. En pratique, cependant, plus de la moyenne des données est généralement nécessaire de pousser le niveau de bruit. Pour 200 positions de co-additions/mirror (10 5 répétitions de la réaction) d&#39;un spectre de 6,25 ps résolution de différence d&#39;absorbance peut afficher une station de bruitndard écart entre 2 x 10 -5 et 2 x 10 -4 pour un ATR et entre 5 x 10 -6 et 3 x 10 ~ 5 pour une expérience de transmission (figure 15). Merci à son supérieur photon débit, la transmission permet de ~ 7 niveaux de bruit inférieurs à ceux des ATR, un aspect essentiel pour étudier avec succès des échantillons donnant des changements d&#39;absorption faibles comme ChR2. D&#39;autre part, ATR nécessite 5 à 25 fois moins que l&#39;échantillon d&#39;une expérience de transmission. L&#39;application de la spectroscopie FT-IR étape-scan en temps résolu est problématique pour des protéines présentant photocycles lents: l&#39;enregistrement d&#39;un interférogramme par étape-scan peut devenir impraticable longtemps. Certaines solutions ont été présentées pour traiter de tels cas 72,73, souvent basées sur l&#39;utilisation de plusieurs échantillons échangeables à accélérer les mesures au coût de l&#39;augmentation de la consommation de protéines et de la complexité expérimentale 27,74. Dans certains cas, il est possible de contourner ce problème par excitant l&#39;échantillon avant la photocycle est strictement terminée. Pour ChR2, avec un photocycle exigeant après photo-excitation 60 s pour 99% de récupération, la récupération à 4 sec est déjà de 80% 48. Avec un rendement de 10% de l&#39;excitation par impulsion laser, 98% des molécules sont CHR2 dans l&#39;obscurité état 4 secondes après la photo-excitation, ce qui rend possible de réaliser des expériences à une fréquence de répétition du laser de 0,25 Hz. Le traitement des données est un aspect technique final nécessaire pour atteindre les meilleurs résultats possibles. Moyenne logarithmique réduit le bruit et, également important, réduit la taille des données sans distorsions, un indispensable de la fonction d&#39;analyse des données postérieures en utilisant une décomposition en valeurs singulières ou montage global. Calcul de la moyenne logarithmique est, cependant, pas un grand succès dans la moyenne des fluctuations dans les traces temporelles provoquées par les oscillations dans le miroir mobile et d&#39;autres sources de bruit 1 / f pendant les mesures (Figure 9). Ces fluctuations de la ligne de basepeut dépasser le bruit dans l&#39;ordre de la milliseconde et de la qualité de corrompre les données. Décomposition en valeurs singulières met à profit la redondance des données en vue de réduire le bruit, et avec quelques modifications 57 il peut ainsi réduire les fluctuations de la ligne de base. Enfin, la partie la plus difficile et la plus de temps d&#39;une étape de balayage expérience FT-IR résolue dans le temps correspond à l&#39;affectation de bandes et à l&#39;interprétation spectrale et cinétique des données. Pour bactériorhodopsine beaucoup de groupes qui apparaissent dans la différence des spectres IR ont été affectés ou interprétées grâce au travail accumulé de nombreux groupes de chercheurs depuis des décennies. Pour une protéine beaucoup moins étudiés, comme channelrhodopsin-2, les expériences IR ci-dessus présentés résolues en temps besoin d&#39;être accompagnés par des expériences parallèles sur des mutants dirigée sur le site et combinées avec des informations à partir de techniques complémentaires pour atteindre une interprétation mécaniste 48.

Pour élucider pleinement comment les protéines exercent leur fonction, il est nécessaire de les mesurer comme ils travaillent, c&#39;est à dire le long d&#39;un chemin de réaction qui implique souvent une série d&#39;intermédiaires et s&#39;étend de plusieurs ordres de temps. Les étapes clés de la fonction des protéines ont souvent lieu dans la microseconde à la milliseconde intervalle de temps 1, en ​​particulier squelette changements conformationnels et les réactions de transferts de protons dans les protéines membranaires. Cristallographie aux rayons X, sans doute le pilier de la biologie structurale, fournit des densités électroniques statiques (moyenne temporelle) de bien-diffraction des cristaux de protéines, notoirement difficiles à cultiver avec des protéines de la membrane 2. Un modèle 3D atomique peut être construite sur la base des densités d&#39;électrons, bien que rarement y compris la localisation des atomes d&#39;hydrogène. Des progrès remarquables en temps résolu cristallographie aux rayons X, en s&#39;appuyant soit sur ​​Laue diffraction 3 ou femtoseconde impulsions de rayons X 4, ajoute la dimension temporelle de l&#39;information structurelle élevée àinhérents à la cristallographie aux rayons X 5. Mais la mise de côté des défis techniques et analytiques, le réseau cristallin peut nuire squelette changements de conformation et de modifier la dynamique des protéines, une lacune inévitable des méthodes basées sur des cristaux de protéines 5. Par conséquent, les aspects dynamiques de protéines sont encore mieux couverts par des méthodes optiques, comme lancée par photolyse éclair 6,7, mais avec l&#39;inconvénient général de perspicacité structurel limité. La spectroscopie infrarouge transformée de Fourier (FT-IR) combine la résolution temporelle des spectroscopies optiques avec une sensibilité utile de la structure des protéines, la dernière caractéristique exploité dans les enquêtes structurelles et fonctionnelles statiques innombrables sur les protéines de membrane 11.8. En particulier, la spectroscopie de différence FT-IR s&#39;est avéré être un outil idéal pour étudier de minuscules changements spectraux comme une protéine transits d&#39;un état ​​métastable à un autre 12-19. Studies sur la dynamique des protéines autres que au niveau de la molécule unique 20,21, nécessitent un processus de déclenchement pour la synchronisation. Une réaction est initiée rapide et non invasive utilisant la lumière comme déclencheur, comme cela se fait dans l&#39;étude des protéines avec photoréactions cycliques. Un défi majeur associé à des études résolues en temps est la réalisation de la résolution de suffisamment de temps, tout en maintenant une bonne résolution spectrale et rapport approprié signal-sur-bruit. Il est également essentiel de couvrir un éventail suffisamment large spectrale et temporelle. Spectroscopie FT-IR en temps résolu étape balayage excelle dans tous ces aspects 22, avec des exemples publiés couvrant des domaines spectraux aussi large que 3,900-850 cm -1 et dynamique s&#39;étendant ~ 9 ordres de temps, avec un maximum de 3,5 cm -1 spectrale et 30 résolution temporelle ns 23-28. Spectromètres à transformée de Fourier IR montrent un bruit réduit et une meilleure précision photométrique sur les dispersants 29. Cepener, dans le mode d&#39;enregistrement rapide balayage normal spectromètres FT-IR souffrent d&#39;un temps de résolution limité à ≥ 5 à 10 ms à la suite de la durée minimum du miroir mobile de l&#39;interféromètre nécessite pour terminer un balayage. Avec la technique de l&#39;étape de balayage, par contre, la dépendance du temps de l&#39;événement dynamique est découplée de la durée de balayage de l&#39;interféromètre. En bref, les mobile se déplace de miroir en étapes discrètes plutôt que de rechercher en permanence pour compléter un balayage. A chacune de ces étapes, le (mobile) miroir est maintenu fixe et un transitoire est enregistrée. Ainsi, le temps de résolution est limitée par le temps de montée du mercure-cadmium-tellurure (MCT) détecteur, qui est typiquement dans la gamme de 10 à 100 ns. Dans la pratique, la grande dynamique de l&#39;interférogramme (contenant un signal intense dans les signaux centerburst et petits dans les ailes), nécessite pour une numérisation correcte convertisseur analogique / numérique (ADC) avec pas moins de 16 à 24 bits qui conduit à un échantillonnage taux pas plus élevés que ~ 200 kHz(5 microsecondes) 30. Nanoseconde résolution peut être effectuée en mesurant seulement les variations de l&#39;interférogramme, pour lequel un bit ADC 12.8 est suffisante 23,31-33. Les aspects techniques 30,34,35 et applications 36-38 de temps résolu étape de balayage ont été examinées en détail par ailleurs. Le but de la contribution actuelle est de fournir un protocole décrivant les modalités pratiques de l&#39;étape de balayage spectroscopie résolue dans le temps FT-IR sur les protéines membranaires photosensibles. Ici, la performance de la technique est indiquée pour deux méthodes d&#39;échantillonnage: transmission et de réflexion totale atténuée (ATR). L&#39;utilisation de l&#39;ATR permet de travailler en présence d&#39;un excès d&#39;eau, ce qui assure non seulement des conditions d&#39;hydratation complète pour la protéine, mais également permet le contrôle de l&#39;échantillon aigu pH et la force ionique 49,50. Expériences étape de numérisation sont illustrés sur deux systèmes sélectionnés: bactériorhodopsine et channelrhodopsin-2. 39,40, ce qui rend la protéine de membrane mieux compris jusqu&#39;à présent. Parmi les nombreuses techniques appliquées à l&#39;étude de la spectroscopie FT-IR fonctionnalité BR a sans doute exercé une des plus grandes répercussions. À savoir, la spectroscopie FT-IR a été la clé pour résoudre les groupes impliqués dans le transfert de protons à travers la membrane comme représenté ailleurs 13,41,51. Channelrhodopsin (CHR) est la première chaîne d&#39;ions lumière fermée trouvés dans la nature 42,43. Une lumière d&#39;excitation de ChR conduit à l&#39;ouverture transitoire d&#39;un canal ionique. Sa découverte a réglé la voie au développement de optogenetics, où les processus moléculaires sont contrôlées par la lumière 44,45. ChR appartient, en tant que BR, à la famille de rhodopsines microbiens mais contrairement à BR, beaucoup on connaît moins son mécanisme fonctionnel 52. ChR2 combine sa fonction de ion canal à activité protonique 46,47 pompage. Récemment, nous avons appliqué la spectroscopie FT-IR étape-scan en temps résolu à résoudre intra-protéine réactions de transfert de protons et de la dynamique des protéines squelette conformation changements dans ChR2 48.

<table><tbody><tr><td>Spectromètre FT-IR</td><td>Bruker</td><td>Vertex 80v</td><td>Équipé d’un détecteur photovoltaïque-MCT, d’un global externe et d’une pompe sans huile. Firmware 2.3.</td></tr><tr><td>Fenêtres BaF2</td><td>Korth Kristalle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond ATR Détection</td><td></td><td>des forgerons</td><td>DuraDisk à neuf réflexions</td></tr><tr><td>Bain thermostatique</td><td>Julabo</td><td>F25</td><td></td></tr><tr><td>Table découplée aux vibrations</td><td>OPTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd :YAG pulsé avec un second générateur d’harmoniques</td><td>Électro-optique</td><td>Continuum Minilite&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Oscillateur paramétrique optique (OPO)</td><td>OPTA</td><td>BBO-355-VIS/IR S/N 1009</td><td></td></tr><tr><td>Générateur numérique de retard/impulsions&nbsp ;</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG535</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd :YAG pulsé avec un générateur de troisième harmonique</td><td>Spectra-Physics</td><td>Quanta-Ray</td><td></td></tr><tr><td>Divers miroirs optiques et lentilles</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPUS 7.0</td><td>Bruker</td><td></td><td>Logiciel pour contrôler le spectromètre Vertex 80v</td></tr><tr><td>MATLAB Runtime</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Utilisé pour exécuter des programmes exécutables faits maison pour Prétraiter les données</td></tr></tbody></table>

proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de fourier spectroscopie infrarouge

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Suivi de la dynamique de protonation et de protéines squelette changements de conformation au cours de la fonction d&#39;une protéine est une étape essentielle vers la compréhension de son mécanisme. Protonation et de conformation modifications affectent le modèle de vibration de chaînes latérales d&#39;acides aminés et de la liaison peptidique, respectivement, qui tous deux peuvent être sondé par infrarouge (IR) de la différence. Pour les protéines dont la fonction peut être répétitive et reproductible déclenché par la lumière, il est possible d&#39;obtenir des spectres de différence avec infrarouge (sous) la résolution d&#39;une microseconde sur une large plage spectrale en utilisant la technique infrarouge étape de numérisation de transformation de Fourier. Avec ~ 10 2 -10 3 répétitions de la photo-réaction, le nombre minimal de terminer un balayage à haute résolution spectrale raisonnable et la largeur de bande, le niveau de bruit dans les spectres de différence d&#39;absorption peut être aussi faible que ~ 10-4, suffisante pour suivre la cinétique d&#39; protonation des modifications d&#39;un seul acide aminé. Inférieurdes niveaux de bruit peuvent être accomplies par calcul de la moyenne de plus de données et / ou un traitement mathématique. La quantité de protéine nécessaire pour un résultat optimal se situe entre 5 à 100 ug, en fonction de la technique d&#39;échantillonnage utilisée. En ce qui concerne des exigences supplémentaires, la protéine doit être d&#39;abord concentré dans un tampon de faible force ionique, puis séché pour former un film. Le film de protéine est hydratée avant l&#39;expérience, soit avec de petites gouttelettes d&#39;eau ou sous une humidité atmosphérique contrôlée. Le niveau d&#39;hydratation atteint (g d&#39;eau / g de protéine) est évaluée à partir d&#39;un spectre d&#39;absorption IR. Pour mettre en valeur la technique, nous avons étudié la photocycle de la bactériorhodopsine la pompe à protons lumière entraîné dans son environnement natif de membrane pourpre, et du canal ionique channelrhodopsin-2-lumière fermée solubilisé dans un détergent.

Les étapes clés de la fonction des protéines, en particulier les changements de conformation du squelette et les réactions de transfert de protons, se déroulent souvent à l’échelle de la microseconde à la milliseconde. Ces processus dynamiques peuvent être étudiés par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à balayage pas à pas résolue en temps, en particulier pour les protéines dont la fonction est déclenchée par la lumière.

Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la dynamique de la protonation et des changements conformationnels de deux protéines membranaires photosensibles à l'aide de la spectroscopie FTIR en balayage STEP résolue en temps. Cela est réalisé en formant d'abord un film protéique hydraté dont l'absorption infrarouge sera sondée soit en configuration de réflexion totale atténuée pour la bactériorhodopsine, soit en configuration de transmission pour le canal Rhodopsine 2. La deuxième étape consiste à exciter l'échantillon à l'aide d'un flash laser nanoseconde d'une longueur d'onde appropriée afin d'initier une réaction photocyclique dans la protéine, permettant ainsi de détecter les changements résolus en temps de l'intensité de la lumière infrarouge interagissant avec l'échantillon.Ensuite, le processus ci-dessus est répété à des positions discrètes du miroir mobile d'un interféromètre qui contrôle la différence de chemin optique entre deux faisceaux divisés, jusqu'à ce qu'un interférogramme complet résolu en temps soit enregistré. La dernière étape consiste à transformer l'interférogramme résolu en temps en un spectre d'absorption infrarouge différentiel résolu en temps à l'aide de la transformée de Fourier et de la loi de Lambert-Beer. Enfin, l'évolution temporelle des bandes, en particulier dans la région du groupe MI et dans celle de la double liaison CO des groupes carboxyliques, est analysée afin d'obtenir les dynamiques des changements conformationnels et de protonation dans la protéine.Le principal avantage de la technique par rapport à la plupart des méthodes expérimentales existantes est qu'elle permet de résoudre les changements transitoires de protonation dans les protéines. De plus, elle le fait à l'échelle de temps micro- et milliseconde, qui correspond à la plage temporelle la plus pertinente pour étudier la fonctionnalité des protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biophysique moléculaire et de la science des protéines, telles que les résidus qui se protonent et le moment où ils le font au cours du mécanisme fonctionnel d'une protéine, ou encore quand se produisent les changements majeurs dans les protéines.La démonstration de la procédure sera effectuée par Victor Ria, chercheur associé de mon laboratoire. Tout d'abord, fixez l'accessoire à réflexion totale atténuée, ou ATR, dans le compartiment échantillon du spectromètre FTIR. Enregistrez un spectre d'énergie large à une résolution de quatre centimètres inverses sur la surface propre de l'élément de réflexion interne par spectroscopie FTIR à balayage rapide conventionnelle. Recouvrez la surface de l'ATR de 20 microlitres de tampon à force ionique élevée utilisé ultérieurement pour réhydrater l'échantillon.Ensuite, mesurez l'absorption infrarouge du tampon. Puis, retirez le tampon et rincez la surface avec de l'eau sans la toucher. Éliminez le liquide résiduel à l'aide d'un flux d'air intense. Déposez environ trois microlitres d'une solution protéique à six milligrammes par millilitre de bactéries Rodin dans une membrane violette sur la surface.Séchez la suspension protéique sous un flux doux d'air sec jusqu'à l'obtention d'un film. Ensuite, mesurez le spectre d'absorption du film sec. Ajoutez ensuite délicatement 20 à 40 microlitres de tampon à forte force ionique pour réhydrater le film sec.Couvrez le support A TR avec un couvercle afin d'éviter l'évaporation de l'eau et de mesurer le spectre d'absorption. Estimez le pourcentage d'échantillon restant à proximité de la surface après la réhydratation du film en soustrayant le spectre d'absorption du tampon. À ce stade, ajoutez 10 microlitres de channelrhodopsine-2 dissoute dans du dodecylphosphocholine dans un tampon de faible force ionique au centre d'une fenêtre en fluorure de baryum de 20 millimètres de diamètre.Étendre la solution à l’aide de la pointe de micropipette sur un diamètre de six à huit millimètres à l’aide d’un flux doux d’air sec, afin d’obtenir un film homogène chaud dont le diamètre correspond approximativement à la taille du faisceau infrarouge à l’ouverture maximale. Ensuite, utiliser une bague O en silicone plate d’un millimètre d’épaisseur. Hydrater le film en ajoutant trois à cinq microlitres d’un mélange de glycérol et d’eau répartis en trois à cinq gouttes autour du film sec, puis le fermer hermétiquement avec une deuxième fenêtre.Insérez les fenêtres en fluorure de baryum emprisonnées dans un support. Placez ensuite le support dans le compartiment d'échantillon. Mesurez un spectre d'absorption.Confirmez que l'absorption maximale dans la région de l'amide un se situe entre 0,6 et 1,0 pour le dispositif A TR. Utilisez une fibre optique placée sur le couvercle du dispositif A TR pour coupler le laser à l'échantillon. Ajustez la densité d'énergie du laser au niveau de l'échantillon à deux à trois millijoules par centimètre carré par impulsion.À l’aide d’un wattmètre ou d’expériences de transmission, utilisez des miroirs pour diriger le laser vers l’échantillon et, si nécessaire, des lentilles pour collimater ou dévier le faisceau laser afin d’obtenir un diamètre légèrement supérieur à la taille du film d’échantillon. Synchronisez l’impulsion laser avec l’enregistrement des données en utilisant le commutateur Q. Utilisez l’impulsion TTL de sortie de synchronisation provenant de l’électronique du laser au néodyme dopé à l’yttrium aluminium grenat pour déclencher le convertisseur analogique-numérique du spectromètre.Régler la fréquence d'excitation du laser pour effectuer des mesures par balayage temporel résolu dans la gamme spectrale de 1800 à 850 centimètres inverses. Placer un filtre optique passe-bas dans le trajet optique, opaque au-dessus de 1 950 centimètres inverses et présentant une bonne transmission en dessous de 1800 centimètres inverses.Ensuite, passez le détecteur du mode couplé en alternatif (AC) au mode couplé en continu (DC). À ce stade, ramenez le niveau de courant continu (DC) de l'INTERFÉROGRAMME à zéro en appliquant une polarisation en courant au détecteur. Réajustez le gain électronique afin d'exploiter au mieux la plage dynamique du convertisseur analogique-numérique.Ensuite, lancez le menu de balayage par paliers du spectromètre FTIR. Réglez la largeur spectrale cible pour la mesure par paliers à un huitième du nombre d'onde du laser hélium-néon. Réglez la résolution spectrale et la résolution de phase respectivement à huit centimètres inverses et 64 centimètres inverses.Sélectionnez une fonction appe. Ensuite, réglez le mode d'acquisition de l'INTERFÉROGRAMME sur simple côté avant. Réglez la fréquence d'échantillonnage du convertisseur analogique-numérique sur la valeur la plus élevée disponible dans le spectromètre.Réglez le déclenchement de l'expérience sur externe. Ensuite, définissez le nombre de points de données espacés linéairement à enregistrer, incluant 100 points avant le déclenchement. Puis, réglez le nombre de répétitions ou le nombre de moyennes de la réaction photochimique par position du miroir, et démarrez l'expérience.Enfin, répétez l'expérience 10 fois pour les bactéries, redsin, et 35 fois sur trois films d'échantillon différents pour le canal redsin deux afin d'obtenir environ 200 co-ajouts par position du miroir. Les bandes caractéristiques provenant des vibrations de la liaison peptidique amite sont discernables dans le spectre d'absorption en couche sèche de redsin bactérien. Lorsque l'on utilise des tampons de faible force ionique, le film se dilate excessivement, réduisant ainsi la quantité de protéine sondée par le champ évanescent. La dépendance exacte entre le gonflement du film et la force ionique du tampon dépendra, entre autres facteurs, de la nature des lipides.Le gonflement du film après l'hydratation nécessite du temps pour atteindre une stabilisation chez les bactéries de dosin. Dans la membrane pourpre, le processus est mono-exponentiel avec une constante de temps de 12 minutes. Une représentation tridimensionnelle d'un balayage typique résolu en fonction du temps, expérience FDIR sur des bactéries.La redsine est présentée ici. Des spectres peuvent être extraits à des moments précis. Par exemple, lorsque l'on s'attend à ce que les états intermédiaires du cycle photochimique de la redsine chez les bactéries atteignent leur population maximale.Dans le cycle photochimique de la bactérie en forme de bâtonnet Dossin, les courbes cinétiques des variations d'absorbance à 1 762 centimètres inverses rendent compte des dynamiques de protonation-déprotonation de l'aspartate 85, et à 1 741 centimètres inverses, des modifications des liaisons hydrogène ainsi que des dynamiques de déprotonation-reprotonation de l'acide aspartique 96. Les courbes cinétiques à 1 670 et 1 555 centimètres inverses.Signaler les modifications des vibrations des modes MI et MII, qui sont tous deux sensibles à la conformation du squelette peptidique. Après le développement de cette méthode, d'autres techniques telles que la neurogenèse dirigée ou la spectroscopie enzymatique rétinienne peuvent être réalisées afin d'attribuer les bandes vibrationnelles à des résidus spécifiques de la protéine. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biophysique moléculaire pour explorer le mécanisme fonctionnel de nombreuses protéines différentes activées par la lumière.

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Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge (Vidéo) | JoVE Journal

Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge

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