Name: Imagerie de cellules vivantes primaires de rats néonatals cardiomyocytes Suite à adénovirus et Lentivirales transduction confocale à disque rotatif Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel de cardiomyocytes néonataux de rat après transduction lentivirale et adénovirale par microscopie confocale à disque rotatif. Cette méthode permet d'observer la dynamique des protéines marquées EGFP dans des cellules vivantes.

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Nous tenons à remercier le Dr Alengo Nyamay’antu et le Dr Ilse Timmerman pour leurs conseils sur l’emballage lentiviral. Ce travail est soutenu par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association 10SDG4170137.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cardiomyocytes primaires isolés à partir de rats nouveau-nés ont longtemps été utilisées pour étudier les fonctions des cardiomyocytes in vitro. Ce protocole décrit un procédé pour l&#39;isolement des cardiomyocytes néonataux de bébés rats en utilisant une digestion par enzyme de procédé en deux étapes, d&#39;abord à digérer avec de la trypsine O / N à 4 ° C, puis de la collagénase purifiée. Un avantage de l&#39;emploi de l&#39;étape de la collagénase purifiée est que le même grade de l&#39;enzyme est utilisée ...

Cardiomyocytes de rats nouveau-nés primaires ont longtemps été utilisés pour étudier la fonction des cardiomyocytes in vitro 1. Ils sont faciles à isoler de ratons par plusieurs méthodes bien établies 2-4. La méthode la plus courante utilise la collagénase ou la trypsine pour digérer le tissu conjonctif du coeur avant l&#39;isolement des cellules. Les chercheurs ont également mis au point des méthodes d&#39;isolement des cardiomyocytes de rongeurs adultes 5-8 ainsi que des souris néonatales 9,10. Ce protocole décrit un procédé pour l&#39;isolement des cardiomyocytes à partir de jeunes rats nouveau-nés, en employant une procédure digestion enzymatique en deux étapes. La trypsine est utilisée en premier O / N à 4 ° C, puis de la collagénase purifiée à 37 ° C. L&#39;incubation du tissu cardiaque avec de la trypsine O / N à 4 ° C permet de réduire les mesures nécessaires pour la récolte des cellules par rapport aux méthodes utilisant des incubations séquentielles dans une solution chaude d&#39;enzyme 2. En outre, en utilisant des co purifiéellagenase plutôt que enzymes brutes, la variabilité de lot à lot peut être éliminé, offrant ainsi une reproductibilité accrue. Des études fonctionnelles d&#39;une protéine particulière emploient souvent un système d&#39;expression de protéine en utilisant un adenovirus 11 à 13 et / ou un lentivirus 14-16. [MISE EN GARDE] La production et la manipulation virale doivent être effectués selon les directives du NIH. L&#39;adénovirus ne s&#39;intègre pas dans le génome de l&#39;hôte. Il a une efficacité de transduction très élevée dans la plupart des types cellulaires, y compris les cellules se divisant et les cellules ne se divisant pas, ainsi que des cellules primaires et des lignées cellulaires établies. Cela rend l&#39;adénovirus, un vecteur fiable pour l&#39;expression génique. Des niveaux élevés de la protéine codée par le vecteur d&#39;adénovirus se développent dans les 48 heures suivant la transduction, et ils peuvent durer plusieurs semaines 17. Cependant, un inconvénient de l&#39;utilisation d&#39;un adénovirus pour l&#39;expression des protéines est que le développement d&#39;un recombinant adenovirus est à la fois compliqué et prend du temps. Cet inconvénient explique en partie pourquoi de nombreux chercheurs se sont tournés vers des lentivirus pour l&#39;expression du gène recombinant. Contrairement constructions adénoviraux, générant une construction lentiviral est rapide et facile. Bien que les lentivirus ont généralement des efficacités inférieures de transduction que les adénovirus, les cellules se divisant en deux et ne se divisant pas, ils ne s&#39;intégrer dans le génome de l&#39;hôte. Par conséquent, l&#39;expression du gène transduit est plus stable que pour les lentivirus des adénovirus. Grâce aux progrès technologiques dans le domaine de la microscopie, il est beaucoup plus facile de capturer des images de cellules vivantes des cellules exprimant des protéines recombinantes. Cela est vrai même à des vitesses de taux de la vidéo de l&#39;acquisition. Ceci permet au chercheur de déterminer comment des modifications particulières à la protéine d&#39;intérêt fonctionnellement impact sur la cellule en temps réel. Le microscope confocal à disque rotatif présente plusieurs caractéristiques qui en font une technique optimale pour live imagerie cellulaire 18,19. Le disque tournant Yokogawa permet beaucoup plus rapide acquisition d&#39;image, tandis que dans le même temps en utilisant beaucoup moins de puissance du laser de balayage du point microscopes confocaux. Ces deux particularités sont dues au disque en rotation, qui contient de nombreux trous confocale par laquelle le laser passe simultanément aux échantillons. Lors de l&#39;acquisition, le disque lui-même tourne rapidement et en continu 18-20. En utilisant le système de mise au point automatique du microscope, l&#39;accent est maintenue stable sur de longues périodes de temps. Cela permet aux chercheurs de prendre des images de cellules vivantes bien ciblés. Les images acquises sont lues comme un fichier vidéo. Les images sont analysées en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image tel que ImageJ 21,22, FIJI 23, ou un autre logiciel disponible dans le commerce.

<table><tbody><tr><td>1 Ciseaux pour la décapitation</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>1 Ciseaux fins pour l’isolation du cœur et le hachage</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>2 Pinces fines (Dumont n° 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>3 Plats en plastique stérilisés de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Pour l’isolation du cœur</td></tr><tr><td>3,5 cm Fond en verre boîtes de culture</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Pour le placage final des cardiomyocytes pour l’imagerie future de cellules vivantes. Les micro-plats d’ibidi sont une alternative acceptable.</td></tr><tr><td>Boîtes de culture à fond en verre de 3,5 cm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Pour TIRF ou image haute résolution</td></tr><tr><td>Solution d’éthanol, 70 % (v/v) dans l’eau</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2 % Gélatine</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Plat en plastique stérilisé de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Pour trypsinisation</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Deux paraboles en plastique de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Pour sélection</td></tr><tr><td>Autopipette</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Pour la trituration</td></tr><tr><td>Compteur de cellules Cellomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, compteur de cellules automatisé</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Pour vérifier et compter les cellules</td></tr><tr><td>Microscope et hématocytomètre</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour vérifier et compter les cellules</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0,4 %</td><td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubateur</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Incubation agitateur orbital</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Pour secouer le tissu cardiaque avec la collagénase à 37 &deg ; C à 170-200 tr/min</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>invtrogène</td><td>à</td> haute teneur en glucose 41965039 <td>milieu de mélange comme indiqué dans le protocole et tiède avant utilisation</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>milieu de mélange comme indiqué dans le protocole et tiède avant utilisation</td></tr><tr><td>sérum fœtal</td><td>de bovin invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine (10 000 U/ml)&nbsp ;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Section 2 Transduction lentivirale</td> 3 Plasmides d’emballage <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr> Le <tr><td></td> vecteur de transfert lentiviral, pLVX-IRES-Puro <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (milieu sans sérum)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr>réactif <td></td><td></td><td></td>de<td>transfection</td></tr><tr><td>polyéthylèneimine" max", (MW 40 000) - PEI linéaire à haute puissance (équivalent à Mw 25 000 sous forme de base libre)&nbsp ;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Il peut être substitué par X-tremeGENE 9 de Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>substitut de PEI comme réactif de transfection</td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Dissoudre dans l’eau et faire 100 mM de solution mère. L’inhibition de l’acidification endosomale peut être obtenue avec 10-100 &mu ; M Chloroquine.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lok 10 ml, BD 309604</td><td></td><td>0,45</td><td></td></tr><tr><td>&mu ; m filters</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Utilisez uniquement des filtres en acétate de cellulose ou en polyéthersulfone (PES) (faible liaison protéique). N’utilisez pas de filtres en nitrocellulose. La nitrocellulose lie les protéines de surface sur l’enveloppe lentivirale et détruit le virus.</td></tr><tr><td>Bromure d’hexadiméthrine</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Dissoudre dans l’eau et préparer une solution mère de 8 mg/ml, puis filtrer pour la stériliser.</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 6 000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Section 3 Transduction</td><td></td><td></td><td></td>adénovirale</tr><tr><td>HEK 293Cellules T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Quelques boîtes de culture cellulaire de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque à 96 puits avec couvercle, à fond plat, culture tissulaire, stérile</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Pour titrage Pipette</td></tr><tr><td>multicanaux, 10-100 &mu ; l, 8 canaux</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Section 4 Imagerie de</td><td></td><td></td><td></td>cellules vivantes</tr><tr><td>Disque rotatif microspopy confocal</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Une chambre à température contrôlée</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour maintenir la température à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Un système environnemental CO2 N’importe</td><td>quelle marque</td><td></td><td>Facultatif pour maintenir la concentration optimale de CO2 concentration optimale</td></tr> de <tr><td>CO2 Milieu indépendant, sans invitrogène de glutamine</td><td></td><td>18045-054&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Pour l’imagerie time-lapse de longue durée</td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée, HEPES, sans rouge de phénol</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Pour l’imagerie time-lapse à long terme</td></tr></tbody></table>

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Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primaires de rat cardiomyocytes néonataux sont utiles dans de base en recherche cardiovasculaire vitro, car ils peuvent être facilement isolés en grand nombre en une seule procédure. Grâce aux progrès de la technologie de microscope, il est relativement facile de capturer des images de cellules vivantes dans le but d&#39;enquêter sur les événements cellulaires en temps réel avec peu préoccupants concernant la phototoxicité aux cellules. Ce protocole décrit comment prendre des images en direct de timelapse de cellules de rat primaire cardiomyocytes néonataux l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à disque rotatif qui suit la transduction lentiviral et adénoviral de moduler les propriétés de la cellule. L&#39;application de deux types de virus différents, il est plus facile d&#39;atteindre un taux de transduction et l&#39;expression des niveaux appropriés pour deux gènes différents. Images de cellules vivantes ainsi porté peuvent être obtenus en utilisant le système de mise au point automatique du microscope, qui maintient l&#39;accent stable pour de longues périodes. En appliquant ce procédé, les fonctions de l&#39;ingénieur de manière exogèneprotéines ed exprimés dans les cellules primaires en culture peuvent être analysés. En outre, ce système peut être utilisé pour étudier la fonction des gènes par l&#39;utilisation de siRNA ainsi que des modulateurs chimiques.

Pour illustrer cette technique, un EGFP lentivirus codant (enhanced green fluorescent protein)-tagged Cx43 (Connexin43) ou un Cx43 mutée 32 a été utilisé pour exprimer des protéines EGFP-marqué dans les cellules, et un codage de l&#39;adénovirus FGFR1DN (récepteur du facteur de croissance des fibroblastes 1 dominant négatif ) a été utilisé pour arrêter la signalisation FGF dans la cellule 33-35. Trois jours après l&#39;isolement des cardiomyocytes, les cardiomyocytes isolés ont été transduites avec...

Ce protocole décrit une méthode d’imagerie de cellules vivantes utilisant des cardiomyocytes néonatals primaires de rat après transduction lentivirale et adénovirale à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif. Cela permet d’observer en détail les processus cellulaires dans les cardiomyocytes vivants.

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Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

L'objectif général de cette procédure est d'acquérir des images en laps de temps de cardiomyocytes primaires de rat néonatal après une transduction par lentivirus et adénovirus, en utilisant une microscopie confocale à disque tournant. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant des cardiomyocytes à partir de jeunes rats, puis en mettant les cellules en culture dans des boîtes avec fond en verre. L'étape suivante consiste à effectuer la transduction de la Connexine 43 marquée par EGFP au moyen d'un lentivirus, suivie de la transduction du récepteur tyrosine kinase fgfr dominant négatif par un adénovirus dans les cardiomyocytes.La dernière étape consiste à acquérir des images en lapso-temporel à l'aide d'une microscopie confocale à disque rotatif. En fin de compte, un film reconstitué à partir des images en lapso-temporel acquises peut être obtenu. Celui-ci montre la distribution d'une protéine marquée EGFP exprimée par des gènes lentiviraux dans des cardiomyocytes primaires vivants, sous des conditions cellulaires modifiées par une protéine exprimée par un adénovirus présentant un effet dominant négatif sur fgfr1.Un des principaux avantages de cette technique est qu'elle permet d

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Myocytes cardiaques adultes sont des cellules primaires qui peuvent être isolés de coeurs d'animaux et cultivées pendant plusieurs jours. Durant cette période, la culture de transfert de gènes adénoviraux peut être utilisé pour exprimer les biocapteurs génétiquement codés (ADB) ou des protéines de fusion fluorescentes. Les deux approches permettent d'enquêtes cellulaires par microscopie confocale.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Ici, nous développons les outils nécessaires...

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.

Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

L’isolement des cardiomyocytes néonatals du rat est une procédure longue et imprévisible.  Cette étude décrit des méthodes de cryoconservation et de décongélation des cardiomyocytes de rat nouveau-né qui permettent une utilisation plus efficace des cellules. Les NRCM décongelés peuvent être utilisés pour diverses expériences sans qu’il soit nécessaire d’effectuer des isolations à chaque fois.

Isolement et cryoconservation des rats nouveau-nés cardiomyocytes

Ce protocole décrit une méthode étape par étape pour l’isolement reproductible et la culture à long terme de cardiomyocytes de souris adultes avec un rendement, une pureté et une viabilité élevés.

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Nous décrivons un protocole permettant d’imager volumétriquement des cellules marquées par des protéines fluorescentes profondément à l’intérieur de cœurs embryonnaires et postnatals intacts. En utilisant des méthodes de nettoyage des tissus en combinaison avec la coloration de l’ensemble du support, des cellules uniques marquées par des protéines fluorescentes à l’intérieur d’un cœur embryonnaire ou postnatal peuvent être imagées de manière claire et précise.

Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la génération et la quantification de divers sous-types cardiaques reprogrammés à l’aide d’une administration médiée par un rétrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5.

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la transfection, et la culture à long terme de la souris adulte et les cardiomyocytes de rat.

Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Nous présentons ici une méthode pour étudier la morphogenèse des neurites dans les explants rétiniens postnatals de souris par microscopie confocale time-lapse. Nous décrivons une approche pour le marquage clairsemé et l’acquisition de types de cellules rétiniennes et de leurs processus fins en utilisant des vecteurs de virus adéno-associés recombinants qui expriment des protéines fluorescentes ciblées sur la membrane d’une manière dépendante de Cre.

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

Un ensemble de protocoles est présenté qui décrit la mesure de la fonction contractile via la détection de la longueur du sarcomère ainsi que la mesure transitoire du calcium (Ca2+) dans les myocytes isolés du rat. L’application de cette approche pour les études sur des modèles animaux d’insuffisance cardiaque est également incluse.

Analyse de la dysfonction contractile cardiaque et des transitoires Ca2+ dans les myocytes de rongeurs

Découvrez l'imagerie en temps réel de cardiomyocytes néonataux de rat après transduction lentivirale et adénovirale par microscopie confocale à disque rotatif. Cette méthode permet d'observer la dynamique des protéines marquées EGFP dans des cellules vivantes.

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Imagerie de cellules vivantes primaires de rats néonatals cardiomyocytes Suite à adénovirus et Lentivirales transduction confocale à disque rotatif Microscopie

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