Proton transfert et la conformation des protéines photosensibles dans la dynamique des protéines par résolution temporelle étape-scan à transformée de Fourier spectroscopie infrarouge

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la dynamique de la protonation et des changements conformationnels de deux protéines membranaires photosensibles à l'aide de la spectroscopie FTIR en balayage STEP résolue en temps. Cela est réalisé en formant d'abord un film protéique hydraté dont l'absorption infrarouge sera sondée soit en configuration de réflexion totale atténuée pour la bactériorhodopsine, soit en configuration de transmission pour le canal Rhodopsine 2. La deuxième étape consiste à exciter l'échantillon à l'aide d'un flash laser nanoseconde d'une longueur d'onde appropriée afin d'initier une réaction photocyclique dans la protéine, permettant ainsi de détecter les changements résolus en temps de l'intensité de la lumière infrarouge interagissant avec l'échantillon.

Ensuite, le processus ci-dessus est répété à des positions discrètes du miroir mobile d'un interféromètre qui contrôle la différence de chemin optique entre deux faisceaux divisés, jusqu'à ce qu'un interférogramme complet résolu en temps soit enregistré. La dernière étape consiste à transformer l'interférogramme résolu en temps en un spectre d'absorption infrarouge différentiel résolu en temps à l'aide de la transformée de Fourier et de la loi de Lambert-Beer. Enfin, l'évolution temporelle des bandes, en particulier dans la région du groupe MI et dans celle de la double liaison CO des groupes carboxyliques, est analysée afin d'obtenir les dynamiques des changements conformationnels et de protonation dans la protéine.

Le principal avantage de la technique par rapport à la plupart des méthodes expérimentales existantes est qu'elle permet de résoudre les changements transitoires de protonation dans les protéines. De plus, elle le fait à l'échelle de temps micro- et milliseconde, qui correspond à la plage temporelle la plus pertinente pour étudier la fonctionnalité des protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biophysique moléculaire et de la science des protéines, telles que les résidus qui se protonent et le moment où ils le font au cours du mécanisme fonctionnel d'une protéine, ou encore quand se produisent les changements majeurs dans les protéines.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Victor Ria, chercheur associé de mon laboratoire. Tout d'abord, fixez l'accessoire à réflexion totale atténuée, ou ATR, dans le compartiment échantillon du spectromètre FTIR. Enregistrez un spectre d'énergie large à une résolution de quatre centimètres inverses sur la surface propre de l'élément de réflexion interne par spectroscopie FTIR à balayage rapide conventionnelle. Recouvrez la surface de l'ATR de 20 microlitres de tampon à force ionique élevée utilisé ultérieurement pour réhydrater l'échantillon.

Ensuite, mesurez l'absorption infrarouge du tampon. Puis, retirez le tampon et rincez la surface avec de l'eau sans la toucher. Éliminez le liquide résiduel à l'aide d'un flux d'air intense. Déposez environ trois microlitres d'une solution protéique à six milligrammes par millilitre de bactéries Rodin dans une membrane violette sur la surface.

Séchez la suspension protéique sous un flux doux d'air sec jusqu'à l'obtention d'un film. Ensuite, mesurez le spectre d'absorption du film sec. Ajoutez ensuite délicatement 20 à 40 microlitres de tampon à forte force ionique pour réhydrater le film sec.

Couvrez le support A TR avec un couvercle afin d'éviter l'évaporation de l'eau et de mesurer le spectre d'absorption. Estimez le pourcentage d'échantillon restant à proximité de la surface après la réhydratation du film en soustrayant le spectre d'absorption du tampon. À ce stade, ajoutez 10 microlitres de channelrhodopsine-2 dissoute dans du dodecylphosphocholine dans un tampon de faible force ionique au centre d'une fenêtre en fluorure de baryum de 20 millimètres de diamètre.

Étendre la solution à l’aide de la pointe de micropipette sur un diamètre de six à huit millimètres à l’aide d’un flux doux d’air sec, afin d’obtenir un film homogène chaud dont le diamètre correspond approximativement à la taille du faisceau infrarouge à l’ouverture maximale. Ensuite, utiliser une bague O en silicone plate d’un millimètre d’épaisseur. Hydrater le film en ajoutant trois à cinq microlitres d’un mélange de glycérol et d’eau répartis en trois à cinq gouttes autour du film sec, puis le fermer hermétiquement avec une deuxième fenêtre.

Insérez les fenêtres en fluorure de baryum emprisonnées dans un support. Placez ensuite le support dans le compartiment d'échantillon. Mesurez un spectre d'absorption.

Confirmez que l'absorption maximale dans la région de l'amide un se situe entre 0,6 et 1,0 pour le dispositif A TR. Utilisez une fibre optique placée sur le couvercle du dispositif A TR pour coupler le laser à l'échantillon. Ajustez la densité d'énergie du laser au niveau de l'échantillon à deux à trois millijoules par centimètre carré par impulsion.

À l’aide d’un wattmètre ou d’expériences de transmission, utilisez des miroirs pour diriger le laser vers l’échantillon et, si nécessaire, des lentilles pour collimater ou dévier le faisceau laser afin d’obtenir un diamètre légèrement supérieur à la taille du film d’échantillon. Synchronisez l’impulsion laser avec l’enregistrement des données en utilisant le commutateur Q. Utilisez l’impulsion TTL de sortie de synchronisation provenant de l’électronique du laser au néodyme dopé à l’yttrium aluminium grenat pour déclencher le convertisseur analogique-numérique du spectromètre.

Régler la fréquence d'excitation du laser pour effectuer des mesures par balayage temporel résolu dans la gamme spectrale de 1800 à 850 centimètres inverses. Placer un filtre optique passe-bas dans le trajet optique, opaque au-dessus de 1 950 centimètres inverses et présentant une bonne transmission en dessous de 1800 centimètres inverses.

Ensuite, passez le détecteur du mode couplé en alternatif (AC) au mode couplé en continu (DC). À ce stade, ramenez le niveau de courant continu (DC) de l'INTERFÉROGRAMME à zéro en appliquant une polarisation en courant au détecteur. Réajustez le gain électronique afin d'exploiter au mieux la plage dynamique du convertisseur analogique-numérique.

Ensuite, lancez le menu de balayage par paliers du spectromètre FTIR. Réglez la largeur spectrale cible pour la mesure par paliers à un huitième du nombre d'onde du laser hélium-néon. Réglez la résolution spectrale et la résolution de phase respectivement à huit centimètres inverses et 64 centimètres inverses.

Sélectionnez une fonction appe. Ensuite, réglez le mode d'acquisition de l'INTERFÉROGRAMME sur simple côté avant. Réglez la fréquence d'échantillonnage du convertisseur analogique-numérique sur la valeur la plus élevée disponible dans le spectromètre.

Réglez le déclenchement de l'expérience sur externe. Ensuite, définissez le nombre de points de données espacés linéairement à enregistrer, incluant 100 points avant le déclenchement. Puis, réglez le nombre de répétitions ou le nombre de moyennes de la réaction photochimique par position du miroir, et démarrez l'expérience.

Enfin, répétez l'expérience 10 fois pour les bactéries, redsin, et 35 fois sur trois films d'échantillon différents pour le canal redsin deux afin d'obtenir environ 200 co-ajouts par position du miroir. Les bandes caractéristiques provenant des vibrations de la liaison peptidique amite sont discernables dans le spectre d'absorption en couche sèche de redsin bactérien. Lorsque l'on utilise des tampons de faible force ionique, le film se dilate excessivement, réduisant ainsi la quantité de protéine sondée par le champ évanescent. La dépendance exacte entre le gonflement du film et la force ionique du tampon dépendra, entre autres facteurs, de la nature des lipides.

Le gonflement du film après l'hydratation nécessite du temps pour atteindre une stabilisation chez les bactéries de dosin. Dans la membrane pourpre, le processus est mono-exponentiel avec une constante de temps de 12 minutes. Une représentation tridimensionnelle d'un balayage typique résolu en fonction du temps, expérience FDIR sur des bactéries.

La redsine est présentée ici. Des spectres peuvent être extraits à des moments précis. Par exemple, lorsque l'on s'attend à ce que les états intermédiaires du cycle photochimique de la redsine chez les bactéries atteignent leur population maximale.

Dans le cycle photochimique de la bactérie en forme de bâtonnet Dossin, les courbes cinétiques des variations d'absorbance à 1 762 centimètres inverses rendent compte des dynamiques de protonation-déprotonation de l'aspartate 85, et à 1 741 centimètres inverses, des modifications des liaisons hydrogène ainsi que des dynamiques de déprotonation-reprotonation de l'acide aspartique 96. Les courbes cinétiques à 1 670 et 1 555 centimètres inverses.

Signaler les modifications des vibrations des modes MI et MII, qui sont tous deux sensibles à la conformation du squelette peptidique. Après le développement de cette méthode, d'autres techniques telles que la neurogenèse dirigée ou la spectroscopie enzymatique rétinienne peuvent être réalisées afin d'attribuer les bandes vibrationnelles à des résidus spécifiques de la protéine. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biophysique moléculaire pour explorer le mécanisme fonctionnel de nombreuses protéines différentes activées par la lumière.