Protocole SIVQ-LCM pour l'instrument ArcturusXT

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’analyse d’images spatialement invariantes, de quantification vectorielle ou SIVQ en combinaison avec la capture laser MICRODISSECTION ou LCM pour identifier les caractéristiques tissulaires d’intérêt et effectuer rapidement une microdissection dirigée. Pour ce faire, il faut d’abord capturer des images du tissu cible pour le SIVQ. L’analyse SIVQ est ensuite effectuée et l’annotation SIVQ est importée dans le dispositif de microdissection pour traitement.

En fin de compte, les cellules d’intérêt peuvent être isolées par S-I-V-Q-L-C-M pour l’analyse moléculaire en aval. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que S-I-V-Q-L-C-M rationalise le processus de sélection et de micro-dissection de grandes zones cibles qui seraient autrement difficiles et chronophages par les techniques traditionnelles de micro-dissection par capture laser. La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Avi Rosenberg, chercheur clinique dans notre laboratoire, pour imager les échantillons de tissus d’intérêt.

Tout d’abord, chargez les diapositives sur la platine motorisée de l’instrument de microdissection et lancez le logiciel associé. Cochez ensuite les cases appropriées pour désigner les positions des diapositives chargées et assurez-vous que les fichiers image capturés seront enregistrés au format JPEG. Ajustez la luminosité et la mise au point de l’image à l’écran pour optimiser la qualité de l’image.

Ensuite, à l’aide de la boîte à outils d’inspection, tournez le diffuseur et réglez une luminosité de lampe de 60 et un gain de caméra de deux 20. Dans la fenêtre d’aperçu, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner, mémoriser les paramètres et enregistrer. Capturez une image miniature de la diapositive pour fournir une feuille de route pour le processus de dissection.

Ajustez un grossissement et trouvez la zone d’intérêt. Capturez ensuite une image de la zone pour l’analyse algorithmique des images capturées. Commencez par transférer les images dans le dossier SIVQ.

Ouvrez ensuite SIVQ et chargez l’image capturée qui vous intéresse. Naviguez jusqu’à la zone d’intérêt et ajustez la taille des fenêtres d’affichage cinq et six sans ajuster l’agrandissement de l’image. Sélectionnez ensuite la taille du vecteur d’anneau et le nombre d’anneaux à utiliser pour l’analyse.

Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la fonction d’image prédicat à capturer dans la fenêtre de la fenêtre six, sélectionnez la carte thermique, puis cliquez sur Analyser vers X pour analyser l’image. Utilisez ensuite la partie supérieure des deux barres coulissantes horizontales pour ajuster la spécificité globale du vecteur. Utilisez la barre inférieure pour augmenter la sensibilité après l’exécution de la peau.

Pour augmenter la zone classée comme étant une correspondance, décochez la case radio de la carte thermique pour vous assurer que la carte thermique SIVQ est remplacée par une couleur rouge uniforme et augmentez la taille de la peinture. Enregistrez l’image en cliquant sur le bouton Enregistrer l’image. Convertissez ensuite la sortie BMP au format de fichier JPEG.

Ensuite, utilisez un éditeur hexadécimal pour redéfinir les coordonnées de position trouvées entre le début du marqueur d’image et le premier marqueur de table de quantification défini dans l’en-tête du fichier JPEG de post-analyse à partir de l’image de l’instrument de dissection d’origine avant de commencer la micro-dissection. Placez le capuchon de capture laser MICRODISSECTION ou LCM au centre de la région d’intérêt où les images ont été capturées pour l’analyse SIVQ. Ensuite, après avoir calibré les lasers UV et infrarouges, optimisez les paramètres, notamment la durée de puissance, l’emplacement des lasers et la vitesse de coupe UV.

Ouvrez ensuite le logiciel de sélection automatisée et importez l’image analysée. Créez un nouveau fichier d’analyse pour entraîner le logiciel de sélection automatisée à reconnaître l’annotation SIVQ. Sélectionnez maintenant les zones d’arrière-plan qui sont marquées par les carrés bleus de l’image analysée par SIVQ.

Sélectionnez ensuite les régions d’intérêt ou R OIS marquées par des cercles rouges et cliquez sur apprendre pour générer le fichier d’entraînement. Copiez les zones sélectionnées dans l’image en direct. Pour commencer la microdissection, sélectionnez la boîte à outils microdisect et choisissez les boutons de capture infrarouge ou de coupe UV appropriés.

Une fois la dissection terminée, déplacez le capuchon LCM vers le poste de contrôle de la qualité et capturez une image de l’échantillon disséqué. Enfin, si les échantillons souhaités ont été disséqués avec succès, cliquez sur le bouton de l’étape actuelle et retirez le capuchon LCM pour lancer la procédure d’extraction moléculaire pour l’analyse en aval. Dans cette expérience représentative, une section de tissu mammaire humain fixée au formol et incluse dans de la paraffine a été immunomarquée pour la cytokératine AE un, AE 3 à l’aide d’un protocole d’immunohistochimie standard.

Étant donné que ce tissu ne peut pas être recouvert pour la microdissection, les cellules colorées immunohistochimiques peuvent être difficiles à apprécier visuellement. Ainsi, pour fournir une meilleure correspondance de l’indice et une image améliorée, des xylènes ont été ajoutés à la section du tissu pour créer une pseudo-lamelle. Une image JPEG de la zone de glissement de la pseudo-couverture a ensuite été capturée et importée dans SIVQ pour l’analyse de l’algorithme.

Une caractéristique d’image prédicat observée sous la forme d’une coloration DAB brun foncé a été sélectionnée par l’utilisateur et l’algorithme SIVQ a été lancé pour l’analyse de l’image. La carte thermique SIVQ a ensuite été convertie en une peinture rouge reconnue par le logiciel de sélection automatisée, et les xylènes ont été laissés s’évaporer. La carte thermique SIVQ a ensuite été importée dans le logiciel de sélection automatisée.

Enfin, les cellules mises en évidence ont été disséquées avec le laser infrarouge. Le capuchon LCM a ensuite été déplacé vers le poste de contrôle de la qualité de l’instrument de microdissection et inspecté visuellement pour évaluer le succès de la dissection. Les tissus restants ont également été inspectés et la carte thermique SIVQ a été réimportée.

Pour confirmer davantage l’efficacité de la microdissection, une fois maîtrisée, S-I-V-Q-L-C-M peut être effectuée en quelques minutes par lame, fournissant rapidement des informations enrichies pour une variété de techniques analytiques en aval. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’intégrer S-I-V-Q-L-C-M dans votre flux de travail de microdissection.