Name: 测量渗透水渗透系数（P F）球形细胞：隔离植物原生质体为例。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 学习测量植物原生质体渗透水渗透系数（P_f）的方法，以研究水通道蛋白功能。该方法通过酶解法分离原生质体，结合显微成像与数值分析，为细胞水分运输机制研究提供可靠技术框架。

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本工作获得了比利时科学研究中心（FNRS）基金、比利时科学政策跨大学研究吸引计划以及比利时法语区共同体制定的协同研究行动计划对 FC 的资助，以及以色列科学基金会耶路撒冷（ISF）对 MM（资助号 #1311/12）和对 NM（资助号 #1312/12）的资助。

1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制等渗（600 mOsm）和低渗（500 mOsm）溶液，其中含有 10 mM KCl、1 mM CaCl2 和 8 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES），pH 5.7，并用适当量的D-山梨醇调节渗透压：等渗溶液中加入 540 mM，低渗溶液中加入 440 mM。使用渗透压计验证溶液渗透压（应在目标值的 ±3% 范围内）。</li>
	<li>制备“酶解混合物”的干粉储备品，包含以下组分：0.55 g 纤维素酶、0.1 g 果胶酶、0.33 g 聚乙烯吡咯烷酮 K 30、0.33 g 牛血清白蛋白（BSA）（见下文表1），将干粉通过涡旋混合，分装为每份 5.7 mg，于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 拟南芥叶肉原生质体的分离
<ol>
	<li>准备一个直径10 cm的培养皿，加入约6滴（每滴约30 µl）等渗溶液。</li>
	<li>剥离拟南芥叶片的远轴面（下表面）表皮，将去表皮的叶片切成约4 × 4 mm2的小片，然后将小片远轴面朝下放置于等渗溶液液滴中，使组织接触液滴表面。</li>
	<li>在1.5 ml离心管中，将5.7 mg酶混合物溶于165 µl等渗溶液（质量浓度为3.3% w/w），用移液枪轻柔吹打约1分钟至完全溶解，并在同一个培养皿中加入数滴类似的酶解溶液。</li>
	<li>将叶片小片转移至酶解溶液液滴上，用封口膜将培养皿密封一圈后盖紧，于28 °C水浴中孵育20分钟，使培养皿漂浮在水浴中。</li>
	<li>向培养皿中再加入数滴等渗溶液（每滴酶解液对应加入2滴）。将每一片叶片依次转移至新的等渗溶液液滴中，再转移到第二个液滴中（以洗去残留的酶解液）。用镊子夹住叶片边缘，在第二个液滴中轻轻振荡（如同泡茶包），以释放原生质体。用剪去尖端的100 µl移液枪头收集含有原生质体的液滴，并转移至1.5 ml离心管中。</li>
</ol>
3. 低渗应激实验：拟南芥叶肉细胞膨胀
<ol>
	<li>准备灌流系统（图1A），将等渗溶液注入一个储液柱，低渗溶液注入另一个储液柱。打开阀门，让部分溶液流动（先低渗溶液，后等渗溶液），使液体充满管道直至入口歧管（图1B）。确保管路中无残留气泡，然后关闭阀门。</li>
	<li>使用硅脂（表1）将盖玻片密封，作为有机玻璃载片内腔室的底部（图1B；另见 图1C 中腔室的示意图）。为了使腔室底部（盖玻片在硅脂环内朝上暴露的表面）对原生质体具有“粘附性”，可用带正电荷的硫酸鱼精蛋白（1% 水溶液；表1）或聚-L-赖氨酸（0.1% 水溶液；表1）进行包被。用移液枪头将该“胶水”均匀涂布于盖玻片表面，静置1–2分钟，用等渗溶液冲洗3–4次，并甩去残留液体。</li>
	<li>用等渗溶液充满腔室。然后，用剪去尖端的移液枪头向腔室内加入一滴含有原生质体的溶液，静置3–4分钟，使原生质体沉降。用透明盖板覆盖腔室（图1D、图1E），使其接触液面（避免在盖板下截留气泡）。</li>
	<li>将载片（轻放！）置于倒置显微镜载物台上，连接至灌流系统和泵（注意防止管路中产生气泡！），开启等渗溶液流动，以1 ml/min进行持续灌流（流速可加快，最高至4 ml/min）。</li>
	<li>为记录体积变化，使用配备20倍物镜的倒置显微镜，并连接CCD视频相机至PC计算机。使用ImageJ软件中的“CMU 1394 Camera Driver”插件（参见“特定材料表”中这两个软件的下载地址），以每秒1帧（1 Hz）的速度，对选定的静止原生质体（可能已贴附于底部的细胞）录制60秒的视频。录制开始时先用等渗溶液冲洗15秒（作为基线），随后切换至低渗溶液持续45秒（从灌流开始总计60秒）。将视频保存为TIF格式。注意：应选择满足以下标准的视野，即包含尽可能多的细胞：细胞呈球形，且在其最大周长处具有清晰聚焦的轮廓（图2A）。</li>
</ol>
4. 使用 ImageJ 分析细胞体积变化
注意：为了分析细胞膨胀过程中的一系列图像，可使用 ImageJ 软件中的“Image Explorer”和“Protoplast Analyzer”插件（由 Xavier Draye 编写）14。从选定原生质体的第一个时间点开始，“Protoplast Analyzer”插件将自动检测原生质体的边缘（轮廓），并计算实验过程中其面积随时间的变化（这些插件可随下方所述的 PfFit 分析程序一同获取）。
<ol>
	<li>启动 ImageJ。要打开视频，请在 ImageJ 面板上点击“File”，然后依次点击下拉菜单中的“Import”，再点击“Image Explorer”。选中目标视频后右键点击，然后左键点击“Protoplast Analyzer”。通过视频底部的滑块浏览视频，找出在整个实验过程中基本保持静止的原生质体——这些原生质体将被分析。返回第一帧图像，使用鼠标在 ImageJ 绘图工具中选择圆形，并围绕选定的原生质体绘制圆圈（图 2B），然后点击弹出的“Detection parameters”表格中的“OK”按钮。</li>
	<li>要启动原生质体检测算法，请在原生质体图像顶部面板点击“Local”，然后在下拉菜单中点击“Process”。在整个视频中检查绿色圆圈是否准确包围所选原生质体（图 2C）。将“Result”结果保存为 Excel 文件。退出 ImageJ。注意：如果出现红色圆点（表示轮廓拟合不佳，通常由于图像对比度差所致），请使用不同参数重新运行。</li>
	<li>为了分离属于每个细胞的数据线（当同时分析两个或多个细胞时，由于分析是逐帧进行的，数据会相互交织），在 Excel 中按保存数据中的细胞编号列（“object”）对数据进行排序。</li>
	<li>为确定将像素转换为微米（µm）的换算系数，以获得 Pf 的真实数值，请使用相同的 20X 显微镜物镜拍摄一张显微测微尺的图像。在测微尺图像上使用 ImageJ 绘图工具中的直线工具画一条线，并在 ImageJ 主面板底部读取对应于测微尺长度的像素数。将 Excel 文件中的任意像素面积值转换为 µm2。将每个细胞的面积随时间变化过程（分别保存）导出为纯文本文件（仅包含两列数值）。注意：此文件将作为体积拟合程序“PfFit”的输入文件。</li>
</ol>
5. 使用 ImageJ 和 Matlab 程序 PfFit 对实验腔室内渗透压变化速率进行建模
<ol>
	<li>加入2 mg二甲苯青表1，加入到100 ml等渗溶液中（制成“指示染料”）。</li>
	<li>准备好灌注系统（如3.1所述），分别装入指示染料和未染色的低渗溶液。</li>
	<li>用硅脂将盖玻片密封至亚克力腔室底部，然后轻轻将指示染料加入腔室内，再用盖玻片覆盖（方法同原生质体处理），最后将腔室置于显微镜载物台上。</li>
	<li>将灌流室连接至灌流系统和泵，并开启指示染料的流动，以维持1 ml/min的恒定灌流。</li>
	<li>以1 Hz的速率录制一段60秒的视频。开始时用指示剂染料记录15秒，随后切换至低渗溶液持续45秒。停止拍摄。用指示剂染料冲洗至少30秒，然后开始下一段录像。重复5至6次，保存所有视频文件。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件分析指示剂染料透射率的视频图像，以获得透射率变化的平均时间过程。
	<ol>
		<li>启动 ImageJ，点击“文件”，然后点击“打开”，并浏览选择视频文件。对于每个视频，在画面任意位置绘制一个 10 像素宽的垂直矩形st 点击 ImageJ 主界面中的“Image”，然后在下拉菜单中点击“Crop”。</li>
		<li>要将60帧（60秒视频）图像排列成一行，请再次点击“Image”，然后依次在展开的下拉菜单中选择：“Stacks”和“Make Montage”（列数60，行数1）。在整个图像行的任意位置绘制一个高1像素的水平矩形，然后点击ImageJ主面板中的“Analyze”，接着在下拉菜单中点击“plot profile”。注意：“Plot of Montage”窗口将出现（图中未显示），并可通过其菜单打开透射率数据列表。视频中的每一帧图像在此列表中由其10像素宽矩形区域产生的10个透射率值表示，因此“时间基线”（图像序列编号）长度是原来的10倍。</li>
		<li>将透射率数据列表（每个视频对应一个列表）复制到 Excel 文件中。对来自多个指示剂染料灌注视频的透射率时间过程进行平均。通过将图像序列号乘以 0.1 生成实际时间轴。将平均后的时间过程（两列数据）保存为文本文件。注意：在平均之前，可根据需要绘制各个时间过程曲线，以排除异常情况。确保视频包含至少 5 秒指示剂染料稳态透射率的最终阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动 Matlab 拟合程序 Pf拟合（“指示符拟合”面板， 图3）以计算渗透压时间过程的各个参数。注意：根据已知的浴液初始和最终浓度，假设溶液渗透浓度的变化过程与指示染料透射率所计算出的染料浓度变化过程具有相同的动力学特征，由此推算出渗透浓度随时间变化的过程。PfFit 是一款可免费使用的程序。您可从以下网址下载 ‘PfFit_Installer_web.exe’：Pf《Fit 用户指南》包含详细的解释和定义，可通过 JoVE 作为补充文件获取，有助于用户熟悉 Pf拟合程序</li>
	<li>在“指示剂拟合”面板中，导入指示剂染料透射率的平均时间过程数据（“指示剂数据文件”）， 图3A）并手动输入当前实验参数，以及描述指示剂染料浓度时间过程的参数“width”和“t_half”的初始估计值图3B. 单击“Run”以查看指示剂染料浓度随时间变化曲线的图表（实际数据与拟合结果） 图4A)，以及模拟（计算）的浴液渗透压（图4B）。注意：数据拟合良好至关重要（建议：从图中所示的数值开始） 图3).</li>
</ol>
6. 使用 Matlab 拟合程序 PfFit 确定 Pf
注意：除了关于原生质体作为真正且理想的渗透计行为的基本假设外11，Pf 的测定还基于以下假设：Pf 可随时间变化，这种 Pf 的动态变化是细胞体积变化时间进程的基础，并且可用三个参数来描述该过程：Pfi（Pf 的初始值）、SlopePf（Pf 线性变化的速率）和 Delay（从浴液渗透浓度改变开始到细胞体积变化开始之间的时间间隔）。可测试不同模型，包括这些参数及其取值的不同组合，包括参数取零值的情况11。PfFit 通过计算，寻找这些参数的最佳组合，以最真实地重现实验测得的细胞体积变化时间进程11，而该时间进程是根据导入的细胞轮廓面积序列计算得出的（另请参见补充材料《PfFit 用户指南》）。
<ol>
	<li>切换到“体积拟合”面板（图5）。选择导入区域数据文件（即分析的原生质体“面积”随时间变化的文本文件，图5A）。选择“最后指示剂拟合”作为参数来源（图5B；其他选项参见《PfFit 用户指南》）。注意：这些参数（图5D）随后将用于在体积拟合过程中重建浴液中渗透剂的变化。</li>
	<li>在“体积拟合”面板中（图5C），初始化Pf参数（填写Pf、SlopePf和Delay的初始估计值）：建议初始值分别设为1、1和30。选择模型“Class”（建议从II类开始，并勾选全部三个参数以进行拟合）。点击“Run”，然后目视检查中间结果图（图5E），根据需要调整Delay参数和记录长度。</li>
	<li>检查结果图（图6）以评估拟合质量并记录拟合误差。将初始化参数分别改变数倍后重新点击“Run”。注意：若程序卡住，不必灰心——只需重新启动程序即可！</li>
	<li>重复此过程多次，使用不同的初始化参数组合，以获得最低的拟合误差值为目标。</li>
	<li>直接从屏幕复制拟合结果列表，或在PfFit生成的“_FIT_Vol_Results.txt”文件中查找结果。</li>
</ol>

<ol><li>Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+multifunctional+water+and+solute+channels+with+expanding+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles.</a> Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).</li>
<li>Maurel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+Novel+functions+and+regulation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Letters%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties.</a> Febs Letters. 581, 2227(2007).</li>
<li>Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+aquaporins%3A+Membrane+channels+with+multiple+integrated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 595(2008).</li>
<li>Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+aquaporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Of+The+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant aquaporin activity.</a> Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).</li>
<li>Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+water+permeability+of+isolated+protoplasts.+Modifications+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development.</a> Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).</li>
<li>Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+aquaporin+levels+among+cell+types+of+radish+and+measurement+of+osmotic+water+permeability+of+individual+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts.</a> Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).</li>
<li>Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundle-sheath+cell+regulation+of+xylem-mesophyll+water+transport+via+aquaporins+under+drought+stress%3A+a+target+of+xylem-borne+ABA%3F%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?</a> The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).</li>
<li>Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+quantification+of+plasma+membrane+aquaporin+expression+in+maize+primary+root%3A+A+clue+to+understanding+their+role+as+cellular+plumbers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers.</a> Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).</li>
<li>Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+pattern+of+plasma+membrane+aquaporins+in+maize+leaf+highlights+their+role+in+hydraulic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation.</a> Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).</li>
<li>Besserer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+maize+plasma+membrane+aquaporin+trafficking+and+activity+by+the+SNARE+SYP121%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121.</a> The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).</li>
<li>Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+osmotic+water+permeability+of+protoplast+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane.</a> Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).</li>
<li>Moshelion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+water+permeability+and+aquaporin+expression+increase+during+growth+of+maize+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells.</a> Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).</li>
<li>Sade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+plant+stress+tolerance+and+yield+production%3A+is+the+tonoplast+aquaporin+SlTIP2%3B2+a+key+to+isohydric+to+anisohydric+conversion%3F%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?</a> New Phytologist. 181, 651-661 (2009).</li>
<li>Volkov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+permeability+differs+between+growing+and+non-growing+barley+leaf+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues.</a> J. Exp. Bot. 58, 377(2007).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).</li>
<li>Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+localisation+and+electrophysiological+characterisation+of+ion+channels+heterologously+expressed+in+a+plant+context%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context.</a> Plant Methods. 19, (2005).</li>
<li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Recombinant+Type+I+Collagen+Produced+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants.</a> Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

此处描述了一种简单且高效的测定P的方法f 分离植物原生质体的方法，原则上也适用于其他球形细胞， 例如，非洲爪蟾卵母细胞11. 该方法基于测量Pf 在细胞受到渗透压刺激时。然而，与其他基于该方法的技术相比，溶液的更换 即渗透压的变化并非瞬时完成，而是在持续灌流等渗溶液以建立细胞基线体积的过程中逐渐发生。此外，该方法不使用负压移液管，因此可最大程度减少对原生质体的干扰。
本文所述方法可用于分析来自不同植物或组织的多种原生质体。然而，由于涉及相关计算，仅能分析球形细胞。此外，原生质体的酶解分离过程及溶液的渗透压需根据待测细胞类型进行调整（例如，番茄叶肉原生质体的酶解分离过程约需一小时，明显长于拟南芥原生质体的分离时间）。
根据本方案分离拟南芥叶肉原生质体，操作简单、快速且高效，可获得大量原生质体。尤其值得注意的是，结合其较低的基础渗透水导率（Pf）水平和高转化效率（图8），使其...

水分在细胞膜上的吸收和流动是植物在细胞水平和整体植株水平生存的基本需求。在细胞水平上，水通道蛋白（AQPs）在调控细胞膜渗透性水导系数（Pf）方面起着关键作用1-3。
迄今为止，已有多种方法被用于测量内源性Pf 来自不同植物器官的原生质体即 根、叶肉、内皮层 等等，由 Chaumont 审阅 等 4）。测量P的一种方法是f 是将原生质体暴露于渗透压刺激下，并监测其体积变化的初始速率（即，体积变化早期线性阶段的斜率）。此前已有两种基于该方法的实验技术被报道，二者均基于溶液的瞬时交换。第一种方法是利用负压微吸管固定原生质体，并切换溶液流动5 使用移液枪将原生质体从一种溶液转移至另一种溶液的第二个步骤6这些微吸管吸吮和微吸管转移方法虽可在快速溶液交换刚开始时进行图像采集（以捕捉体积变化的早期线性阶段），但可能对原生质体造成物理应力，且需要专用设备和熟练的显微操作技术。
本文所述方法可最大限度减少对细胞的干扰，无需显微操作，并且在浴液灌注非瞬时完成的情况下仍可测定Pf。
酶消化后，原生质体浸没在等渗溶液中，通过电荷相互作用固定在有机玻璃（又称莱克塞尔或有机玻璃）腔室的盖玻片-玻璃底部上。随后，在持续灌流过程中，等渗溶液被低渗溶液冲洗置换，从而对原生质体施加低渗刺激。原生质体的膨胀过程通过视频记录，然后结合灌流过程的时间变化和细胞膨胀的时间过程，利用图像处理和曲线拟合方法确定渗透系数（Pf）。
该方法的优点在于实验效率高，即可在单次检测中同时监测多个细胞，且无需特殊设备或特定的显微操作技能。该方法具有多种应用可能。例如，可测定来自不同组织和植物的多种细胞的天然渗透水通道系数Pf，如拟南芥叶片的叶肉细胞和维管束鞘细胞7、玉米叶片叶肉细胞或根皮层细胞8-10，以及悬浮培养细胞11,12。此外，还可测定球形动物细胞（如卵母细胞）的Pf11。另一个应用实例是通过在原生质体中瞬时表达水通道蛋白（AQP）基因（或其他可能影响AQP的基因，例如激酶基因），来检测这些基因对Pf的贡献；例如，通过PEG转化法在拟南芥叶肉原生质体中表达番茄水通道蛋白SlTIP2;2，并测定与SlTIP2;2相关的Pf13。最后，还可研究向溶液中添加的不同分子或物质（如药物、激素等）对Pf的影响，例如AQP抑制剂HgCl2的作用7。
以下方案描述了拟南芥叶肉细胞原生质体的分离及其渗透系数（Pf）的测定。

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247-1</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.chemimpex.com/&quot;&gt;http://www.chemimpex.com&lt;/a&gt;&lt;研究水通道蛋白（AQP）的调控机制对于理解细胞水平和整体植物水平的水分关系至关重要。本文介绍了一种简单且高效的测定植物原生质体渗透水通透系数（Pf）的方法，原则上也可适用于其他球形细胞，如非洲爪蟾卵母细胞。该实验的第一步是通过酶解法从目标植物组织中分离原生质体，并将其置于含有适当等渗溶液的样品室中。第二步为渗透冲击实验：将固定在样品室底部的原生质体先用等渗溶液持续灌流，随后切换为低渗溶液进行灌流，同时对细胞肿胀过程进行录像。第三步是对图像进行离线处理，获得细胞体积变化数据，并利用Matlab编写的曲线拟合程序（“PfFit”），将体积变化的时间进程与灌流液渗透压变化的时间进程相关联，从而计算出Pf值。&gt; 任何来源，分析纯</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>11718006</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.merck.com/&quot;&gt;http://www.merck.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt; 任何来源，分析纯</td></tr><tr><td>2-(N-吗啉)乙磺酸 (MES)</td><td>Sigma</td><td>15152002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com&lt;研究水通道蛋白（AQP）的调控机制对于理解细胞水平和整体植物水平的水分关系至关重要。本文介绍了一种简单且高效的测定植物原生质体渗透水导系数（Pf）的方法，该方法原则上也可适用于其他球形细胞，如非洲爪蟾卵母细胞。实验的第一步是通过酶解法从目标植物组织中分离原生质体，并将其置于含有适当等渗溶液的观察室中。第二步为渗透冲击实验：将贴附在观察室底部的原生质体首先用等渗溶液持续灌流，随后切换为低渗溶液进行灌流，同时对细胞膨胀过程进行录像。第三步是对图像进行离线处理，获得细胞体积变化数据，并利用Matlab编写的曲线拟合程序（“PfFit”）将体积变化的时间进程与灌流液渗透压变化的时间进程相关联，从而计算出Pf值。&gt; 任何来源，分析纯级</td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma</td><td>18032003</td><td>http://www.sigmaaldrich.com&lt;br/&gt; 任何来源，分析纯级</td></tr><tr><td>纤维素酶</td><td>沃辛顿，新泽西州莱克伍德，美国</td><td>LS002603</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.worthingtonbiochem.com/&quot;&gt;http://www.worthingtonbiochem.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>果胶酶</td><td>Karlan,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 美国亚利桑那州菲尼克斯</td><td>8006</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.karlan.com/&quot;&gt;http://www.karlan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮 K 30 (PVP)</td><td>Sigma</td><td>81420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;https://my.labguru.com/catalog/materials/216&quot;&gt;牛血清白蛋白（BSA）&lt;/a&gt;</td><td>Sigma</td><td>A9418-5G</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich游戏副本&quot;&gt;http://www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Sigma</td><td>P4380</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>硅基真空润滑脂，高粘度</td><td>默克</td><td>107921</td><td>&lt;a href=&quot;https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;amp;attachments=CoA&quot;&gt;https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;&attachments=CoA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td>Eclipse TS100/TS100F</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nikoninstruments.com/&quot;&gt;http://www.nikoninstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>BIO-RAD</td><td>EP-1 Econo&amp;nbsp;泵</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/&quot;&gt;http://www.bio-rad.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>灰度数字相机</td><td>斯康公司</td><td>CFW-1308M</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scioncorp.com/&quot;&gt;http://www.scioncorp.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CMU 1394 相机驱动程序&amp;rsquo; ImageJ 插件</td><td>卡内基梅隆</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html&quot;&gt;http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html&lt;/a&gt;&lt;研究AQP调控机制对于理解细胞水平和整个植物水平的水分关系至关重要。本文介绍了一种测定植物原生质体渗透水通透系数（Pf）的简单且高效的方法，原则上也可适用于其他球形细胞，如蛙卵母细胞。该实验的第一步是通过酶解法从目标植物组织中分离原生质体，并将其置于含有适当等渗溶液的腔室中。第二步为渗透冲击实验：将固定在腔室底部的原生质体首先用等渗溶液持续灌流，随后切换为低渗溶液进行灌流，同时对细胞肿胀过程进行录像。第三步是对图像进行离线处理，获得体积变化数据，并利用Matlab编写的曲线拟合程序（“PfFit”），将体积变化的时间进程与灌流液渗透压变化的时间进程进行拟合，从而计算出Pf值。&gt; 免费软件</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/&quot;&gt;http://rsb.info.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;&lt;研究水通道蛋白（AQP）的调控机制对于理解植物细胞及整体水平上的水分关系至关重要。本文介绍了一种简单且高效的测定植物原生质体渗透水导系数（Pf）的方法，该方法原则上也可适用于其他球形细胞，如非洲爪蟾卵母细胞。实验的第一步是通过酶解法从目标植物组织中分离原生质体，并将其置于含有适当等渗溶液的观察室中。第二步为渗透冲击实验：将固定在观察室底部的原生质体先用等渗溶液持续灌流，随后切换为低渗溶液进行灌流。细胞的肿胀过程通过视频记录。第三步，离线处理图像以获得细胞体积变化数据，并利用Matlab编写的曲线拟合程序（“PfFit”）将体积变化的时间进程与灌流液渗透压变化的时间进程进行拟合，从而计算出Pf值。&gt; 免费软件</td></tr><tr><td>Econo 梯度泵配件套装</td><td>BIO-RAD</td><td>731-9006</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/&quot;&gt;http://www.bio-rad.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>连接器，多通管</td><td>DirectMed</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S&quot;&gt;http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>滴定管输注装置（柱）</td><td>Welford</td><td>IF-BR-001</td><td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td></tr><tr><td>管路</td><td>TYGON</td><td>R-3603</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.usplastic.com/&quot;&gt;http://www.usplastic.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>3M 包装胶带 1&#039;&#039;，清晰</td><td>英国维京工业</td><td>VKMONO25</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8&quot;&gt;http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8&lt;/a&gt;&lt;br/&gt; 任何透明胶带（如 Scotch 胶带等）均可使用</td></tr></tbody></table>

测量球形细胞的渗透水渗透系数（pf）：以分离的植物原生质体为例

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

研究水通道蛋白（AQP）的调控机制对于理解细胞水平和整体植物水平的水分关系至关重要。本文介绍一种简单且高效的测定植物原生质体渗透水导系数（Pf）的方法，原则上也可适用于其他球形细胞，如爪蟾卵母细胞。该实验的第一步是通过酶解法从目标植物组织中分离原生质体，并将其置于含有适当等渗溶液的样品室中。第二步为渗透冲击实验：将固定在样品室底部的原生质体首先用等渗溶液持续灌流，随后切换为低渗溶液进行灌流，同时对细胞膨胀过程进行录像记录。第三步为离线图像处理，通过分析图像获得细胞体积变化，并利用Matlab编写的曲线拟合程序（“PfFit”）将体积变化的时间进程与灌流液渗透压变化的时间进程进行关联，从而计算出Pf值。

为了测定渗透水通道蛋白（Pf）并比较不同水通道蛋白（AQPs）的活性，采用拟南芥叶片的叶肉原生质体。这些原生质体具有较低的基础（背景）Pf水平7，可作为功能性表达系统，实现可重复的Pf测量。
从6周龄拟南芥植株的成熟叶片中分离原生质体，并利用PEG转化法分别瞬时表达三个含有拟南芥（AtPIP2;1）和玉米（ZmPIP1;2 和 ZmPIP2;4）水通道蛋白基因的基因构建体15。假设将大量质粒导入细胞时转化事件是同时发生的，且不依赖于质粒的种类；此外，基于先前在其他植物系统中报道的两个质粒在同一细胞内同步瞬时表达的成功率可达100%的研究结果15,16，实验中同时共转化了一个编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的载体，以标记已转化的原生质体（图7）。
对于 Pf 实验，原生质体被置于实验腔室中...

测量细胞的渗透水通透系数（Pf）有助于理解水通道蛋白（AQPs）的调控机制。本文所述的球形植物细胞原生质体中Pf的测定，包括原生质体的分离以及在恒定灌流条件下，通过渗透冲击引起的原生质体初始体积变化速率的数值分析。

测量球形细胞的渗透水渗透系数（Pf）：以分离的植物原生质体为例

研究水通道蛋白（AQP）调控机制对于理解细胞水平和整体植株水平的水分关系至关重要。本文介绍了……

以下实验的总体目标是通过测定植物原生质体的渗透水通透系数（即PF值），来了解水通道蛋白的功能。剪取一片不含轴向表皮的叶片组织，将其置于等渗溶液中。将组织片转移至酶解溶液中，在28摄氏度下孵育20分钟，随后转移至新鲜的等渗溶液中。接下来，用剪去尖端的吸头收集含有原生质体的溶液。第二步，准备一个实验用样品室。使用硅脂将盖玻片固定在载玻片底部。然后用带正电荷的胶水涂覆腔室底部，并向腔室内加入等渗溶液。将分离得到的原生质体加入腔室中，再将腔室轻柔地放置在显微镜载物台上。随后，将原生质体暴露于低渗溶液中，同时记录视频以捕捉其膨胀的时间过程。接下来，通过包含曲线拟合程序的软件对膨胀的时间过程进行数值分析，以根据数值分析结果确定每个原生质体的渗透系数（PF），从而揭示例如不同水通道蛋白基因表达所引起的PF差异。该方法有助于回答细胞膜生理学领域中的关键问题，例如水通道蛋白功能的调控机制。尽管该方法可提供有关天然或经遗传修饰植物中水通透性的深入见解。它还可应用于其他系统，例如暴露的感兴趣起始位点。在开始此操作之前，需准备好所需的等渗和高渗溶液，并验证其渗透压。使用渗透压计时，每种溶液的渗透压必须在目标值的3%范围内。用约六滴等渗溶液填充一个10厘米的培养皿。剥离ABBA密封膜或取兔眼叶表皮，并将剥离的叶片切成约4毫米×4毫米的正方形小片。将小片放置在等渗溶液液滴上，使暴露的轴向侧面朝下并与溶液接触。接下来，将5.7毫克酶混合物溶解于1.5毫升离心管中的165微升等渗溶液中，用移液器轻轻吹打约1分钟，直至完全溶解。在同一个培养皿中加入数滴类似的酶解溶液。将叶片小块转移至酶解溶液液滴中。盖上培养皿，并用一圈封口膜密封盖子。将培养皿置于28摄氏度的水浴中漂浮孵育20分钟。20分钟后，用镊子向培养皿中再加入数滴等渗溶液。用镊子夹住每片叶片的边缘，将其转移至新的等渗溶液液滴中，然后依次转移到第二个液滴中。用剪去尖端的100微升移液器吸头在第二个液滴中轻轻晃动叶片组织，以释放原生质体。将含有原生质体的液滴收集至1.5毫升离心管中。通过将等渗溶液加入一根柱中，低渗溶液加入另一根柱中，以准备灌流系统。打开阀门，使部分低渗溶液流过管道，直至充满至入口歧管。确认无残留气泡后，关闭阀门。对等渗溶液重复上述步骤。使用硅脂密封盖玻片，以在亚克力载玻片内形成一个腔室的底部，使腔室底部具有黏性以便原生质体附着；可用带正电荷的鱼精蛋白硫酸盐或聚-L-赖氨酸对盖玻片进行包被。用移液器吸头将这种黏附剂均匀涂布于盖玻片表面。等待一到两分钟。用等渗溶液冲洗三到四次，并将残留的溶液甩去。用等渗溶液注满腔室。然后用剪去尖端的移液枪头吸取一滴含有原生质体的溶液，加入到小室中。静置三到四分钟，使原生质体沉降。用透明盖片覆盖小室，盖片应接触溶液表面。避免在下方滞留气泡。将载玻片轻轻放置在倒置显微镜的载物台上，并连接至灌流系统和泵，注意防止管道中产生气泡。开启等渗溶液流动，以每分钟1毫升的速度进行持续灌流。为记录体积变化，应选择一个包含尽可能多的球形细胞且细胞轮廓在其最大周长处清晰对焦的视野。以每秒一帧或1赫兹的速率，对选定的静止原生质体录制第62段视频。录制开始时，先用等渗溶液冲洗15秒，随后切换至高渗溶液持续45秒。将视频以 Tiff 格式保存。为分析细胞膨胀的一系列图像，请使用 ImageJ 软件中的 Image Explorer 和 protoplasts analyzer 插件。启动 ImageJ 后，要打开视频，请在 ImageJ 面板上单击“文件”，然后依次在下拉菜单中选择“导入”，再选择“Image Explorer”。高亮选中的视频。右键点击，然后左键点击。点击原生质体分析器。在第一张图像上，使用鼠标在选定的原生质体周围绘制圆形，然后单击“确定”。在随后出现的检测参数表格中，启动原生质体检测算法，单击原生质体图像顶部面板中的“局部”。然后进行处理。在下拉菜单中，观察整个视频中所选原生质体周围的绿色圆圈。使用底部的滑块，将结果保存到 Excel 文件中。分析以逐帧方式进行。因此，当存在多个细胞时，需要进行排序，以区分属于每个细胞的曲线。此处展示了三个时间过程在排序前后的 Excel 表格，其中面积值已从像素转换为平方微米。每次的时间过程随后导出为单独的文本文件。开始此操作时，将腔室连接至灌流系统和泵，并开启示踪染料流动，以维持每分钟一毫升的恒定灌流速率，以每秒一帧的速率记录62秒的视频。先用示踪染料记录15秒，然后切换至高渗溶液持续45秒，随后停止记录。用指示剂冲洗。至少再灌注30秒。在开始新的录像记录之前，保存5到6个录像用于分析。为了获得指示剂染料透射率变化的平均时间过程，启动 Image J 并点击文件。然后打开并浏览至视频文件。对于每个视频，在视频第一帧图像的任意位置绘制一个 10 像素宽的垂直矩形，然后点击 Image J 主面板上的图像。然后在下拉菜单中点击裁剪。为将60帧图像排列成一行，点击图像，随后依次在下拉菜单中展开堆栈并创建拼接图。在整行图像的任意位置绘制一个像素高的水平矩形，然后点击Image J主面板中的分析。接下来，点击“绘制轮廓”。在下拉菜单中，将透射率数据列表复制到 Excel 文件中。对来自指示剂染料冲洗 Sero 视频的透射率时间过程进行平均。通过将图像序列号乘以 0.1 来生成实时基线。将平均时间过程保存到文本文件中，以计算渗透压时间过程的各个参数。使用可获取的 MATLAB 拟合程序 PF fit。免费使用。下载和使用本程序的详细信息请参见方案文本。在指示符拟合面板中。导入指示剂染料透射率的平均时间过程数据。手动输入当前实验参数，以及用于描述指示剂染料浓度时间过程的参数的初始估计值。也可修改这些参数。点击“运行”以查看指示剂DAI浓度及模拟浴液渗透压的时间过程曲线图。准确拟合数据对于确定水渗透系数至关重要。切换到体积拟合面板，选择导入该区域的数据文件。选择最后一个合适的指示器作为参数来源。选择模型类别，从二类开始。需要初始化PF参数中的慢速PF和延迟，例如如图所示，但也可使用其他数值。勾选所有三个待拟合参数的复选框。点击运行。然后目测中间结果，并根据需要调整延迟参数和记录长度。检查结果图以评估拟合效果、质量，并记录拟合误差。将初始参数逐个改变数倍，然后重新运行。重复此步骤数次，每次使用不同的初始化参数组合，以获得最低的拟合误差值，从而确定水渗透系数（pf），并比较不同水通道蛋白的活性。分别从中国台湾兔眼草叶片中分离出原生质体，并分别转化含有来自兔眼草、opsys 和玉米水通道蛋白基因的三种基因构建体。通过共转染编码增强型绿色荧光蛋白的载体对原生质体进行标记。记录每个细胞在低渗刺激下细胞体积变化的时间过程，以及低渗刺激期间浴液渗透浓度变化的时间过程，由此计算出每个细胞的 pf 值。通过使用 PF FIT 程序，观察到转染了三种水通道蛋白中任意一种的原生质体，其 PF 值均显著高于仅转染 GFP 的对照细胞。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数个实验日内完成对数十个细胞的分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在分离的原生质体或其他经低渗实验处理的特定细胞中测定 SMO 水通透性。如有其他疑问，请随时与我们联系。

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生物学

测量渗透水渗透系数（P<sub&gt; F</sub&gt;）球形细胞：隔离植物原生质体为例。

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植物原生质体的荧光激活细胞分选

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体外 肠道囊泡法评估胃肠道疾病模型中的黏膜通透性

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利用光镊测量细菌细胞的弯曲刚度

在活细胞中测定特定基因的RNA聚合酶II转录动力学。通过荧光标记目的基因转录出的mRNA，并利用光漂白后荧光恢复技术（FRAP），获得体内转录延伸的动力学参数。...

单个活细胞中 mRNA 转录动力学的测量

学习测量植物原生质体渗透水渗透系数（P_f）的方法，以研究水通道蛋白功能。该方法通过酶解法分离原生质体，结合显微成像与数值分析，为细胞水分运输机制研究提供可靠技术框架。

测量球形细胞的渗透水渗透系数（P_f）：以分离的植物原生质体为例

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