Name: Imagerie de cellules vivantes primaires de rats néonatals cardiomyocytes Suite à adénovirus et Lentivirales transduction confocale à disque rotatif Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel de cardiomyocytes néonataux de rat après transduction lentivirale et adénovirale par microscopie confocale à disque rotatif. Cette méthode permet d'observer la dynamique des protéines marquées EGFP dans des cellules vivantes.

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Nous tenons à remercier le Dr Alengo Nyamay’antu et le Dr Ilse Timmerman pour leurs conseils sur l’emballage lentiviral. Ce travail est soutenu par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association 10SDG4170137.

<ol><li>Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+the+preparation+of+homogeneous+cultures+of+isolated+heart+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells.</a> Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).</li>
<li>Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+allylamine+and+acrolein+in+cultured+myocytes+and+fibroblasts+from+neonatal+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart.</a> Toxicology. 56, 107-117 (1989).</li>
<li>MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+plasminogen+activator+activity+from+neonatal+rat+heart+cells+is+regulated+by+hormones+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. 31 (31), (2009).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. 28 (28), (2009).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.+In+vitro+cellular+%26+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology.</a> Animal. 44, 45-50 (2008).</li>
<li>Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Neonatal+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. 79 (79), (2013).</li>
<li>Kass-Eisler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+adenovirus-mediated+gene+delivery+to+rat+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).</li>
<li>Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMetzger%2C+JM+%22Cardiac+Cell+and+Gene+Transfer%3A+Principles%2C+Protocols%2C+and+Applications%22">Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+delivery+of+genes+into+neonatal+and+adult+ventricular+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).</li>
<li>Bonci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced%27+generation+lentiviruses+as+efficient+vectors+for+cardiomyocyte+gene+transduction+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo.</a> Gene therapy. 10, 630-636 (2003).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF+system+has+a+key+role+in+regulating+vascular+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The FGF system has a key role in regulating vascular integrity.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).</li>
<li>Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy+--+a+cutting-edge+tool+for+imaging+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+structure+and+function%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic.</a> Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).</li>
<li>Adams, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed+multispectral+spinning-disk+confocal+microscope+system+for+fluorescent+speckle+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%22%5BJournal%5D)">A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells.</a> Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+microscopy+systems.+Cold+Spring+Harbor+protocols%29%5BTitle%5D)+AND+%222010%2C+pdb+top88%2C+doi%3A10.1101%2Fpdb.top88%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols).</a> 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. 32 (32), (2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+and+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, (2002).</li>
<li>Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+chloroquine+in+gene+transfer+into+a+human+hepatoma+cell+line+by+DNA%2Flactosylated+polylysine+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes.</a> Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).</li>
<li>McSharry, J., Benzinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+vesicular+stomatitis+virus+by+polyethylene+glycol+%27precipitation%27%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'.</a> Virology. 40, 745-746 (1970).</li>
<li>Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monte+Carlo+simulation+of+the+Spearman-Kaerber+TCID50%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical%22%5BJournal%5D)">Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50.</a> Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).</li>
<li>Kaerber, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaerber%2C+G+%22Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+In%3A+Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+162%22">Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162</a>. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).</li>
<li>Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+FGF+signaling+is+required+for+Cx43+phosphorylation+and+cardiac+gap+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance.</a> Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).</li>
<li>Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+form+of+fibroblast+growth+factor+receptor+1+inhibits+signal+transduction+by+multiple+types+of+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor.</a> The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).</li>
<li>Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transformation+by+fibroblast+growth+factors+can+be+suppressed+by+truncated+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors.</a> Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-dependent+regulation+of+VEGF+receptor+2+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).</li>
<li>Bazan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+assessment+in+enzymatically+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes.</a> Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).</li>
<li>Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+adult+cardiac+myocytes+maintain+protein+synthetic+capacity+of+intact+adult+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts.</a> The American journal of physiology. , 264-573 (1993).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cardiomyocytes primaires isolés à partir de rats nouveau-nés ont longtemps été utilisées pour étudier les fonctions des cardiomyocytes in vitro. Ce protocole décrit un procédé pour l&#39;isolement des cardiomyocytes néonataux de bébés rats en utilisant une digestion par enzyme de procédé en deux étapes, d&#39;abord à digérer avec de la trypsine O / N à 4 ° C, puis de la collagénase purifiée. Un avantage de l&#39;emploi de l&#39;étape de la collagénase purifiée est que le même grade de l&#39;enzyme est utilisée ...

Cardiomyocytes de rats nouveau-nés primaires ont longtemps été utilisés pour étudier la fonction des cardiomyocytes in vitro 1. Ils sont faciles à isoler de ratons par plusieurs méthodes bien établies 2-4. La méthode la plus courante utilise la collagénase ou la trypsine pour digérer le tissu conjonctif du coeur avant l&#39;isolement des cellules. Les chercheurs ont également mis au point des méthodes d&#39;isolement des cardiomyocytes de rongeurs adultes 5-8 ainsi que des souris néonatales 9,10. Ce protocole décrit un procédé pour l&#39;isolement des cardiomyocytes à partir de jeunes rats nouveau-nés, en employant une procédure digestion enzymatique en deux étapes. La trypsine est utilisée en premier O / N à 4 ° C, puis de la collagénase purifiée à 37 ° C. L&#39;incubation du tissu cardiaque avec de la trypsine O / N à 4 ° C permet de réduire les mesures nécessaires pour la récolte des cellules par rapport aux méthodes utilisant des incubations séquentielles dans une solution chaude d&#39;enzyme 2. En outre, en utilisant des co purifiéellagenase plutôt que enzymes brutes, la variabilité de lot à lot peut être éliminé, offrant ainsi une reproductibilité accrue. Des études fonctionnelles d&#39;une protéine particulière emploient souvent un système d&#39;expression de protéine en utilisant un adenovirus 11 à 13 et / ou un lentivirus 14-16. [MISE EN GARDE] La production et la manipulation virale doivent être effectués selon les directives du NIH. L&#39;adénovirus ne s&#39;intègre pas dans le génome de l&#39;hôte. Il a une efficacité de transduction très élevée dans la plupart des types cellulaires, y compris les cellules se divisant et les cellules ne se divisant pas, ainsi que des cellules primaires et des lignées cellulaires établies. Cela rend l&#39;adénovirus, un vecteur fiable pour l&#39;expression génique. Des niveaux élevés de la protéine codée par le vecteur d&#39;adénovirus se développent dans les 48 heures suivant la transduction, et ils peuvent durer plusieurs semaines 17. Cependant, un inconvénient de l&#39;utilisation d&#39;un adénovirus pour l&#39;expression des protéines est que le développement d&#39;un recombinant adenovirus est à la fois compliqué et prend du temps. Cet inconvénient explique en partie pourquoi de nombreux chercheurs se sont tournés vers des lentivirus pour l&#39;expression du gène recombinant. Contrairement constructions adénoviraux, générant une construction lentiviral est rapide et facile. Bien que les lentivirus ont généralement des efficacités inférieures de transduction que les adénovirus, les cellules se divisant en deux et ne se divisant pas, ils ne s&#39;intégrer dans le génome de l&#39;hôte. Par conséquent, l&#39;expression du gène transduit est plus stable que pour les lentivirus des adénovirus. Grâce aux progrès technologiques dans le domaine de la microscopie, il est beaucoup plus facile de capturer des images de cellules vivantes des cellules exprimant des protéines recombinantes. Cela est vrai même à des vitesses de taux de la vidéo de l&#39;acquisition. Ceci permet au chercheur de déterminer comment des modifications particulières à la protéine d&#39;intérêt fonctionnellement impact sur la cellule en temps réel. Le microscope confocal à disque rotatif présente plusieurs caractéristiques qui en font une technique optimale pour live imagerie cellulaire 18,19. Le disque tournant Yokogawa permet beaucoup plus rapide acquisition d&#39;image, tandis que dans le même temps en utilisant beaucoup moins de puissance du laser de balayage du point microscopes confocaux. Ces deux particularités sont dues au disque en rotation, qui contient de nombreux trous confocale par laquelle le laser passe simultanément aux échantillons. Lors de l&#39;acquisition, le disque lui-même tourne rapidement et en continu 18-20. En utilisant le système de mise au point automatique du microscope, l&#39;accent est maintenue stable sur de longues périodes de temps. Cela permet aux chercheurs de prendre des images de cellules vivantes bien ciblés. Les images acquises sont lues comme un fichier vidéo. Les images sont analysées en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image tel que ImageJ 21,22, FIJI 23, ou un autre logiciel disponible dans le commerce.

<table><tbody><tr><td>1 Ciseaux pour la décapitation</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>1 Ciseaux fins pour l’isolation du cœur et le hachage</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>2 Pinces fines (Dumont n° 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>3 Plats en plastique stérilisés de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Pour l’isolation du cœur</td></tr><tr><td>3,5 cm Fond en verre boîtes de culture</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Pour le placage final des cardiomyocytes pour l’imagerie future de cellules vivantes. Les micro-plats d’ibidi sont une alternative acceptable.</td></tr><tr><td>Boîtes de culture à fond en verre de 3,5 cm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Pour TIRF ou image haute résolution</td></tr><tr><td>Solution d’éthanol, 70 % (v/v) dans l’eau</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2 % Gélatine</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Plat en plastique stérilisé de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Pour trypsinisation</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Deux paraboles en plastique de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Pour sélection</td></tr><tr><td>Autopipette</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Pour la trituration</td></tr><tr><td>Compteur de cellules Cellomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, compteur de cellules automatisé</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Pour vérifier et compter les cellules</td></tr><tr><td>Microscope et hématocytomètre</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour vérifier et compter les cellules</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0,4 %</td><td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubateur</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Incubation agitateur orbital</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Pour secouer le tissu cardiaque avec la collagénase à 37 &deg ; C à 170-200 tr/min</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>invtrogène</td><td>à</td> haute teneur en glucose 41965039 <td>milieu de mélange comme indiqué dans le protocole et tiède avant utilisation</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>milieu de mélange comme indiqué dans le protocole et tiède avant utilisation</td></tr><tr><td>sérum fœtal</td><td>de bovin invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine (10 000 U/ml)&nbsp ;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Section 2 Transduction lentivirale</td> 3 Plasmides d’emballage <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr> Le <tr><td></td> vecteur de transfert lentiviral, pLVX-IRES-Puro <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (milieu sans sérum)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr>réactif <td></td><td></td><td></td>de<td>transfection</td></tr><tr><td>polyéthylèneimine" max", (MW 40 000) - PEI linéaire à haute puissance (équivalent à Mw 25 000 sous forme de base libre)&nbsp ;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Il peut être substitué par X-tremeGENE 9 de Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>substitut de PEI comme réactif de transfection</td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Dissoudre dans l’eau et faire 100 mM de solution mère. L’inhibition de l’acidification endosomale peut être obtenue avec 10-100 &mu ; M Chloroquine.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lok 10 ml, BD 309604</td><td></td><td>0,45</td><td></td></tr><tr><td>&mu ; m filters</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Utilisez uniquement des filtres en acétate de cellulose ou en polyéthersulfone (PES) (faible liaison protéique). N’utilisez pas de filtres en nitrocellulose. La nitrocellulose lie les protéines de surface sur l’enveloppe lentivirale et détruit le virus.</td></tr><tr><td>Bromure d’hexadiméthrine</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Dissoudre dans l’eau et préparer une solution mère de 8 mg/ml, puis filtrer pour la stériliser.</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 6 000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Section 3 Transduction</td><td></td><td></td><td></td>adénovirale</tr><tr><td>HEK 293Cellules T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Quelques boîtes de culture cellulaire de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque à 96 puits avec couvercle, à fond plat, culture tissulaire, stérile</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Pour titrage Pipette</td></tr><tr><td>multicanaux, 10-100 &mu ; l, 8 canaux</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Section 4 Imagerie de</td><td></td><td></td><td></td>cellules vivantes</tr><tr><td>Disque rotatif microspopy confocal</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Une chambre à température contrôlée</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour maintenir la température à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Un système environnemental CO2 N’importe</td><td>quelle marque</td><td></td><td>Facultatif pour maintenir la concentration optimale de CO2 concentration optimale</td></tr> de <tr><td>CO2 Milieu indépendant, sans invitrogène de glutamine</td><td></td><td>18045-054&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Pour l’imagerie time-lapse de longue durée</td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée, HEPES, sans rouge de phénol</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Pour l’imagerie time-lapse à long terme</td></tr></tbody></table>

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Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primaires de rat cardiomyocytes néonataux sont utiles dans de base en recherche cardiovasculaire vitro, car ils peuvent être facilement isolés en grand nombre en une seule procédure. Grâce aux progrès de la technologie de microscope, il est relativement facile de capturer des images de cellules vivantes dans le but d&#39;enquêter sur les événements cellulaires en temps réel avec peu préoccupants concernant la phototoxicité aux cellules. Ce protocole décrit comment prendre des images en direct de timelapse de cellules de rat primaire cardiomyocytes néonataux l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à disque rotatif qui suit la transduction lentiviral et adénoviral de moduler les propriétés de la cellule. L&#39;application de deux types de virus différents, il est plus facile d&#39;atteindre un taux de transduction et l&#39;expression des niveaux appropriés pour deux gènes différents. Images de cellules vivantes ainsi porté peuvent être obtenus en utilisant le système de mise au point automatique du microscope, qui maintient l&#39;accent stable pour de longues périodes. En appliquant ce procédé, les fonctions de l&#39;ingénieur de manière exogèneprotéines ed exprimés dans les cellules primaires en culture peuvent être analysés. En outre, ce système peut être utilisé pour étudier la fonction des gènes par l&#39;utilisation de siRNA ainsi que des modulateurs chimiques.

Pour illustrer cette technique, un EGFP lentivirus codant (enhanced green fluorescent protein)-tagged Cx43 (Connexin43) ou un Cx43 mutée 32 a été utilisé pour exprimer des protéines EGFP-marqué dans les cellules, et un codage de l&#39;adénovirus FGFR1DN (récepteur du facteur de croissance des fibroblastes 1 dominant négatif ) a été utilisé pour arrêter la signalisation FGF dans la cellule 33-35. Trois jours après l&#39;isolement des cardiomyocytes, les cardiomyocytes isolés ont été transduites avec...

Ce protocole décrit une méthode d’imagerie de cellules vivantes utilisant des cardiomyocytes néonatals primaires de rat après transduction lentivirale et adénovirale à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif. Cela permet d’observer en détail les processus cellulaires dans les cardiomyocytes vivants.

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Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

L'objectif général de cette procédure est d'acquérir des images en laps de temps de cardiomyocytes primaires de rat néonatal après une transduction par lentivirus et adénovirus, en utilisant une microscopie confocale à disque tournant. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant des cardiomyocytes à partir de jeunes rats, puis en mettant les cellules en culture dans des boîtes avec fond en verre. L'étape suivante consiste à effectuer la transduction de la Connexine 43 marquée par EGFP au moyen d'un lentivirus, suivie de la transduction du récepteur tyrosine kinase fgfr dominant négatif par un adénovirus dans les cardiomyocytes.La dernière étape consiste à acquérir des images en lapso-temporel à l'aide d'une microscopie confocale à disque rotatif. En fin de compte, un film reconstitué à partir des images en lapso-temporel acquises peut être obtenu. Celui-ci montre la distribution d'une protéine marquée EGFP exprimée par des gènes lentiviraux dans des cardiomyocytes primaires vivants, sous des conditions cellulaires modifiées par une protéine exprimée par un adénovirus présentant un effet dominant négatif sur fgfr1.Un des principaux avantages de cette technique est qu'elle permet d'effectuer une imagerie en laps de temps sur des cellules vivantes à l'aide d'un microscope confocal à disque tournant et d'une condition choisie, en suivant l'expression génique induite par un adénovirus ou une transfection ultérieurement développée. Cette méthode peut ainsi fournir des informations sur les cardiomyocytes néonatals droits. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les cardiomyocytes primaires de souris, les cardiomyocytes néonatals, les cardiomyocytes primaires de souris droit, les cardiomyocytes adultes et d'autres cellules en culture.En général, les personnes novices en microscopie éprouvent des difficultés à obtenir des images bien focalisées en raison d'une légère dérive du plateau avec le temps. En utilisant la fonction de mise au point automatique de l'appareil, il est possible de maintenir une focalisation stable, ce qui permet aux chercheurs de capturer plus facilement des images bien nettes. Les cardiomyocytes néonatals utilisés dans cette procédure sont isolés de ratons âgés d'un à deux jours.Retirer le cœur battant aussi rapidement que possible de l’animal euthanasié à l’aide d’outils stérilisés et placer le cœur dans 30 millilitres de C-M-F-H-B-S-S refroidi sur glace dans un tube conique de 50 millilitres. Généralement, un total de 10 cœurs sont recueillis dans deux tubes coniques de 50 millilitres, chacun contenant cinq cœurs dans 30 millilitres de C-M-F-H-B-S-S refroidi sur glace ; pour les besoins de l’enregistrement, deux à trois cœurs sont recueillis.Faire tourbillonner le tube pour rincer les cœurs. Toutes les procédures doivent être effectuées sur de la glace et dans une hotte à flux laminaire. À partir de ce moment, jeter le surnageant et transférer les cœurs dans une nouvelle boîte en plastique stérilisée de 10 centimètres placée sur de la glace.Veillez à ne pas aspirer les cœurs avec l'aspirateur. Retirez les gros vaisseaux et/ou les tissus indésirables des cœurs. Ajoutez 10 millilitres de S-S-B-H-F-M-C glacé à la boîte pour rincer les cœurs.Ensuite, transférez tous les cœurs dans une nouvelle boîte plastique stérilisée de 10 centimètres sur de la glace. Hachez les cœurs avec des ciseaux en morceaux de moins d'un millimètre cube. Ajoutez neuf millilitres de C-M-F-H-B-S-S froid aux cœurs hachés.Ajouter un millilitre de trypsine froide. Réhydraté avec C-M-F-H-B-S-S. Sceller la boîte avec du paraforme.Couvrir avec du papier d’aluminium et placer dans une chambre froide pendant la nuit. Le jour suivant, transférer tous les tissus cardiaques avec le tampon dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Ajouter un millilitre d’inhibiteur de trypsine dans le C-M-F-H-B-S-S. Fermer hermétiquement le tube conique de 50 millilitres pour éviter toute contamination.Incuber le tube pendant environ 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius afin de réchauffer le tissu et le tampon à une température comprise entre 30 et 37 degrés Celsius. Ensuite, ajouter cinq millilitres de collagénase dans le milieu Liebovitz L 15 et incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes avec agitation douce. Après 45 minutes, triturer les tissus à l’aide d’une pipette automatique en effectuant 20 aspirations et dispensations à une vitesse de trois millilitres par seconde.Laisser les résidus de tissu se déposer pendant trois minutes, puis filtrer le surnageant à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns. Ajouter cinq millilitres du milieu Leibovitz L 15 aux agrégats tissulaires restants, homogénéiser et filtrer à nouveau le surnageant. Rincer le tamis cellulaire avec deux millilitres du milieu Leibovitz L 15.Placer la solution cellulaire filtrée dans une hotte pendant 20 à 60 minutes afin de permettre à la collagénase de digérer le sédiment de collagène partiellement dégradé. Centrifuger les cellules à 100 fois G pendant cinq minutes. Remettre en suspension les cellules dans 20 millilitres de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 20 unités par millilitre.Préincuber les cellules dans deux boîtes de culture plastique de 10 centimètres de diamètre en présence de pénicilline-streptomycine pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une incubateur CO₂ pour la sélection des cardiomyocytes. Les fibroblastes s'attachent plus facilement au fond de la boîte que les cardiomyocytes. Après une heure, agiter doucement les boîtes et recueillir le surnageant contenant les cardiomyocytes. Sédimenter les cellules à 100 × g pendant cinq minutes. Remettre les cellules en suspension dans du DMEM contenant 10 % de FBS, 10 unités par millilitre de pénicilline-streptomycine et 0,1 millimolaire de bromodésoxyuridine. Ensemencer les cellules à raison de 2 × 10⁵ cellules par boîte dans des boîtes en verre de 3,5 centimètres de diamètre revêtues de gélatine pour observation au microscope. Incuber dans l’incubateur CO₂ à 37 degrés Celsius.Ne pas perturber les cellules après leur ensemencement pendant au moins 24 heures avant la transduction lentivirale des cardiomyocytes. Les plasmides lentiviraux sont conditionnés et la solution lentivirale est collectée selon les procédures décrites dans le manuscrit accompagnant. Pour commencer la procédure de transduction lentivirale, retirer le milieu d'une boîte de 3,5 centimètres à fond en verre contenant des cardiomyocytes néonatals de rat et ajouter un millilitre de solution lentivirale filtrée.Incuber la boîte dans une étuve à CO2 à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après six heures, remplacer le milieu par du DMEM frais contenant du MEM, 5 % de FBS et de la pénicilline-streptomycine, puis incuber dans l'étuve à CO2 à 37 degrés Celsius pendant trois jours.L'intégration du gène exogène dans le génome de l'hôte par le lentivirus est considérée comme complète 72 heures avant la transduction par adénovirus. La solution mère d'adénovirus doit être titrée comme décrit dans le manuscrit associé. Récupérez la boîte en verre de 3,5 centimètres contenant les cardiomyocytes de rat néonatal ayant subi la transduction lentivirale.Remplacez le milieu par 750 microlitres de solution d'adénovirus diluée. La réduction du volume de milieu lors de la transduction à environ 50 % du volume initial est essentielle pour obtenir une efficacité de transduction élevée. Incubez dans l'incubateur CO₂ à 37 degrés Celsius pendant quatre à huit heures.Ensuite, remplacez le milieu par du milieu frais et incubez pendant 24 à 48 heures avant d'utiliser les cellules pour des expériences d'imagerie de cellules vivantes. L'acquisition d'images, à l'aide d'un microscope confocal à disque tournant équipé d'une chambre contrôlée en température et d'un système environnemental de CO2, sera mise en œuvre au moins une heure avant l'imagerie. Allumez le système de contrôle de température afin que tous les appareils atteignent l'équilibre à 37 degrés Celsius.Allumez le système de microscope confocal à disque rotatif. Placez la coupelle de 3,5 centimètres avec fond en verre contenant des cardiomyocytes néonatals de rat sur la platine du microscope confocal à disque rotatif, à l'intérieur d'une chambre contrôlée en température. Ouvrez l'obturateur de la source de lumière fluorescente et repérez les cellules exprimant des protéines fluorescentes sous le microscope à l'aide de l'oculaire.Éteignez l'obturateur de la source de lumière fluorescente. Changez le trajet de la lumière pour passer au microscope confocal à disque tournant. Ajustez les paramètres d'acquisition de manière appropriée à l'aide du logiciel de fonctionnement, en vérifiant les images affichées sur l'écran, puis configurez les paramètres pour l'acquisition des images fluorescentes.Par exemple, sélectionnez les canaux en utilisant les trajets optiques et le canal un EGFP afin d'acquérir le signal fluorescent provenant de l'EGFP pour le canal un. Réglez la fréquence entre les points temporels en configurant les paramètres d'acquisition séquentielle pour prendre des images en séquence à l'aide du logiciel de fonctionnement. Par exemple, pour acquérir un point temporel toutes les cinq minutes, sélectionnez minutes par point temporel dans le menu déroulant et saisissez cinq dans le champ de texte.Démarrez l'acquisition en laps de temps en cliquant sur le bouton de démarrage pour acquérir une séquence d'images. Une fois l'acquisition terminée, les images peuvent être lues sous forme de fichier vidéo et analysées. À l'aide du logiciel d'analyse, sélectionnez les images acquises à inclure dans une vidéo, si nécessaire.Rognez les régions d’intérêt dans les images et sélectionnez les points temporels intéressants afin de réduire la taille du fichier vidéo, puis exportez les images sous forme de fichier vidéo au format VI ou MOV. Choisissez un format vidéo dans le menu format et définissez la temporisation requise pour la vidéo finale. Cliquez ensuite sur exporter.Dans cette expérience représentative, des cardiomyocytes néonatals de rat ont été transduits avec un lentivirus codant pour la CONNEXINE 43 marquée par la EGFP ou une CONNEXINE 43 mutée, ainsi qu'avec un adénovirus codant pour un récepteur du facteur de croissance des fibroblastes dominant négatif, FGFR1 dn. L'expression des protéines marquées par la EGFP a été confirmée par microscopie confocale à disque tournant, tandis que la présence du récepteur du facteur de croissance des fibroblastes dominant négatif a été vérifiée par immunochimie et western blot. Des images enregistrées en temps réel ont été acquises puis lues sous forme de film. Dans cet exemple, les images se déplaçaient dans le plan XY, probablement parce que l'équilibre thermique n'était pas adéquat ou que le mode d'acquisition multiple ne fonctionnait pas correctement.Ceci provient d'images en prise de vue échelonnée de cardiomyocytes exprimant la connexion 43 mutée et le FGFR un dn. Ici, l'équilibre thermique était adéquat et une seule région d'intérêt a été acquise, ce qui a permis d'obtenir des images sans déplacement dans le plan XY. Les battements des cardiomyocytes ont été évalués après l'acquisition afin de confirmer la viabilité cellulaire.Ce film montre qu'après 16 heures d'imagerie en lapse de temps, les cardiomyocytes exprimant EGFP ont conservé leurs propriétés fonctionnelles et battaient de manière rythmique. Grâce à cette technique, vous pouvez réaliser une imagerie en direct de cardiomyocytes primaires. Veuillez vous rappeler que le travail avec des adénovirus et des lentivirus peut présenter des risques, et que des précautions telles que la prévention de la contamination doivent toujours être prises lors de l'utilisation de ces virus.

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