Name: Analyse détaillée de la dynamique de transcription à partir déchantillons de cerveau après lexpérience comportementale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez l'analyse de la dynamique transcriptionnelle dans le noyau accumbens de souris après exposition à la cocaïne. Cette méthode par qPCR permet d'étudier les changements d'expression génique liés au comportement.

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Ce travail a été financé par la subvention de la Fondation scientifique d’Israël (ISF # 393/12), la subvention des centres d’excellence de recherche d’Israël (I-CORE 1796/12), la subvention de la Fondation germano-israélienne (GIF # 2299-2291.1/2011) et la subvention d’intégration de carrière Marie Curie (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Les premières étapes du projet ont été financées par une bourse postdoctorale d’AXA à AC. Nous reconnaissons les généreux fonds de démarrage fournis par le Centre Edmond et Lily Safra pour les sciences du cerveau.
La lecture critique par les membres du laboratoire Citri est grandement appréciée.

NOTE: Le protocole suit les directives de protection des animaux de l&#39;Université hébraïque de Jérusalem. 1 Préparation de la solution de l&#39;ACSF <ol><li> Préparer la solution de l&#39;ACSF, comme décrit dans le tableau 1. Faire 1 L dans le trou DDH 2 O (&gt; 18 MQ pureté), ce qui porte l&#39;osmolarité de ~ 300 mOsm / L avec plus appropriée d&#39;eau ou de NaCl. </li></ol> 2 Équipement et aménagement de la salle L&#39;équipement pour la surveillance du comportement locomotrice induite par la cocaïne est constitué de chambres de comportement (50 x 45 cm) câblés avec une source de lumière interne, d&#39;un ventilateur et d&#39;une caméra (ou des capteurs infrarouges), et équipé d&#39;une boîte en plexiglas intérieure (30 x 30 cm) en qui les souris sont autorisés à se déplacer librement tout en leur locomotion est surveillée. Le test comportemental doit être effectué entre 1 heure après le coucher à 1 heure avant les lumières, sur un cycle régulier lumière / obscurité. Les animaux doivent être formés régulièrement à la même heure chaque jour. <ol><li&gt; Connectez l&#39;appareil photo ou d&#39;un système infrarouge à un système approprié de suivi et d&#39;enregistrement du comportement locomoteur des souris. </li><li> Nettoyer les chambres après chaque essai avec un désinfectant fournie par l&#39;installation de la souris et / ou élimination des odeurs réactif, afin d&#39;éviter un biais de repère olfactif et à assurer une désinfection adéquate. </li></ol> IMPORTANT: Lorsque vous manipulez les souris se taire, calme et prudent. 3 Préparation des animaux <ol><li> Maison 5 C57BL6 souris mâles (6-12 semaines; ~ 25-35 g de poids) par cage, dans une pièce avec une lumière 12 h cycle jour / nuit et l&#39;accès libre à la nourriture et de l&#39;eau, conformément aux normes et exigences de animale locale Entretien directives et protocoles du Comité. Avant de lancer l&#39;expérience, peser les souris et enregistrer les données. La cocaïne est administrée par la suite en fonction du poids de la souris. </li><li> Transférer toutes les cages contenant des souris dans le comportement à manger 30 min avant de commencer le premier essai. </li><li> Habituer tout de lasouris utilisées dans l&#39;expérience de la manipulation expérimentateur, les injections et la surveillance dans la configuration du comportement. Ceci est réalisé en trois injections intrapéritonéales quotidiennes consécutives de 250 ul de solution saline comme décrit ci-dessous. </li><li> Administrer une injection intrapéritonéale de 250 pi saline. Immédiatement après l&#39;injection, de placer la souris dans une chambre de comportement pour contrôler l&#39;activité locomotrice pendant 15 minutes. Répétez cette action pour 3 jours consécutifs, à la même heure chaque jour. </li><li> Le quatrième jour, les souris diviser en deux groupes. Préparer une solution stock de cocaïne à 2 mg / ml dans une solution saline. Administrer une injection unique de solution de cocaïne (finale de 20 mg / kg) au groupe expérimental en fonction du poids de la souris (par exemple, pour une souris de 25 g - injecter 250 ul, tandis que 30 g d&#39;une souris recevra 300 pi). Administrer une solution saline pour le groupe de contrôle. Immédiatement après l&#39;injection, de placer la souris pendant 20 minutes dans une chambre de comportement pour la surveillance de l&#39;activité locomotrice (typicallié, les 15 premières minutes sont surveillés). </li><li> Après l&#39;injection de cocaïne, de sacrifier les souris à des temps différents (0, 1, 2, 4, 8 et 24 h après l&#39;injection). Surtout, assurez-vous que les souris de référence (0 point de temps) ne recevront aucune injection de ce jour. En raison de son importance, il est impératif d&#39;inclure les répétitions du groupe de référence. </li></ol> 4. Dissection des noyau accumbens <ol><li> Anesthésier les souris avec de l&#39;isoflurane au moment approprié après l&#39;injection de cocaïne / solution saline. L&#39;isoflurane doit être évacué directement hors de la chambre. Par conséquent, le test doit être réalisé dans une hotte chimique. </li><li> Surveiller la profondeur d&#39;anesthésie en testant le réflexe du pied arrière. Pincez la patte pour obtenir une réponse de retrait par l&#39;animal. Un animal qui montre un réflexe n&#39;est pas à un niveau chirurgical de l&#39;anesthésie et pas dans un état d&#39;euthanasier. </li><li> Extraction du cerveau: <ol><li> Euthanasier la souris par décapitation. </li> &lt;li&gt; Retirer la peau au-dessus du centre du crâne et couper le crâne avec des ciseaux pointus. </li><li> Insérez les ciseaux à l&#39;endroit où la moelle épinière pénètre dans le cerveau (foramen magnum) et faire deux coupes latérales. </li><li> Du même point, faire un long coupe sagittale le long de la suture sagittale. Après avoir atteint le bulbe olfactif, le clip vers la gauche et vers la droite. </li><li> Avec une pince, retirer le crâne soigneusement, en saisissant chaque moitié du crâne fermement et en tirant sur le côté, en prenant soin de ne pas appuyer sur ou endommager le cerveau. </li><li> Retirez le cerveau tout en coupant les nerfs crâniens en utilisant une cuillère micro spatule inversée. </li></ol></li><li> Placez le cerveau dans une solution ACSF glacée pendant 1-2 min pour refroidir et durcir. </li><li> Retirer cerveau de l&#39;ACSF, évacuer l&#39;excès de liquide avec une serviette en papier, créer une coupe coronale entre le cervelet et le reste du cerveau et de la colle du cerveau, avec la partie rostrale vers le haut, sur la scène vibratome. </li><li> Couper le NAc: <ol&gt; <li> Maintenir des solutions ACSF à des températures glaciales dans la chambre de découpage du vibratome. Section à 200 um jusqu&#39;à le noyau accumbens (NAC) est clairement identifié en fonction de la souris Brain Atlas Paxinos et Franklin (environ 1,8 mm de antérieure à Bregma; attention à la forme du corps calleux, l&#39;emplacement et la forme de la commissure antérieure et les ventricules, ainsi que la morphologie générale de la section de cerveau). À ce stade, la création de deux sections 400 um, à partir de laquelle le NAc sera disséquée. </li><li> En vertu d&#39;un stéréoscope, utiliser une fine lame de disséquer la zone NAc sur les tranches. La définition de la NAC est selon les atlas du cerveau de la souris Paxinos et Franklin, et pourrait facilement être disséqué dans les sections appropriées de quatre passes rapides de la lame sur le tissu. (Figure 2). </li><li> Placez sections NAc immédiatement dans 900 ul Trizol réactif de lyse dans un tube à centrifuger et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;ARN extraction. </li></ol></li></ol> 5. extraction d&#39;ARN et d&#39;ADNc de la transcription inverse <ol><li> Décongeler les tubes contenant les sections de noyau accumbens Trizol réactif de lyse à la température ambiante et homogénéiser le lysat avec une seringue de 1 ml relié à l&#39;aiguille 25 G jusqu&#39;à ce que le tissu est complètement homogénéisé (au moins 15 à 20 fois). Les premiers tours sont difficiles et nécessitent de pousser le tissu contre la paroi du tube afin de le casser en petits morceaux qui pourraient entrer dans la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Pour assurer une homogénéisation, pipeter le lysat dans une mini-colonne de centrifugation et QIAshredder à 12000 g pendant 1 min. </li><li> Déposer le lysat dans nouveau tube et extraire l&#39;ARN selon les instructions du fabricant. Stocker l&#39;ARN à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;ARN, d&#39;analyser l&#39;intégrité et de la qualité en utilisant un Bioanalyzer ou équipement équivalent. Utilisez 100-500 ng d&#39;ARN pour chaque tour de préparation d&#39;ADNc avec rAndom amorces hexamères. </li></ol> 6. Primer Conception et Test Primer <ol><li> Choisir de bons amorces: Pour une paire d&#39;amorces optimales pour qPCR de transcrits d&#39;ARNm, suivez ces exigences (figure 3): <ol><li> amorces de conception ne contenant pas plus de 17-28 bases. Évitez les répétitions de nucléotides, car ils favorisent mésamorçage. </li><li> Conception des amorces avec la température de fusion (T m) entre 56 à 68 ° C (de manière optimale de 60 à 64 ° C). La Tm à l&#39;intérieur de la paire d&#39;amorces doit être à moins de 1 ° C les unes des autres. </li><li> Soyez conscient que la taille du produit devrait idéalement se situer entre 80 et 150 points de base. </li><li> Veiller à ce que au moins l&#39;une des amorces couvre une jonction exon-exon, ou l&#39;amplicon contient un grand intron (intron-recouvrement), pour éviter l&#39;amplification des contaminants de l&#39;ADN génomique. </li><li> Utilisez un logiciel fiable basé sur Primer3 (pour des exemples, voir le tableau 2) afin d&#39;améliorer la conception primaire. </li></ol></li><li> Test de la prIMERS: Afin de garantir l&#39;efficacité et la spécificité des amorces, une réaction qPCR de contrôle doivent être effectuées: <ol><li> Utilisation d&#39;un échantillon positif (contenant de l&#39;ADNc matrice pour toutes les paires d&#39;amorces appropriées) et doser l&#39;ADNc (par exemple, huit dilutions au tiers à partir d&#39;une concentration initiale d&#39;environ 10 ng) dans des réactions parallèles en double. Inclure un contrôle sans modèle, qui contrôle de la contamination dans les solutions utilisées pour la réaction. </li><li> Calculer l&#39;efficacité d&#39;amorce en utilisant la formule: (10 (- 1 / pente) -1) x 100, de telle sorte que la courbe de la pente optimale est de - 3,333 (c.-à-10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figure 4). </li><li> Déterminer la spécificité de l&#39;amplification. Une amplification spécifique est démontrée par un seul pic proéminent commun à toutes les courbes de fusion des produits amplifiés, tandis que l&#39;amplification de la cible apparaît comme une déviation fr évidentom le seul grand pic. </li></ol></li></ol> 7. analyse qPCR <ol><li> Pré-amplification: <ol><li> Une analyse complète qPCR est basée sur l&#39;interrogation parallèle de limiter les quantités d&#39;ARN avec un grand nombre de paires d&#39;amorces. Par conséquent, une étape de pré-amplification est essentielle. Dans cette étape, l&#39;ADNc est soumis à des cycles de 14 à 18 de la pré-amplification avec un mélange de toutes les amorces qui seront utilisées pour l&#39;interrogation de l&#39;échantillon dans le futur (jusqu&#39;à 800 paires d&#39;amorces). </li><li> Diluer toutes les amorces de TE (faible EDTA) à 50 uM pour une amplification spécifique cible (STA). </li><li> Piscine ensemble des aliquotes de 1 pl de l&#39;amorce tout 50 uM fixe pour être inclus dans la réaction STA, jusqu&#39;à 800 tests. </li><li> Préparer pré-mélange et échantillons pour STA comme décrit dans le tableau 3. Permettre erreur en préparant mélange pour 110% du nombre d&#39;échantillons qui doivent être amplifiés. </li><li> Aliquoter 3,75 ul STA pré-mélange pour chaque échantillon. Ajouter 1,25 pide l&#39;ADNc de chaque. </li><li> Vortex à mélanger les réactions et centrifuger pendant 10 s. </li><li> Placez les réactions STA dans un cycleur thermique et le cycle comme indiqué au Tableau 4. </li></ol></li><li> Exonucléase I (Ex-i) le traitement: <ol><li> Diluer le Exo I comme indiqué dans le tableau 5. </li><li> Ajouter 2 pi de Exoi dilué (4 UI / ul) à chaque réaction STA 5 pi, vortex, centrifuger (&gt; 6000 xg) et placer dans un cycleur thermique à 37 ° C pendant 30 min et ensuite à 80 ° C pendant 15 min. </li><li> Diluer le produit final à une concentration appropriée pour l&#39;essai. L&#39;utilisation du tampon TE (ajouter 43 ul de tampon TE à l&#39;échantillon de TSA 7 pi). </li><li> Stocker les produits STA dilué à -20 ° C ou utiliser immédiatement. </li></ol></li><li> Primer et la configuration de l&#39;échantillon pour qPCR: <ol><li> Préparer les échantillons comme indiqué dans le tableau 6. Préparer mélange en fonction de la puce choisie de l&#39;expérience, et le cas échéant ajouter des échantillons. </li><li> Agiliter les solutions de répartition de l&#39;échantillon pour un minimum de 20 secondes, et centrifuger (&gt; 6000 xg) pendant au moins 30 secondes. Préparations réactions peuvent être stockés pendant de courtes durées à 4 ° C jusqu&#39;à ce que la puce est prêt pour le chargement. </li><li> Préparer les essais comme décrit dans le tableau 7. </li><li> Agiter le dosage Mix pour un minimum de 20 secondes et centrifuger (&gt; 6000 xg) pendant au moins 30 secondes pour tourner vers le bas tous les composants. IMPORTANT: Vortex à fond et centrifugeuse toutes les solutions échantillonnage et d&#39;analyse avant de pipetage dans les entrées de la puce. Ne pas le faire peut entraîner une diminution de la qualité des données. REMARQUE: La concentration finale de chaque amorce est de 5 uM à l&#39;entrée et 500 nM dans la réaction finale. </li></ol></li><li> Amorçage et charger la Dynamic Array IFC (circuit fluidique intégré) à puce. La puce de la SFI a des entrées pour des échantillons et des analyses, ainsi que les entrées spécifiées (piles) pour le fluide de la ligne de commande (huile minérale) utilisé pour pressuriser les chambres microfluidiques (Figure 4A). <ol><li> Injecter le fluide de la ligne de commande dans chaque accumulateur sur la puce. </li><li> Retirez et jetez le film de protection bleu du fond de la puce. </li><li> Placez le jeton dans le contrôleur IFC approprié (contrôleur MX pour le 48.48 dynamique IFC RAID ou le HX contrôleur de l&#39;IFC pour l&#39;dispositif dynamique 96.96 SFI), puis exécutez le script Premier (113x) pour le 48.48 dynamique IFC RAID ou le premier (136x) script pour le dispositif dynamique 96.96 IFC pour amorcer la puce. </li><li> Lorsque le script est terminé, retirez la puce amorcée à partir du contrôleur de la SFI. </li><li> 5 ul de chaque dosage Mix et 5 pi de chaque échantillon Mix dans leurs entrées. </li><li> Retour à la puce du contrôleur de la SFI. </li><li> Utilisation du logiciel de contrôleur de la SFI, exécutez la charge Mix (113x) script pour le 48.48 Dynamic Array IFC) ou Charger Mix (136x) script pour le dispositif dynamique 96.96 IFC pour charger les échantillons et les analyses dans la puce. Lorsque le script charge Mix est terminée, retirer la chargepuce ed du contrôleur de la SFI. </li><li> Charger la puce sur le cycleur thermique, créer une nouvelle puce terme (selon les directives du fabricant), y compris l&#39;analyse de la courbe de fusion. En utilisant le logiciel du thermocycleur, veiller à ce que les chambres de réaction sont identifiés correctement, et permettent à la réaction pour exécuter l&#39;achèvement. </li></ol></li></ol> Analyse 8. données <ol><li> Assurance de la qualité: Afin d&#39;assurer la qualité des données, vérifier la qualité des amorces en abordant les courbes de dilution (comme décrit ci-dessus). Surveiller la spécificité de l&#39;amplification en regardant les courbes de fusion des amplicons, les pics de qui devraient être étroitement alignées de façon optimale 29. </li><li> Visualisation: Pour la visualisation de grandes quantités de données obtenues par qPCR haut débit, utilisez le logiciel généré heatmaps, dans lequel l&#39;expression est de couleur selon l&#39;intensité. En outre, afficher la dynamique de la transcription de gènes uniques que les nuages ​​de points alignés. </li><li> Publication: Dans l&#39;éditionles résultats de l&#39;expression des gènes, il est conseillé de suivre les lignes directrices MiQE pour la publication des expériences quantitatives PCR en temps réel, en détaillant les informations minimales qui doivent être déclarés pour une expérience qPCR pour assurer sa pertinence, l&#39;exactitude, l&#39;interprétation correcte, et la reproductibilité. </li></ol>

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<li>Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+synapses+in+vivo+correlate+with+functional+changes+during+experience-dependent+plasticity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex.</a> The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).</li>
<li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+wanting%3A+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li>
<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Caractérisation succès de l&#39;expression des gènes du tissu cérébral qui suit paradigmes comportementaux dépend: 1) Une manipulation soigneuse des souris pendant le paradigme comportemental; 2) dissection rapide et précise des tissus d&#39;intérêt; 3) les mesures d&#39;ARN de sécurité pour assurer l&#39;intégrité de l&#39;ARN; et 4) la planification minutieuse des amorces et dispositif expérimental ainsi que la précision et l&#39;attention au détail dans la préparation de l&#39;analyse qPCR. <p class="jove_content...

Organisation dynamique du cerveau permet la flexibilité cognitive et comportementale. Les expériences sont codées par des modifications de la structure et de la force des connexions entre les neurones dans le cerveau 3. Cette «plasticité expérience dépendant&quot; est le résultat de l&#39;induction des modes spécifiques de l&#39;expression du gène qui fournit les protéines nécessaires à la modification de la structure et de la force synaptique 4. L&#39;identification des réseaux de régulation génétique médiation de la formation de la mémoire à long terme est un élément central de la neuroscience moléculaire, avec l&#39;espoir que l&#39;identification des éléments dominants de programmes de transcription donnera un aperçu des principes fondamentaux qui régissent la formation de la mémoire, ainsi que des objectifs pour traitement des maladies neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques. Programmes de transcription se déroulent dans les vagues temporellement définis, chacun des gènes qui codent des caractères différents, qui sont importants pour différents étapes dans la mise en œuvre des résultats de l&#39;événement de signalisation 1,2. Il est donc important d&#39;aborder la dynamique de la transcription sur un délai temporel détaillée, afin d&#39;identifier la liste complète des gènes induits, et pour mieux comprendre leur fonction de potentiel selon la dynamique de leur induction. La toxicomanie est une forme robuste de plasticité dépendant de l&#39;expérience causée par les effets à long terme de l&#39;abus des drogues sur les circuits neuronaux dans le cerveau 5,6. , L&#39;exposition aiguë initiale aux médicaments peut conduire à l&#39;apparition de la toxicomanie et de la transition vers l&#39;utilisation chronique. Les informations contextuelles est un élément crucial dans le développement de la toxicomanie. Signaux environnementaux associés au médicament sont affectés une grande importance dans l&#39;esprit des toxicomanes. Les informations contextuelles rappelant un toxicomane de l&#39;expérience passée de drogues peut induire une rechute de l&#39;état de manque, même après de longues périodes d&#39;abstinence de l&#39;exposition au médicament 7,8.D&#39;où le grand défi clinique dans la dépendance - la propension des toxicomanes à la rechute, même longtemps après que les symptômes de sevrage ont disparu 9. La sensibilisation comportementale à la cocaïne est un modèle simple de l&#39;expérience de la cocaïne utiles dans l&#39;étude des mécanismes de la toxicomanie. Dans ce modèle largement étudié pour la sensibilisation de longue durée induite par l&#39;exposition chronique aux drogues d&#39;abus, les rongeurs sont d&#39;abord habitués à des injections de solution saline (de intrapéritonéale; IP) dans un nouvel environnement (une chambre ouverte sur le terrain où leur activité locomotrice est surveillée) ; ensuite, ils reçoivent des injections quotidiennes de cocaïne dans les chambres en plein champ, tandis que leur activité est contrôlée 10 (figure 1). Ce paradigme comportemental se traduit généralement par une sensibilisation robuste de comportement locomoteur (8-12 fois supérieure à l&#39;activité de base) 11, qui est maintenue pendant une période de plusieurs mois après l&#39;arrêt des injections de cocaïne, ce qui montre la formation d&#39;un perversasive trace mnésique de l&#39;expérience de la drogue. Les circuits neuronaux de la récompense, naturellement impliqué dans le renforcement des comportements essentiels pour le succès d&#39;une espèce (par exemple, l&#39;alimentation, le sexe), est exploitée par l&#39;abus des drogues à renforcer les comportements de drogue associé 12,13. Les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels l&#39;expérience de l&#39;abus des drogues est renforcée semblent être similaires aux mécanismes sous-jacents de la formation des souvenirs déclaratifs ou sémantiques dans d&#39;autres structures cérébrales 14. Par conséquent, la robustesse du modèle de sensibilisation comportementale en fait un système modèle attractif pour étudier les mécanismes d&#39;expérience dépendant de plasticité. Le noyau accumbens (NAC) est un intégrateur central du circuit de récompense du cerveau, et a été largement associée au développement de la dépendance à 5,6. La formation de la dépendance dépend de la transcription de nouvelles protéines dans le noyau accumbens et robusteproduction de programmes de transcription clairement structurés est observée dans le NAc suivante expérience de la cocaïne 15-19. L&#39;réponse transcriptionnelle aiguë à l&#39;exposition de la cocaïne est susceptible de fonctionner à plusieurs niveaux afin de s&#39;adapter à la relance de forte induction et d&#39;orienter la production de nouvelles protéines qui sont responsables des changements structurels et électrophysiologiques induites par l&#39;exposition au médicament 6,19-22. Afin de promouvoir l&#39;étude des mécanismes moléculaires de la plasticité dépendant de l&#39;expérience dans le cerveau, un protocole est décrit pour l&#39;analyse globale de la dynamique de transcription dans des échantillons de tissu cérébral qui suit manipulation comportementale. Le protocole est illustré dans le cadre de l&#39;expérience du comportement étudié dans le laboratoire Citri - la sensibilisation comportementale à la cocaïne, en utilisant les tableaux dynamiques microfluidiques pour analyse transcriptionnelle. Le protocole décrit n&#39;est évidemment pas limitée à l&#39;étude de til noyau accumbens, dans le cadre de la sensibilisation comportementale, mais pourrait être appliquée à un grand nombre de paradigmes comportementaux et les régions du cerveau. En fait, ce protocole peut être appliqué aux tissus de l&#39;organisme à l&#39;extérieur du cerveau, et une variété d&#39;expériences ou des manipulations de l&#39;organisme étudié. Le protocole est grossièrement divisé en quatre étapes. Dans la première étape, l&#39;animal est soumis au paradigme comportemental; dans la seconde étape, le tissu est microdissection; dans la troisième étape - l&#39;ARNm est purifié, à une transcription inverse et de sonde, et dans l&#39;étape finale, les données sont analysées. Dans le cadre de l&#39;étude de la dynamique de la transcription, la synchronisation précise et la définition de l&#39;expérience sont probablement paramètres expérimentaux les plus importants à contrôler. Pour cette raison, le modèle de comportement de choix est celui de la sensibilisation comportementale à la cocaïne, un système qui permet un niveau élevé de contrôle de l&#39;expérimentateur sur les paramètres de l&#39;expéCE. Paradigmes comportementaux supplémentaires qui permettent une synchronisation précise et traitent les différents modèles de plasticité dépendant de l&#39;expérience ou de la formation de la mémoire sont disponibles. Ces modèles comprennent conditionnement de la peur 23, l&#39;enrichissement environnemental aigu 24,25, roman objet exploration 26 et expérience visuelle suivante élevage sombre 27. Pourtant, la sensibilisation comportementale à la cocaïne est une manipulation du comportement solide et cohérent, la création d&#39;une trace de mémoire hautement invasive qui dure depuis des mois suivants expérience de cocaïne 28. Le cerveau est sectionné, suivie par microdissection manuel de noyau accumbens. Il a été notre expérience que la microdissection manuel de tranches de cerveau préparés rapidement fournit la méthode la plus fiable et rapide de l&#39;extraction du tissu concerné au paradigme comportemental, et avec l&#39;expérience, les limites du tissu devenu évident et facilement reconnaissables. Sinon, fines tranches pourraient être prépared, suivie par laser capture microdissection. Bien que ce procédé permet de fortement délimitation de la région d&#39;intérêt définie, il est lent (risquant ainsi la perte d&#39;ARNm labile), fastidieux et nécessite un équipement coûteux dédié (un microscope équipé d&#39;une installation laser de capture). Le protocole défini dans ce document peut également être adapté à l&#39;analyse de la transcription de cellules isolées, par aspiration manuelle du cytoplasme des cellules identifiées visuellement à l&#39;aide de pipettes de patch 29. Il est important de noter que le protocole décrit fournit une moyenne de la population, alors qu&#39;il est très probable que dans la plupart des cas, seule une sous-population de cellules dans le tissu sont effectivement impliqués dans la réponse à l&#39;expérience. Il est intéressant de profil transcription d&#39;une manière sélective au sein de populations de cellules spécifiques répondant à l&#39;expérience, mais la discussion de ces approches est au-delà de la portée actuelle. Pour la purification de l&#39;ARNm, la transcription inverse et qPCR interrogation, le tissuest perturbé par passage à travers de fines aiguilles, suivie par l&#39;utilisation de kits disponibles dans le commerce (pour plus d&#39;informations, voir le tableau 8). Le choix est informé par l&#39;expérience de ces méthodes, qui assurent l&#39;extraction fiable de l&#39;ARN de haute qualité et des résultats solides à partir d&#39;applications en aval. Alors que le protocole est décrit par qPCR à haut débit en utilisant des tableaux dynamiques, les échantillons peuvent être sondés pour l&#39;expression de gènes en utilisant la PCR point final, à faible débit qPCR, puces géniques d&#39;expression ou le séquençage de profondeur. La préférence pour la PCR quantitative à haut débit en utilisant des tableaux dynamiques est due au fait que l&#39;ARNm obtenu à partir de noyaux cérébraux suivant paradigmes comportementaux est souvent de quantités limitantes. Les tableaux dynamiques fournissent une plate-forme qui permet l&#39;analyse globale efficace de la transcription à partir d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons parallèles en une seule expérience. Après l&#39;acquisition initiale du système microfluidique (généralement une unité centrale institutionnelrchase), les expériences sont relativement peu coûteux à exécuter. Suite à cette analyse, outre l&#39;interrogation des échantillons peut être effectuée en utilisant des plates-formes plus coûteuses pour rechercher de nouveaux relevés de notes (biopuces ou RNAseq) avec les tableaux dynamiques fournir une référence complète pour l&#39;assurance de la qualité. Enfin, l&#39;analyse des données, les approches classiques sont utilisés. Pointeurs spécifiques concernant les problèmes qui pourraient survenir seront discutés dans le texte du protocole. Ce protocole est le plus approprié pour les enquêteurs s&#39;intéressent à une enquête approfondie de leur système d&#39;intérêt, l&#39;étude de plusieurs conditions et répétitions. Le protocole est également le plus approprié pour les enquêteurs qui ont déjà acquises dans (à travers des expériences de puces à ADN ou RNAseq) sur un sous-ensemble de 50-500 gènes d&#39;intérêt, qu&#39;ils sont intéressés à interroger à plusieurs reprises.

<table><tbody><tr><td>Virusol</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 100 %</td><td>MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus Mini Kit Universel</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder QIAGEN</td><td></td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td></td> Chambre <td>de comportement 1355656</td><td></td>Invitrogen</tr><tr><td>(MDF ; 50 x 45 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte intérieure en plexiglas auto-assemblée (30 x 30 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo et magnétoscope</td><td>auto-assemblés Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’enregistrement de média</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Inst.</td><td>7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies</td><td>Le bioanalyseur</td><td></td>Agilent 2100</tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>Spatule à microcuillère inversée</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD Reader</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic array Puce pour l’expression de gènes 96.96</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse détaillée de la dynamique de transcription à partir d&#39;échantillons de cerveau après l&#39;expérience comportementale

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

L&#39;encodage d&#39;expériences dans le cerveau et la consolidation de la mémoire à long terme dépend de la transcription des gènes. Identifier la fonction de gènes spécifiques dans l&#39;expérience de codage est l&#39;un des principaux objectifs de la neuroscience moléculaire. En outre, l&#39;association fonctionnelle des gènes définis avec des comportements spécifiques a des implications pour la compréhension de la base de troubles neuropsychiatriques. L&#39;induction de la transcription des programmes de solides a été observée dans le cerveau des souris après diverses manipulations du comportement. Bien que certains éléments génétiques sont utilisées de manière récurrente suivant différentes manipulations et de comportement dans différents noyaux du cerveau, les programmes de transcription sont globalement unique pour les stimuli induisant la structure et dans laquelle elles sont étudiées 1,2. Dans cette publication, un protocole est décrit solide et complet pour le profilage de la transcription à partir de noyaux de cerveau de souris en réponse à la manipulation du comportement. Laprotocole est mise en évidence dans le cadre de l&#39;analyse de la dynamique de l&#39;expression des gènes dans le noyau accumbens suivant l&#39;expérience de la cocaïne aiguë. Suite à une défini dans l&#39;expérience in vivo, le tissu neural cible est disséqué; suivi par la purification de l&#39;ARN, la transcription inverse et l&#39;utilisation de matrices microfluidiques pour analyse qPCR complet de plusieurs gènes cibles. Ce protocole est axé sur une analyse complète (adressage 50-500 gènes) de limiter les quantités de matière première, tels que des échantillons de cerveau petites ou même des cellules individuelles. Le protocole est le plus avantageux pour l&#39;analyse en parallèle de plusieurs échantillons (par exemple, les cellules individuelles, l&#39;analyse dynamique suivante pharmaceutique, virale ou perturbations comportementales). Toutefois, le protocole pourrait également servir pour l&#39;assurance de la caractérisation et de la qualité des échantillons avant les études du génome entier par des puces ou RNAseq, ainsi que la validation des données obtenues à partir des études du génome entier.

La qualité des résultats obtenus par l&#39;application de ce protocole dépend essentiellement un certain nombre de paramètres. Planification expérimentale appropriée entraînera une perturbation minimale pour les souris expérimentales, telles que l&#39;expérience testée (dans cet exemple, que l&#39;exposition à la cocaïne) sera l&#39;expérience la plus dominante dans leur histoire récente, et donc se traduira par une transcription robuste et spécifique programme. figure 1 décrit le plan expérimental pour...

Ce manuscrit décrit un protocole qui applique un profilage complet pour l’analyse des programmes transcriptionnels induits dans des noyaux cérébraux spécifiques de rongeurs selon des paradigmes comportementaux. Cette approche est illustrée dans le contexte du profilage des gènes induits dans le noyau accumbens (NAc) de souris après une exposition aiguë à la cocaïne, à l’aide de puces microfluidiques de qPCR.

Analyse détaillée de la dynamique de transcription à partir d&#39;échantillons de cerveau après l&#39;expérience comportementale

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier la dynamique transcriptionnelle et les noyaux cérébraux spécifiques chez des souris après une expérience comportementale. Cela est réalisé en habituant d'abord les animaux et en enregistrant leur activité locomotrice après une injection de sérum physiologique. Une fois habitués, l'activité locomotrice est enregistrée après une dose unique de cocaïne, puis des échantillons sont prélevés dans le noyau accumbens et utilisés pour l'isolement de l'ARN et la préparation de l'ADNc.Une analyse de PCR quantitative est ensuite réalisée afin d'étudier l'expression génique induite par le comportement. En fin de compte, des résultats sont obtenus qui montrent la dynamique transcriptionnelle suivant une expérience à la cocaïne. Le protocole sera démontré par le Dr. Hatu, le responsable du laboratoire, Dum Muer, un étudiant diplômant du laboratoire, et Duran, un étudiant de licence du laboratoire. Pendant trois jours consécutifs, chaque souris est habituée aux manipulations et aux procédures d'injection. Les souris sont organisées en cages avant le début de l'expérience, de sorte qu'elles ne soient pas transférées entre cages par la suite et qu'elles ne soient jamais laissées en isolement prolongé.30 minutes avant le début des tests, toutes les cages d'essai doivent être transférées dans la salle de comportement afin de permettre aux animaux de s'acclimater à l'environnement. Administrer une injection intrapéritonéale de 250 microlitres de sérum physiologique ; immédiatement après l'injection, placer la souris dans une chambre de comportement pour surveiller son activité locomotrice pendant 15 minutes. La souris peut être placée dans la chambre de comportement pendant 20 minutes.Une activité surveillée entre la deuxième et la dix-septième minute. Répéter ces étapes à la même heure pendant les deux jours suivants. Le quatrième jour, administrer une injection unique de cocaïne ou de solution saline, selon le groupe, puis placer immédiatement la souris dans la chambre afin de surveiller l'activité motrice locale pendant 20 minutes à des intervalles de temps sélectionnés après l'exposition à la cocaïne, extraire le cerveau et le placer dans une solution de LCR glacée pendant une à deux minutes afin de le refroidir et de le rigidifier.Après avoir retiré le cervelet et absorbé le liquide excédentaire, collez le cerveau sur la platine d'un vibrotome, la partie rostrale orientée vers le haut. Remplissez la chambre avec du LCR glacé et découpez des sections de 200 microns jusqu'à ce que le noyau accumbens soit clairement identifié. Portez une attention particulière à la forme du corps calleux, à la localisation et à la forme de la commissure antérieure ainsi qu'aux ventricules pendant la coupe.Une fois la région correcte identifiée, découper deux sections de 400 micromètres à partir desquelles le noyau accumbens sera disséqué sous un stéréomicroscope. Utiliser une lame fine pour disséquer le noyau accumbens en le séparant des tranches. Quatre passages rapides de la lame dans la zone appropriée doivent permettre d'isoler immédiatement le tissu souhaité.Placer le tissu isolé dans 900 microlitres de réactif de lyse et conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction de l'ARN ; commencer par décongeler les tubes à 37 degrés Celsius puis homogénéiser. À l'aide d'une aiguille de 25 gauge, les premiers passages peuvent être difficiles et nécessitent de pousser le tissu contre la paroi du tube pour l'homogénéiser en petits morceaux. Pour garantir une homogénéisation adéquate, prélever le lysat au moyen d'une pipette et l'appliquer sur une colonne mini spin kaya shredder, puis centrifuger.Transférez le lysat dans un nouveau tube microcentrifuge et extrayez l'ARN conformément aux instructions du fabricant. Après la purification de l'ARN, une transcription inverse en ADNc est effectuée, ainsi qu'une préamplification spécifique de la cible à l'aide d'amorces dirigées contre le groupe de gènes choisi pour l'analyse. Ces procédures sont décrites dans la version textuelle du protocole.Des puces microfluidiques commerciales pour l'analyse complète par QPCR sont disponibles en format 48 par 48, permettant l'analyse de 48 échantillons avec 48 jeux de sondes, ou en format 96 par 96, dans lequel 96 échantillons sont analysés avec 96 sondes. Dans la plupart des cas, le choix de la puce dépend principalement du nombre d'échantillons analysés.Préparez d'abord le mélange d'échantillon selon la puce choisie pour l'expérience. Manipulez avec précaution le réactif de chargement d'échantillon contenant le colorant de liaison 20 XDNA. Agitez les solutions du mélange d'échantillon pendant au moins 20 secondes et centrifugez-les pendant au moins 30 secondes.Les réactions préparées peuvent être conservées pendant de courtes durées à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que la puce soit prête à être chargée. Ensuite, préparez le mélange d'essai, agitez soigneusement le mélange d'échantillon et centrifugez pour rassembler tous les composants. Comme indiqué précédemment, la puce IFC à réseau dynamique possède des entrées pour les échantillons et les essais, ainsi que des entrées spécifiées pour le fluide de la ligne de commande utilisé pour pressuriser les chambres microfluidiques.Tout d'abord, injectez le liquide de la ligne témoin dans chaque accumulateur de la puce. Ensuite, amorcez la puce en la plaçant dans le contrôleur IFC et en exécutant le script approprié. Une fois le script terminé, retirez la puce amorcée du contrôleur IFC et pipetez cinq microlitres de chaque test.Mélanger sur la puce. Ajouter cinq microlitres de chaque mélange d'échantillon dans leurs entrées et remettre la puce dans le contrôleur IFC à l'aide du logiciel du contrôleur IFC. Exécuter le script pour charger les échantillons et les tests sur la puce.Lorsque le script de mélange de charge est terminé, retirez la puce chargée du contrôleur IFC. Ensuite, placez la puce sur le thermocycleur et créez un nouveau cycle de puce incluant une analyse de courbe de fusion. À l’aide du logiciel du thermocycleur, assurez-vous que les chambres de réaction sont correctement reconnues et laissez la réaction s’achever complètement.Une augmentation de l'activité locomotrice était évidente après une injection aiguë unique de cocaïne. Dans cette coupe coronale, de larges lignes blanches indiquaient l'emplacement des incisions réalisées pour délimiter les frontières du noyau accumbens. Pendant la dissection, les courbes d'amplification des amorces dirigées contre les CFO et la phos B démontrent que les paires d'amorces amplifient leur transcrit cible avec une efficacité d'environ 100 %.À chaque cycle, les résultats montrent que l'expression induite par la cocaïne des CFO et de la phos B dans le noyau accumbens était maximale une et deux heures après l'exposition. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage de nouvelle génération peuvent être réalisées afin d'identifier de nouveaux transcrits non caractérisés.

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