Name: Mesure automatisée du flux sanguin Microcirculatory vitesse dans métastases pulmonaire des rats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Découvrez la mesure automatisée du flux sanguin microcirculatoire dans les métastases pulmonaires chez le rat. Cette méthode par microscopie intravitale thoracique permet d'étudier la dynamique tumorale en temps réel.

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Les conseils scientifiques des Drs Timothy McMahon et Siqing Shan sont appréciés. Les présentateurs remercient les Drs David Kirsch et Patricia Steeg pour le généreux don du sarcome de souris marqué par fluorescence et des cellules métastatiques MDAMB-231, respectivement. Ce travail a été financé en partie par la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) des États-Unis, numéro de bourse N66001-10-C-2134, et en partie par le Département de radio-oncologie du Centre médical de l’Université Duke.

NOTE: Toutes les procédures liées aux animaux décrits dans le présent protocole ont été préalablement approuvé par le soin et l&#39;utilisation institutionnelle animaux Comité Duke University (DUIACUC). 1. Culture cellulaire et cancer Injection <ol><li> Cultiver des cellules cancéreuses métastatiques marquées par fluorescence (par exemple des cellules de cancer du sein MDAMB231-GFP humaines, don du Dr. Patricia Steeg, NCI, et les cellules de sarcome de la souris YFP-étiquetés, don du Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Département de radio-oncologie) dans un milieu de culture approprié (milieu de Eagle modifié par exemple par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline / streptavidine) à 37 ° C jusqu&#39;à environ 90% de confluence. </li><li> Trypsiniser cellules, les laver deux fois avec du PBS, compter, et ensuite les injecter dans les veines de la queue de 10 semaines vieux rats nus féminins de l&#39;isoflurane anesthésiés à 5 millions de cellules par animal, en utilisant une seringue avec une aiguille 27 G. Anesthes niveau chirurgicalesia est vérifiée par l&#39;absence de réaction de pincement de l&#39;orteil. </li></ol> 2. Suivi des métastases Utilisation microCT <ol><li> Examiner les rats une fois par semaine en utilisant un micro-CT / micro-irradiateur, pour détecter la présence de métastases au-dessus d&#39;environ 2 mm de diamètre de diamètre. Le micro-CT est commandé comme décrit précédemment 12. <ol><li> Rats soumis à 3% d&#39;isoflurane anesthésie préalable à l&#39;imagerie. Confirmez anesthésie profonde par pincement de l&#39;orteil. </li><li> Après le début de l&#39;anesthésie, transférer rapidement des rats au berceau de l&#39;imagerie dans la chambre de l&#39;imagerie et de se connecter via un nez cône à un mélange isoflurane-air à 2,5-3%. Ajuster la position du rat dans le berceau de façon que son thorax est positionné dans le faisceau de photons de la microCT scanner, en utilisant les commandes de position externes et délimiteur de laser sur le support de formation d&#39;image. Se assurer que la porte de la chambre d&#39;imagerie est fermé, pour protéger l&#39;enquêteur des rayons gamma. </li><li> Contrôler la position de l&#39;animal en utilisant à nouveaula caméra vidéo couleur. Effectuez une basse résolution test d&#39;imagerie CT terme, et d&#39;utiliser l&#39;image résultante pour régler le champ de vision aux dimensions xyz de la cavité thoracique. </li><li> Image du thorax de rat en utilisant un filtre 2 mm Al à 40 kV, 2,5 mA, et 0,008 voxel au 7 FPS et le réexpédier vers sa cage. Imagerie d&#39;un animal devrait prendre pas plus de 15 ou 20 min. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu&#39;il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. </li><li> Confirmez métastases par l&#39;apparition d&#39;objets relativement radio-opaque qui ne peut être expliqué par des vaisseaux sanguins intrathoraciques (figure 1A) </li></ol></li></ol> Chirurgie 3. Chambre Fenêtre <ol><li> Anesthésie, les signes vitaux et veine de la queue cathétérisme <ol><li> Sélectionnez animaux avec la présence de la maladie métastatique. Injecter animal avec un d intrapéritonéaleose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirmez niveau anesthésie chirurgicale par pincement de l&#39;orteil avant de procéder. Note: protocoles d&#39;anesthésie doivent être adaptées à la configuration expérimentale respective. Pentobarbital a été choisi ici comme un anesthésique à action prolongée, afin d&#39;induire anesthésie profonde pendant de longues procédures, tout en offrant la possibilité de re-dosage facile. Toutefois, la perte d&#39;animaux à un surdosage est un problème commun avec anesthésie au pentobarbital. Une autre option qui préserve réflexes autonomes à un degré plus grand que le pentobarbital est la kétamine en combinaison avec des sédatifs tels que la xylazine ou médétomidine, qui permet cependant uniquement pour un cycle de ré-dosage unique. </li><li> Raser les animaux sur le côté du corps qui a la maladie métastatique, et dans la région du cou en utilisant une tondeuse. Essuyer tout en restant cheveux dénoués de la peau. Après les cheveux dénoués est retirée, appliquer une pommade vétérinaire pour les yeux, pour les empêcher de se dessécher. REMARQUE: rats nus athymiques peuvent avoir les cheveux résiduel qui requiélimination res avant de procéder à des interventions chirurgicales. Il est très important d&#39;enlever tous les cheveux soigneusement, car il peut interférer avec les procédures chirurgicales et d&#39;imagerie. </li><li> Fixer l&#39;animal dans une position couchée sur une plaque métallique qui est placé sur un coussin chauffant l&#39;eau C 37 ° distribué. Les extrémités avant et arrière sont fixés sur la plaque avec du ruban adhésif. NOTE: Il est utile de contrôler et d&#39;enregistrer les signes vitaux, tels que la fréquence cardiaque et l&#39;oxygénation artérielle du sang en utilisant un oxymètre de pouls, tout au long des procédures chirurgicales et expérimentales. </li></ol></li><li> Intubation trachéale <ol><li> Afin de placer un cathéter pour la ventilation de l&#39;animal, d&#39;abord faire une incision transversale du col de la peau, suivie de la séparation médiane ventrale de la musculature longitudinale de la trachée. </li><li> L&#39;utilisation répétée des mesures ouverture à la fermeture avec une forte pince pour créer un passage pour le fil de suture à travers la face dorsale de la trachée. </li><li> Faire une petite incision dans la trachée sur til face ventrale, pas plus que semi-circulaire, approximativement entre le deuxième et le troisième anneau trachéal. Laisser un temps suffisamment long portion de la trachée exposée sur la face dorsale, afin de permettre la fixation de la sonde trachéale. </li><li> Insérez un mm &quot;Y&quot; canule trachéale de 2,5 à 3,0 dans la trachée, et serrer avec une suture 4-0 monofilament. Se assurer que la canule est reliée à un ventilateur de pression cyclée avec une bouteille reliée au conduit d&#39;expiration qui est rempli de 6 cm d&#39;eau, pour maintenir la pression pulmonaire positive. Flot de gaz devrait être de 100% d&#39;oxygène, à moins expérimentalement souhaité autrement. </li><li> Insérer un cathéter avec une aiguille de 25 à 27 G, et rempli de solution saline héparinée dans l&#39;une des veines de la queue du rat, et fixer en place avec du ruban adhésif. REMARQUE: Veiller à la perméabilité du cathéter veine de la queue toute la procédure en injectant plusieurs reprises une petite quantité de sérum physiologique hépariné dans la veine de la queue. En outre, l&#39;intubation oro-trachéale, ce est à dire la direction d&#39;un trachéaletube par la bouche de l&#39;animal anesthésié et au-delà du larynx dans la trachée, est une alternative possible à la procédure de trachéotomie qui est décrit ici. Cependant, cette méthode nécessite une formation spéciale et de l&#39;expérience, pour éviter d&#39;endommager la trachée, et aussi pour empêcher l&#39;cathétérisme accidentelle de l&#39;œsophage. </li></ol></li><li> Application de la fenêtre pulmonaire <ol><li> Retirer la peau du côté de la poitrine où se trouve la maladie métastatique, en créant une incision, puis détacher la peau en utilisant une dissection mousse. Remarque: La peau peut être excisé et retiré après détachement </li><li> Passez en disséquant les deux couches de muscles recouvrant (pectoral, dentelé et grand dorsal), mais en laissant les muscles intercostaux intacte. Créer une perforation dans la cavité thoracique d&#39;environ 1,5 cm de diamètre, en enlevant des parties de typiquement deux nervures adjacentes. Idéalement, localiser la perforation dans la région de la sixième et de la septième ribs. </li><li> Ostéotomie: <ol><li> Pour minimiser les saignements et les dommages à la surface du poumon, tenir fermement la nervure à couper avec une pince chirurgicale dentées pendant la coupe. Avec des ciseaux chirurgicaux, couper la partie médiane de la première nervure, à un angle d&#39;environ 45 °, laissant le côté pointu de l&#39;os de côte reste pointant extérieur. </li><li> Par la suite, couper la face latérale de l&#39;os de la nervure d&#39;une manière similaire, en laissant à nouveau la partie pointue de l&#39;os de la nervure dirigée vers l&#39;extérieur, pour éviter d&#39;endommager la surface du poumon. </li><li> Répétez la procédure pour la nervure adjacente, puis couper les muscles intercostaux et retirer la pièce excisée. Pendant cette procédure, maintenir la pression de poumon de façon que l&#39;interaction mécanique entre la surface du poumon et la cage thoracique est minimisée. Pour ce faire, en régulant la pression appropriée de l&#39;inspiration sur le ventilateur. </li></ol></li><li> Insertion de la fenêtre: <ol><li> Insérer une fenêtre de poumon sur mesure, composé d&#39;une lamelle qui estrelié à une prise en plexiglas (figure 1B). Fixer la fenêtre à la douille par collage, ou par l&#39;application d&#39;une très petite quantité de graisse à vide. Insérez la fenêtre de façon que les métastases de surface sont situés à proximité du centre de la fenêtre. Si nécessaire, ajuster le trou inséré pour amener le micrométastases au centre de la fenêtre en agrandissant légèrement le trou sur le côté respectif. REMARQUE: maladie métastatique sur la surface pleurale peut être identifié en tant que points blancs clairement reconnaissables ou des zones à l&#39;intérieur des parties autrement à rose saumon couleur saines de la surface du poumon qui apparaissent principalement le long des fissures. Bien micrométastases peuvent se produire sur d&#39;autres secteurs de l&#39;extérieur pleural, les lignées cellulaires étudiées présentent presque toujours surfaçage micrométastases dans la zone perforée, une fois que la maladie métastatique peut être radiologiquement détecté. </li><li> Après l&#39;insertion de la douille dans la perforation, et la création d&#39;un contact direct avec la plèvre viscérale de la lUng, suturer les bords du cadre de la fenêtre au muscle intercostal environnant, en utilisant 4,0 suture monofilament (figure 1C). Utilisez une légère augmentation de la pression de l&#39;inspiration sur le ventilateur pour aider air résiduel de se échapper et pour créer un joint. Note: Le taux de rats de la respiration peut varier considérablement, en fonction du statut de l&#39;anesthésie, état ​​d&#39;excitation ou d&#39;anxiété, concentration en oxygène de l&#39;air inspiré (FiO2), etc. Il est recommandé de régler le taux de respiration entre 70 et 90 bpm. La pression de l&#39;inspiration devrait être réglé avec prudence et ne pas être réglé à plus de env. 8 cm H 2 O (0,6 mm de Hg), pour éviter d&#39;endommager la surface du poumon. </li></ol></li><li> Placer l&#39;animal dans un dispositif de retenue conçu sur mesure qui est conçu pour éliminer le mouvement dans la direction Z (figure 1D) sur une plaque d&#39;acier qui est positionné sur une thermostatique (électricité) couverture chauffante, sous un microscope à fluorescence. Contrôler le corps de l&#39;animalla température rectale à l&#39;aide d&#39;une thermistance. Ajuster les vis du dispositif de retenue d&#39;animal, et la pression d&#39;inspiration sur le ventilateur pour obtenir un contrôle optimal de mouvement latéral. Remarque: la respiration naturelle chez les mammifères implique tous les trois directions de mouvement du poumon et l&#39;extension de la poitrine:, dorso-ventral et cranio-caudale bilatérale. Afin de préserver le mouvement de la respiration naturelle autant que possible, il est important de minimiser la compression dans la direction Z dans la mesure nécessaire. Parce que l&#39;appuie-Z-dimensionnelle a le potentiel d&#39;introduire des artefacts qui peuvent affecter la circulation sanguine et d&#39;autres paramètres, il est conseillé de garder conditions constante pendant série de mesures répétées chez le même animal. </li></ol></li></ol> 4. imagerie et mesure du débit sanguin Microcirculatory <ol><li> Recueillir les globules rouges par ponction cardiaque et les étiqueter avec Dil (1,1-3,3,3 -dioctadecyl = = perchlorate, 3 =-tétraméthyl indocarbocyanine), comme décrit précédemment &lt;sup&gt; 10. </li><li> Injecter 300 ul de globules rouges marqués dans la veine caudale du rat avant l&#39;opération de la chambre de fenêtre est fait, pour éviter les effets première passe d&#39;adhérence à la vitre en verre. Éliminer les bulles d&#39;air dans la seringue ou un cathéter, que l&#39;introduction de l&#39;air dans la veine va inhiber d&#39;autres injections. </li><li> Image du flux sanguin avec une caméra CCD de microscope à -40 ° C puce température de refroidissement, et d&#39;environ 100X résolution globale (ce est à dire avec un objectif de microscope 10X, 10X et pré-caméra oculaire). Utilisez standards jeux de filtres rhodamine / TRITC (excitation 450-490 nm, émission&gt; 515 nm). Enregistrer le taux de trame et pixel résolution réelle des séquences d&#39;images qui en résultent. Marquer au moins 200 (idéalement environ 300) images par pile, afin d&#39;assurer une analyse réussie de la vitesse d&#39;écoulement. </li><li> Reconstituer la perte de fluide dans l&#39;animal en injectant environ 1 ml de solution saline ip chaque h. REMARQUE: Les paramètres expérimentaux qui impliquent une intervention, par exempleun médicament qui modifie la vitesse d&#39;écoulement du sang dans une métastase de cancer pulmonaire, nécessite des mesures répétées de la vitesse d&#39;écoulement du sang dans le cancer métastatique pulmonaire. Pour ces expériences étendues, il est important de reconstituer l&#39;animal avec suffisamment de liquide. </li><li> Euthanasier les animaux en perfusion de 3 ml de 3N KCl dans la veine de la queue </li><li> Évaluer les piles d&#39;images en utilisant un, disponible publiquement algorithme publié ordinateur basé sur Matlab qui créera flux niveaux de gris de la vitesse et des cartes de couleur codé pour tous les flux de traces de sang 10,11. Évaluer la suite les images en niveaux de gris résultant en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image commerciale ou accessibles au public, tels que Image J, après un seuil hors des valeurs qui indiquent aucun mouvement de globules, ce est à dire pas de système vasculaire active. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

On présente un modèle qui est possible à l&#39;évolution de l&#39;image dans le débit sanguin microcirculatoire et d&#39;autres processus dynamiques dans des métastases pulmonaires de rat, en utilisant la microscopie intravitale et l&#39;analyse de la circulation sanguine calcul. Alors que d&#39;autres méthodes existent pour effectuer la microscopie sur les poumons exposés en cages thoraciques ouvertes de rongeurs, ce modèle est également le premier à l&#39;image des métastases pulmonaires par une perforation de la paro...

Le poumon est l’un des organes cibles les plus importants de la maladie métastatique, et comme cette affection est difficile à traiter avec succès par chimiothérapie et radiothérapie, une guérison est encore rare1,2. Des caractéristiques physiopathologiques et microcirculatoires spécifiques des tumeurs primaires et métastatiques solides, telles que l’hypoxie microrégionale, la limitation de la diffusion et la vascularisation tumorale inefficace, contribuent grandement à leur résistance au traitement anticancéreux3,4. En raison de l’échelle microscopique et de la nature dynamique de paramètres tels que le flux sanguin microvasculaire, la microscopie intravitale de la tumeur chez l’animal vivant est devenue un outil de recherche très important dans le domaine5. Bien que des modèles de microscopie intravitale aient été appliqués à des tumeurs dans différents sites d’organes, y compris le poumon métastatique à l’intérieur d’une cage thoracique ouverte, aucun protocole n’a encore été développé pour la recherche sur les métastases pulmonaires dans un environnement à poitrine fermée préservant la physiologie6,7. Une telle entreprise est particulièrement entravée par la nécessité d’accéder chirurgicalement à la cage thoracique sans affecter la fonction globale du poumon7-9. Récemment, une méthode a été introduite pour imager le flux sanguin microcirculatoire pulmonaire dans un environnement proche de la poitrine chez des rats vivants, en utilisant la microscopie intravitale à fluorescence10. Ce protocole permet de quantifier systématiquement la vitesse du flux sanguin à partir de globules rouges injectés et marqués par fluorescence, à l’aide d’une analyse informatisée, tout en maintenant l’animal physiologiquement stable et en préservant l’intégrité du poumon11. Dans la présente étude, nous montrons comment cette technologie peut être modifiée pour imager et quantifier le flux sanguin microcirculatoire dans les métastases pulmonaires inoculées de la veine de la queue à la surface pleurale chez le rat immunodéprimé. Ce modèle est également le premier à étudier les tumeurs pulmonaires métastatiques dans un cadre de microscopie intravitale à poitrine fermée.

<table><tbody><tr><td>Rats nus athymiques</td><td>Charles River</td><td>Code de souche 316</td><td>Rats nus athymiques femelles de 10 semaines</td></tr><tr><td>micro-CT/micro-Irradiateur&nbsp ;</td><td>Precision X-ray Inc.</td><td>Xrad 225Cx</td><td>Utilisez MicroCT pour détecter les métastases</td></tr><tr><td>DiI (1,1=-dioctadécyl-3,3,3=,3=-perchlorate de tétraméthyl-indocarbocyanine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Mélangez 100 ul de globules rouges remplis avec 100 ul de 0,5 mg/ml de DiI dans de l’éthanol à 200 degrés, 2 ml de solution de dextrose à 5 % dans de l’eau, et remplissez jusqu’à un volume final de 10 ml avec un ventilateur salin</td></tr> pour <tr><td>rongeurs</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO Ventilateur</td> <td>pour petits animauxL’appareil est important pour maintenir une pression pulmonaire positive après l’application d’un pneumothorax</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence Zeiss Axioskop Microscope droit</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop</td><td>pour l’imagerie intravitale</td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Andor</td><td>iXonEM 885</td><td>Caméra CCD pour l’imagerie en direct du flux sanguin</td></tr><tr><td>Oxymètre de pouls</td><td>StarrLife</td><td>MouseOx</td><td>Microscope</td></tr> <tr><td></td><td>à fluorescenceMicroscope à fluorescence Zeiss</td><td>Axioskop</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure automatisée du flux sanguin microcirculatory vitesse dans métastases pulmonaire des rats

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Parce que le poumon est un organe cible majeur des maladies métastatiques, les modèles animaux pour étudier la physiologie des métastases pulmonaires sont d’une grande importance. Cependant, très peu de méthodes existent à ce jour pour étudier les métastases pulmonaires de manière dynamique au niveau microcirculatoire, en raison de la difficulté d’accéder au poumon avec un microscope. Ici, une méthode de microscopie intravitale est présentée pour imager fonctionnellement et quantifier la microcirculation des métastases pulmonaires superficielles chez le rat, à l’aide d’une fenêtre pulmonaire à poitrine fermée et d’une analyse automatisée de la vitesse et de la direction du flux sanguin. L’utilité de cette méthode est démontrée pour mesurer l’augmentation de la vitesse du flux sanguin en réponse à une intervention pharmacologique, et pour imager la vascularisation tortueuse bien connue des tumeurs solides. Il s’agit de la première démonstration de microscopie intravitale sur des métastases pulmonaires dans un modèle à poitrine fermée. En raison de son caractère invasif minimisé, ainsi qu’en raison de sa facilité et de sa praticité relatives, cette technologie a le potentiel d’être largement utilisée dans les laboratoires spécialisés dans la recherche sur les tumeurs pulmonaires.

La vascularisation dans les tumeurs solides est connu pour différer considérablement de l&#39;approvisionnement en sang normale, montrant de plus grands degrés de tortuosité et les distances intervasculaires plus élevés 13. En conséquence, les pistes de la circulation sanguine dans le cancer du sein et de métastases pulmonaires sarcome expérimentales ont des formes irrégulières et de grandes lacunes intervasculaires (figure 2A, deux panneaux inférieurs) par rapport à la microcirculation pulmo...

Une méthode est présentée pour mesurer la vitesse du flux sanguin microcirculatoire dans les métastases du cancer pulmonaire de la surface pleurale chez le rat de manière automatisée, en utilisant la microscopie intravitale pulmonaire à poitrine fermée. Ce modèle a le potentiel d’être utilisé comme outil généralisé pour effectuer des recherches physiologiques sur les métastases pulmonaires chez les rongeurs.

Mesure automatisée du flux sanguin Microcirculatory vitesse dans métastases pulmonaire des rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une fenêtre thoracique pour la microscopie intravitale chez un rat présentant des métastases pulmonaires. Cette opération commence par l'anesthésie de l'animal porteur de métastases, son intubation, puis sa connexion à un ventilateur pour petits animaux afin d'assurer une ventilation sous pression. Ensuite, des globules rouges marqués au fluorochrome sont injectés dans la veine caudale de l'animal.Ensuite, la cavité thoracique est accédée chirurgicalement sans endommager la surface du poumon ; la métastase est identifiée et une fenêtre est insérée. Enfin, un examen d'imagerie microscopique de l'animal est réalisé. En définitive, l'ouverture chirurgicale du poumon et l'insertion d'une fenêtre pour la microscopie aiguë chez le rat vivant permettent des mesures automatisées du flux sanguin microcirculatoire dans les métastases pulmonaires.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'imagerie thoracique par micro-TDM, la microscopie épithoracique non invasive et la micro-TAP du poumon cancéreux réside dans sa capacité à permettre des mesures en temps réel avec une résolution spatiale et temporelle élevée de la microcirculation des métastases pulmonaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des métastases pulmonaires, notamment comment les traitements ou la progression du cancer peuvent modifier le débit sanguin et, en fin de compte, l'hypoxie dans les métastases pulmonaires. Les implications de cette technique s'étendent à la fois vers le diagnostic et le traitement du cancer métastatique pulmonaire, car elle offre une visualisation sans précédent des dynamiques de la microcirculation et du microenvironnement métabolique de ces tumeurs métastatiques.Cette méthode ouvrira la voie à la compréhension des dynamiques des métastases pulmonaires et de la microcirculation, et aidera ainsi à améliorer les stratégies thérapeutiques actuelles. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car celle-ci exige de l'expérience pour ajuster les paramètres de manière à minimiser les mouvements autonomes du poumon. Après avoir induit et confirmé un cancer métastatique chez un rat selon le protocole décrit dans le texte et l'avoir anesthésié par une dose intrapéritonéale de pentobarbital, effectuez une pression sur l'orteil afin de confirmer la sédation.Raser l'animal sur le côté du corps présentant la maladie métastatique ainsi que sur la région du cou, puis essuyer soigneusement tous les poils résiduels sur la peau afin d'éviter qu'ils n'interfèrent avec l'imagerie. Appliquer un onguent vétérinaire sur les yeux pour empêcher qu'ils ne s'assèchent. Placer l'animal en position supine sur une plaque métallique posée sur un tapis chauffant à circulation d'eau réglé à 37 degrés Celsius et fixer les membres antérieurs et postérieurs à l'aide de ruban adhésif.Attachez un oxymètre de pouls pour contrôler et enregistrer les signes vitaux tout au long de la procédure d'intubation du rat. Commencez par réaliser une incision cutanée cervicale transversale. Ensuite, séparez médialement la musculature longitudinale située en avant de la trachée à l’aide d’une pince fine.Effectuez une action répétée d'ouverture à fermeture pour créer un passage pour le point de suture à travers la face dorsale de la trachée sur la face ventrale, entre le deuxième et le troisième anneau trachéal. Pratiquez une petite incision dans la trachée. Laissez une portion suffisamment longue de la trachée exposée sur la surface dorsale afin de permettre la fixation du cathéter.Ensuite, insérez une canule trachéale en Y de 2,5 à 3,0 millimètres dans la trachée et serrez à l’aide d’un fil de suture monofilament de calibre quatre zéro. Pour maintenir une pression pulmonaire positive, reliez la canule à de l’oxygène à 100 % via un ventilateur cyclé par pression, auquel est raccordé un flacon rempli de six centimètres d’eau sur le conduit d’expiration. Puis, à l’aide d’une aiguille de 25 à 27 gauge et d’une seringue remplie de solution saline héparinée, insérez un cathéter dans une des veines de la queue et fixez-le en place à l’aide de ruban adhésif. En utilisant des globules rouges préalablement recueillis et marqués avec du DII selon le protocole décrit dans le texte, injectez 300 microlitres dans la veine de la queue du rat afin de créer une fenêtre pulmonaire.Créez une incision du côté cancéreux de la poitrine et détachez la peau par dissection émoussée. Disséquez les deux couches de muscles superposés et conservez les muscles intercostaux intacts au niveau des sixième et septième côtes. Pratiquez une perforation dans la cavité thoracique d’environ 1,5 centimètre de diamètre afin d’effectuer une ostéotomie.Commencez par régler la pression d'inspiration sur le ventilateur afin de minimiser l'interaction mécanique entre la surface pulmonaire et la cage thoracique. Retirez des portions des sixième et septième côtes en utilisant une pince chirurgicale dentée pour maintenir fermement la côte à couper, puis avec des ciseaux chirurgicaux. Coupez le côté médial de la côte selon un angle d'environ 45 degrés, avec le bord tranchant orienté vers l'extérieur.Coupez le côté latéral de l'os de manière similaire, en laissant à nouveau le côté pointu orienté vers l'extérieur. Pour éviter tout dommage au poumon, répétez l'ostéotomie sur la côte adjacente avant de sectionner les muscles intercostaux, puis retirez le fragment excisé. Créez une fenêtre allongée sur mesure en utilisant de la colle ou une petite quantité de graisse à vide pour fixer un couvre-objet à un embout en plexiglas.Insérez ensuite la fenêtre de manière à ce que les métastases superficielles se situent près du centre de la fenêtre, en agrandissant le trou d'un côté si nécessaire. Après avoir inséré le logement dans la perforation et établi un contact direct avec la plèvre viscérale du poumon, utilisez un fil de suture monofilament zéro pour suturer les bords du cadre de la fenêtre au muscle intercostal environnant. Augmentez la pression d'inspiration sur le ventilateur afin de permettre l'évacuation de l'air résiduel et de créer une étanchéité.Ensuite, placer l'animal dans un dispositif de contention sur mesure conçu pour éliminer les mouvements dans la direction Z et le positionner sur une plaque d'acier chauffée sous un microscope à fluorescence. Puis insérer un thermistor rectal afin de contrôler la température corporelle de l'animal. Régler les vis du dispositif de contention et la pression d'inspiration du ventilateur afin d'obtenir un contrôle optimal des mouvements latéraux.Pour l'imagerie et les mesures du flux sanguin microcirculatoire. Utilisez une caméra CCD avec une température de refroidissement de la puce réglée à moins 40 degrés Celsius et un objectif 10 x. À l’aide de jeux de filtres standard pour bâtonnets Domine Trit C, enregistrez la fréquence d’images réelle et la résolution en pixels des séquences d’images obtenues.Enregistrez au moins 200 images par pile pour assurer une analyse réussie de la vitesse d'écoulement pendant la séance d'imagerie, afin de compenser la perte de liquide chez l'animal. Pour maintenir une vitesse constante du flux sanguin, effectuez une injection intrapéritonéale d'environ un millilitre de sérum physiologique chaque heure.Endormir l'animal conformément au protocole décrit après la fin de l'imagerie. On sait que le réseau vasculaire des tumeurs solides diffère sensiblement de l'irrigation sanguine normale, présentant un degré accru de tortuosité et des distances intervasculaires plus importantes. Ainsi, comme illustré ici, les trajets de flux sanguin dans les modèles expérimentaux de cancer du sein pulmonaire et de métastases présentent des formes irrégulières et de larges espaces intervasculaires par rapport à la microcirculation normale.Dans cette étude, comme ce qui a été démontré dans des poumons sains, l'administration d'une association d'éphédrine et d'un antagoniste des récepteurs de l'endothéline, l'entin, a augmenté la vitesse du flux sanguin dans un sarcome de souris. Chaque point de données représente la moyenne regroupée de mesures individuelles effectuées en triplets à des intervalles de cinq minutes, moyennée sur les données obtenues chez cinq animaux. La première injection a significativement augmenté la vitesse du flux sanguin dans la zone tumorale, passant de 0,61 ± 0,12 millimètre par seconde à 0,74 ± 0,19.Alors que la deuxième injection a maintenu la vitesse d'écoulement élevée à 0,74 ± 0,19 millimètre par seconde. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'éviter toute structure pointue saillante lors de la section du cadre costal, car cela provoquerait des lésions ultérieures et un saignement du poumon après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'étude des métastases pulmonaires pour explorer des critères d'évaluation liés au développement de médicaments anticancéreux, tels que la diffusion, la limitation de l'administration de médicaments cytotoxiques, ainsi que la diffusion, l'hypoxie limitée et les modèles chez le rat des métastases pulmonaires.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir un accès chirurgical au poumon porteur de métastases ou sain du rat et d'effectuer un examen microscopique sur celui-ci.

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Adulte normale vascularisé tissus de mammifères qui manque de l'angiogenèse physiologique et qui n'a pas été exposé à une intervention chirurgicale est utilisée pour étudier: (i) l'initiation et le développement de l'angiogenèse après administration intrapéritonéale d'agents de test, et (ii) la modification de l'angiogenèse après l'administration systémique de certains agents de test.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

La vasoconstriction pulmonaire hypoxique (HPV) est un phénomène physiologique important par lequel à l’hypoxie alvéolaire la perfusion pulmonaire est assortie à la ventilation. Le segment vasculaire principal contribuant au VPH est l’artère intra-acinnaire. Ici, nous décrivons notre protocole pour l’analyse du VPH des vaisseaux pulmonaires murins d’un diamètre de 20 à 100 μm.

Analyse vidéomorphométrique de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères intra-pulmonaires à l’aide de tranches pulmonaires coupées de précision murine

La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, il est possible de visualiser des réseaux microvasculaires à la surface du poumon. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier la perméabilité des microvaisseaux simples dans les poumons isolés en utilisant l'imagerie de fluorescence en temps réel.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

La technique Landis modifiée permet de mesurer par appariement la conductivité hydraulique de microvaisseaux individuels dans le mésentère de rats normaux et génétiquement modifiés dans des conditions de contrôle et d’essai à l’aide de techniques de microperfusion. Il s’agit d’une méthode pratique pour évaluer les mécanismes qui régulent la perméabilité des microvaisseaux et les échanges transvasculaires dans des conditions physiologiques.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Ce manuscrit décrit le développement d’un modèle animal qui permet de tester directement les effets de l’hypoxie tumorale sur les métastases et de déchiffrer les mécanismes de son action. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur le sarcome d’Ewing, une approche similaire peut être appliquée à d’autres types de tumeurs.

Modèle in vivo pour tester l&#39; effet de l&#39; hypoxie sur la tumeur métastase

Présenté ici est un protocole pour étudier la microcirculation coronaire dans le tissu cardiaque murin vivant par la surveillance ex vivo de la pression artérielle de perfusion et le flux qui maintient la pression, ainsi que les composants vasculaires de l’arbre, y compris les lits capillaires et péricytes, que l’artère septale est cannulée et pressurisée.

Mesure dynamique et imagerie des capillaires, artérioles et péricytes dans le cœur de souris

Nous présentons ici un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique à demeure permanente pour le thorax murin, qui permet une imagerie intravitale à haute résolution du poumon. La permanence de la fenêtre la rend bien adaptée à l’étude des processus cellulaires dynamiques dans le poumon, en particulier ceux qui évoluent lentement, tels que la progression métastatique des cellules tumorales disséminées.

Une fenêtre permanente pour enquêter sur les métastases cancéreuses au poumon

Ce protocole introduit une méthode rapide pour l’imagerie vasculaire tridimensionnelle quantitative à montage entier à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière. L’efficacité de la méthode est démontrée à l’aide du système d’artère de l’arc pharyngé du modèle d’embryon de poulet, avec des forces hémodynamiques quantifiées par la dynamique des fluides numérique.

Imagerie rapide à haute résolution de l’ensemble du système vasculaire de petits animaux pour des études quantitatives

Le protocole offre une introduction détaillée à l’expérience d’utilisation de la méthode de cathétérisme cardiaque droit pour détecter la pression de l’artère pulmonaire chez les rats, ce qui aidera à obtenir des données précises plus efficacement et à améliorer le taux de réussite de l’expérience. Cette méthode améliore également la reproductibilité des expériences à travers différents laboratoires.

Mesure de la pression de l’artère pulmonaire chez les rats à l’aide d’un cathétérisme cardiaque droit

La couche de surface endothéliale glycocalyx / endothéliale est idéalement étudiées par microscopie intravitale. Microscopie intravitale est techniquement difficile dans un organe en mouvement, comme le poumon. Nous montrons comment fond clair simultanée et la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour estimer endothéliale épaisseur de la couche de surface dans un mouvement...

La mesure in vivo de la surface de la couche de souris pulmonaire endothéliale

Découvrez la mesure automatisée du flux sanguin microcirculatoire dans les métastases pulmonaires chez le rat. Cette méthode par microscopie intravitale thoracique permet d'étudier la dynamique tumorale en temps réel.

Mesure automatisée du flux sanguin Microcirculatory vitesse dans métastases pulmonaire des rats

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