Analyse détaillée de la dynamique de transcription à partir d'échantillons de cerveau après l'expérience comportementale

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier la dynamique transcriptionnelle et les noyaux cérébraux spécifiques chez des souris après une expérience comportementale. Cela est réalisé en habituant d'abord les animaux et en enregistrant leur activité locomotrice après une injection de sérum physiologique. Une fois habitués, l'activité locomotrice est enregistrée après une dose unique de cocaïne, puis des échantillons sont prélevés dans le noyau accumbens et utilisés pour l'isolement de l'ARN et la préparation de l'ADNc.

Une analyse de PCR quantitative est ensuite réalisée afin d'étudier l'expression génique induite par le comportement. En fin de compte, des résultats sont obtenus qui montrent la dynamique transcriptionnelle suivant une expérience à la cocaïne. Le protocole sera démontré par le Dr. Hatu, le responsable du laboratoire, Dum Muer, un étudiant diplômant du laboratoire, et Duran, un étudiant de licence du laboratoire. Pendant trois jours consécutifs, chaque souris est habituée aux manipulations et aux procédures d'injection. Les souris sont organisées en cages avant le début de l'expérience, de sorte qu'elles ne soient pas transférées entre cages par la suite et qu'elles ne soient jamais laissées en isolement prolongé.

30 minutes avant le début des tests, toutes les cages d'essai doivent être transférées dans la salle de comportement afin de permettre aux animaux de s'acclimater à l'environnement. Administrer une injection intrapéritonéale de 250 microlitres de sérum physiologique ; immédiatement après l'injection, placer la souris dans une chambre de comportement pour surveiller son activité locomotrice pendant 15 minutes. La souris peut être placée dans la chambre de comportement pendant 20 minutes.

Une activité surveillée entre la deuxième et la dix-septième minute. Répéter ces étapes à la même heure pendant les deux jours suivants. Le quatrième jour, administrer une injection unique de cocaïne ou de solution saline, selon le groupe, puis placer immédiatement la souris dans la chambre afin de surveiller l'activité motrice locale pendant 20 minutes à des intervalles de temps sélectionnés après l'exposition à la cocaïne, extraire le cerveau et le placer dans une solution de LCR glacée pendant une à deux minutes afin de le refroidir et de le rigidifier.

Après avoir retiré le cervelet et absorbé le liquide excédentaire, collez le cerveau sur la platine d'un vibrotome, la partie rostrale orientée vers le haut. Remplissez la chambre avec du LCR glacé et découpez des sections de 200 microns jusqu'à ce que le noyau accumbens soit clairement identifié. Portez une attention particulière à la forme du corps calleux, à la localisation et à la forme de la commissure antérieure ainsi qu'aux ventricules pendant la coupe.

Une fois la région correcte identifiée, découper deux sections de 400 micromètres à partir desquelles le noyau accumbens sera disséqué sous un stéréomicroscope. Utiliser une lame fine pour disséquer le noyau accumbens en le séparant des tranches. Quatre passages rapides de la lame dans la zone appropriée doivent permettre d'isoler immédiatement le tissu souhaité.

Placer le tissu isolé dans 900 microlitres de réactif de lyse et conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction de l'ARN ; commencer par décongeler les tubes à 37 degrés Celsius puis homogénéiser. À l'aide d'une aiguille de 25 gauge, les premiers passages peuvent être difficiles et nécessitent de pousser le tissu contre la paroi du tube pour l'homogénéiser en petits morceaux. Pour garantir une homogénéisation adéquate, prélever le lysat au moyen d'une pipette et l'appliquer sur une colonne mini spin kaya shredder, puis centrifuger.

Transférez le lysat dans un nouveau tube microcentrifuge et extrayez l'ARN conformément aux instructions du fabricant. Après la purification de l'ARN, une transcription inverse en ADNc est effectuée, ainsi qu'une préamplification spécifique de la cible à l'aide d'amorces dirigées contre le groupe de gènes choisi pour l'analyse. Ces procédures sont décrites dans la version textuelle du protocole.

Des puces microfluidiques commerciales pour l'analyse complète par QPCR sont disponibles en format 48 par 48, permettant l'analyse de 48 échantillons avec 48 jeux de sondes, ou en format 96 par 96, dans lequel 96 échantillons sont analysés avec 96 sondes. Dans la plupart des cas, le choix de la puce dépend principalement du nombre d'échantillons analysés.

Préparez d'abord le mélange d'échantillon selon la puce choisie pour l'expérience. Manipulez avec précaution le réactif de chargement d'échantillon contenant le colorant de liaison 20 XDNA. Agitez les solutions du mélange d'échantillon pendant au moins 20 secondes et centrifugez-les pendant au moins 30 secondes.

Les réactions préparées peuvent être conservées pendant de courtes durées à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que la puce soit prête à être chargée. Ensuite, préparez le mélange d'essai, agitez soigneusement le mélange d'échantillon et centrifugez pour rassembler tous les composants. Comme indiqué précédemment, la puce IFC à réseau dynamique possède des entrées pour les échantillons et les essais, ainsi que des entrées spécifiées pour le fluide de la ligne de commande utilisé pour pressuriser les chambres microfluidiques.

Tout d'abord, injectez le liquide de la ligne témoin dans chaque accumulateur de la puce. Ensuite, amorcez la puce en la plaçant dans le contrôleur IFC et en exécutant le script approprié. Une fois le script terminé, retirez la puce amorcée du contrôleur IFC et pipetez cinq microlitres de chaque test.

Mélanger sur la puce. Ajouter cinq microlitres de chaque mélange d'échantillon dans leurs entrées et remettre la puce dans le contrôleur IFC à l'aide du logiciel du contrôleur IFC. Exécuter le script pour charger les échantillons et les tests sur la puce.

Lorsque le script de mélange de charge est terminé, retirez la puce chargée du contrôleur IFC. Ensuite, placez la puce sur le thermocycleur et créez un nouveau cycle de puce incluant une analyse de courbe de fusion. À l’aide du logiciel du thermocycleur, assurez-vous que les chambres de réaction sont correctement reconnues et laissez la réaction s’achever complètement.

Une augmentation de l'activité locomotrice était évidente après une injection aiguë unique de cocaïne. Dans cette coupe coronale, de larges lignes blanches indiquaient l'emplacement des incisions réalisées pour délimiter les frontières du noyau accumbens. Pendant la dissection, les courbes d'amplification des amorces dirigées contre les CFO et la phos B démontrent que les paires d'amorces amplifient leur transcrit cible avec une efficacité d'environ 100 %.

À chaque cycle, les résultats montrent que l'expression induite par la cocaïne des CFO et de la phos B dans le noyau accumbens était maximale une et deux heures après l'exposition. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage de nouvelle génération peuvent être réalisées afin d'identifier de nouveaux transcrits non caractérisés.