Name: Évaluation de lactivité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation de l'activité anti-fongique des macrophages alvéolaires isolés par microscopie confocale. Cette technique permet d'étudier le contrôle de la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses Grant R01AI079253 (BHS), et par l&#39;Institut national du cancer Cancer Center Support Grant CA016056 à Roswell Park Cancer Institute.

Toutes les procédures effectuées sur les animaux dans cette étude ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Comité à Roswell Park Cancer Institute et respectées tout état, fédéral, et les Instituts nationaux de la réglementation de la santé. 1. In vivo des macrophages étiquetage Remarque: PHK26 est un colorant lipophile qui sera absorbé par les cellules phagocytaires à la fois dans la circulation et dans les tissus lorsqu&#39;ils sont administrés par voie intraveineuse (iv). PKH26 a été utilisé pour le marquage in vivo pour réduire au minimum la quantité de manipulation post-récolte du macrophage. PKH-26 présente l&#39;avantage d&#39;accumuler de manière stable dans les macrophages alvéolaires sur des périodes prolongées. Attendre 10 jours après l&#39;administration permet de liquidation de toutes les cellules marquées de la circulation, ne laissant que macrophages alvéolaires stable marqué par PKH26 8, 9. PKH26 est un fluorochrome rouge qui a excitation (551 nm) et d&#39;émission (567 nm) des caractéristiques compatiblesavec des systèmes de détection de la rhodamine ou la phycoérythrine. Toute procédure de marquage peut introduire artefact, y compris la perte de viabilité. Cependant, puisque nous utilisons la même approche pour l&#39;étiquetage des macrophages dans les génotypes de souris différentes (par exemple, WT vs la NADPH oxydase déficient), les effets de ces objets seraient uniformes. <ol><li> Diluer la solution mère de PKH26 (1 x 10 -3 M dans de l&#39;éthanol) 1:05 dans le diluant C fournie par le fabricant. </li><li> Charge: 100 ul de dilution PKH26 dans une seringue à insuline de 1/2 ml (29 G x 1/2 &quot;) pour chaque souris. </li><li> Administrer à des souris par injection intraveineuse (veine de la queue soit ou rétro orbital) au moins 10 jours avant la récolte. </li></ol> 2. Récolte macrophages alvéolaires par lavage broncho-alvéolaire (LBA) Le nombre de souris à utiliser pour une expérience peut varier. Un rendement typique d&#39;une souris non stimulées est de l&#39;ordre de 3-5 x 10 5 macrophages alvéolaires, mais ce nombre peut varier grandement Based sur des facteurs tels que la taille de la souris, l&#39;expérience de la personne effectuant le lavage, et le nombre d&#39;instillations de fluide de lavage et le volume retiré à partir de poumons. Dans ce protocole lavage pulmonaire est effectuée avec une cavité thoracique fermé qui, avec des lavages répétés 1 ml permet d&#39;augmenter le rendement de la cellule. <ol><li> Euthanize souris par administration d&#39;une dose létale d&#39;anesthésique Avertin (12,5 mg) par voie intrapéritonéale (ip) en utilisant des conditions aseptiques afin de maintenir la solution stérile. </li><li> Pulvériser la souris à fond avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Enlever la peau à partir de l&#39;extrémité crânienne de l&#39;animal à exposer le thorax (figure 1A). <ol><li> Faire une petite incision dans la peau juste sous le diaphragme. </li><li> Insérez un doigt dans la coupe et tirez la peau à partir de l&#39;extrémité crânienne de l&#39;animal (figure 1A). </li><li> Appuyez légèrement sur ​​la tête, l&#39;extension de la face ventrale du cou (figure 1A). </li></ol></li><li> Découpez un petit trou à travers la cage thoraciquedans la partie droite du thorax pour dégonfler les poumons et également permettre la visualisation des poumons au cours des étapes suivantes. </li><li> Localiser la trachée, et soigneusement disséquer les tissus environnants. <ol><li> Retirez les glandes salivaires, les muscles sterno et du larynx, etc avec des pinces courbes. </li><li> Soulevez délicatement avec une pince courbes et couper avec des ciseaux le tissu mince recouvrant la trachée (adventice) révélant la structure du cartilage annelé sous-jacent. </li></ol></li><li> Insérer un cathéter dans la trachée. <ol><li> En utilisant des pinces incurvées, placer une suture derrière (dorsal à) la trachée et tirer une longueur de 10 cm à travers l&#39;ouverture. </li><li> Commençant au-dessus du cricoïde (l&#39;anneau épaissi de cartilage) guide attentivement un 22 G cathéter dans la trachée d&#39;arrêt où la trachée disparaît derrière le sternum. </li><li> Attacher solidement suture autour de la trachée et le cathéter pour un ajustement parfait. Retirer l&#39;aiguille du cathéter. </li></ol></li><li> Assembler 4 voies robinet. <ol><li> Remplirun 6 ml seringue avec du DPBS, 1% de FBS et attachent à 4 voies robinet comme indiqué sur la figure 1B. </li><li> Attacher un vide 6 ml seringue à la position indiquée sur la 4 voies robinet (figure 1B). </li><li> Fixez port ouvert sur ​​la 4 voies robinet à cathéter (figure 1B). Attention à ne pas déloger le cathéter de la trachée. </li></ol></li><li> Recueillir le liquide de lavage des poumons. Remarque: Les chercheurs peuvent choisir d&#39;utiliser la baisse des volumes de liquide de lavage pour minimiser la possibilité de dommages aux tissus. Il est important que la même approche soit appliquée de façon uniforme dans tous les groupes de souris. <ol><li> Tournez la poignée sur le robinet si la seringue vide est fermé et injecter lentement ~ 1 ml DPBS, 1% de FBS pour gonfler les poumons. Observer l&#39;inflation du poumon à travers le trou percé à l&#39;étape 2.4. </li><li> Veillez à ne PAS surgonfler les poumons. </li><li> Tournez la poignée sur le robinet de sorte que la seringue pleine est fermé, et retirer soigneusement la grippe<html> Identifiant à partir des poumons. </li><li> Respecter les poumons se dégonflent à travers le trou découpé dans l&#39;étape 1.4. Le cathéter peut être nécessaire de déplacer légèrement vers l&#39;arrière ou vers l&#39;avant pour obtenir un bon tirage. Prendre des précautions particulières pour maintenir le cathéter dans la trachée. </li><li> Répétez les étapes 2.8.1-2.8.4 5-6x jusqu&#39;à ce que tout le DPBS, 1% de FBS a été injecté et retiré les poumons. Remarque: la récupération de liquide pulmonaire ne sera pas 100% de fluide injecté. </li></ol></li><li> Seringue vide avec un lavage d&#39;un fluide dans un tube conique de 50 ml. Maintenir les cellules à température ambiante. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante et verser le surnageant. Ceci peut être sauvegardé pour l&#39;analyse des cytokines, si désiré. </li><li> Remettre les cellules en 1-5 ml de RPMI 1640 avec 10% de FBS et compter sur un hématimètre. Chez la souris, non stimulé,&gt; 95% des cellules récoltées par BAL sont censés être des macrophages, qui peuvent être confirmés par cytologie. </li></ol> 3. Mise en culture et de récolte du champignon »&gt; L&#39;Aspergillus fumigatus utilisé dans ce protocole exprime la GFP à tous les stades de son cycle de vie:. Spores et des hyphes, germlings Cette souche fongique a été fourni par le Dr Margo Moore, de l&#39;Université Simon Fraser, Burnaby, BC, Canada. <ol><li> Plate conidies d&#39;une souche d&#39;Aspergillus fumigatus exprimant la GFP sur Sabouraud infusion cœur-cervelle (BHI) avec des pentes de gélose chloramphénicol (0,05 g / L) et de gentamicine (0,5 g / L). </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité bouchée non hermétiquement pendant 7 à 10 jours à température ambiante. </li><li> Récolte des conidies par lavage oblique avec 10 ml de 0,01% de Tween 20 dans du DPBS. Légèrement gratter le champignon avec le Stripette à desserrer. Rincer la pente à plusieurs reprises pour augmenter le rendement. </li><li> Passez suspension de conidies par un tamis cellulaire 100 um dans 50 ml conique. </li><li> Pellet conidies par centrifugation à 400 xg pendant 10 min. </li><li> Remettre en suspension dans 50 ml conidies DPBS et compte en utilisant un hématimètre. </li><li> Laver deux fois avec du DPBS et diluer à concentration souhaitéstration. </li></ol> 4. Défi fongique et la microscopie confocale Pour étudier le rôle de la NADPH oxydase dans les macrophages défense de l&#39;hôte, la capacité de macrophages alvéolaires isolés à partir de souris de trois génotypes pour contrôler la croissance des spores d&#39;Aspergillus phagocytés a été évaluée. Les génotypes utilisés dans cette étude sont les suivantes; 1) des souris de type sauvage, 2) Ncf1 * / * Mn-souris avec une mutation Ncf1 d&#39;origine naturelle (Ncf1 code pour p47phox, un composant nécessaire du oxydase phagocytaire de NADPH) en leur laissant la NADPH oxydase déficiente, et 3) Ncf1 * / * Mn + souris transgéniques (MN dénote hébergeant le transgène de type sauvage Ncf1 sous le contrôle du promoteur de CD68 humain) où l&#39;activité de la NADPH oxydase a été reconstitué dans la population de monocytes / macrophages 10, 11. La microscopie confocale est plus adapté pour ce dosage en raison de la présenceet la croissance des conidies non phagocyté sur les glissières. Le microscope confocal permet la visualisation de plans individuels au sein de l&#39;axe Z, et de permettre une différenciation entre un champignon croissant autour plutôt qu&#39;à l&#39;intérieur des macrophages. Toutes les images confocales sont acquises à l&#39;aide d&#39;une lentille 63X à immersion d&#39;huile. Z-piles sont acquises avec un facteur de zoom électronique de 2,5. L&#39;épaisseur d&#39;une pile en Z est déterminée à l&#39;aide du DAPI et les images de champ lumineux pour localiser le haut et le bas du champ. Z-piles allaient du 14 au 24 pm avec des tranches individuelles ~ 1 um d&#39;épaisseur. Pour la quantification des macrophages, des analyses simples de 1X zoom électronique ont été réalisées sur 10 champs par génotype. Macrophages intactes ont été identifiés sur la base de la coloration DAPI PKH26 et de la membrane et le noyau, respectivement. Les conidies ont été identifiés sur la base de l&#39;image de champ lumineux expression FITC et. <ol><li> Préparer des lamelles et des plaques stériles <ol><li> En vertu d&#39;une enceinte de sécurité biologique, faire tremper 22 x 22 mm lamelles de verre dans 70% ethanol pendant 5-10 min. </li><li> Rincer lamelles dans du PBS stérile. </li><li> En utilisant des pinces stériles, placer délicatement une seule lamelle dans le fond de chaque puits d&#39;un seul emballé plaque de 6 puits stérile. </li></ol></li><li> Graine ~ 1 x 10 6 récolté PKH26 étiqueté macrophages alvéolaires en suspension dans 300 ul de RPMI 1640, FBS à 10% sur chaque lamelle couvre-objet. Le nombre exact peut varier en fonction du rendement de la récolte. </li><li> Laisser macrophages adhèrent à incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant une nuit. </li><li> Le lendemain matin, ajouter environ 1 x 10 7 exprimant la GFP A. fumigatus conidies en suspension dans 100 ul préchauffé (37 ° C) du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS. </li><li> Plaque revenir à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2. </li><li> Les cellules doivent être fixées pour un minimum de 2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. A 3, 7, 14 h et les cellules de correctifs en ajoutant un volume égal de 2% de formaldéhyde dans chaque puits (concentration finale de 1% de formaldehyde). La place de plaques pour lapoints de temps au début à 4 ° C durant la nuit. Pour l&#39;instant final (14 h), fixer les cellules à température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Après fixation, retirez délicatement les lamelles à l&#39;aide des pinces et rincer dans du DPBS. </li><li> Éliminer le liquide en excès en mettant le bord de la lamelle couvre-objet sur un Kimwipe pliée. </li><li> Appliquer 6 fluorescence ul de milieu de montage avec DAPI à une lame de microscope en verre. </li><li> Placer un bord de la lamelle sur la lame et déposer délicatement avec le côté de la cellule vers le bas dans le milieu de montage. Milieu de montage se propage et former une couche uniforme sous la lamelle. Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;appuyer sur la lamelle. </li><li> Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Magasin préparé des diapositives dans une boîte de glissement (abri de la lumière) à la température ambiante jusqu&#39;au moment de l&#39;analyse par microscopie confocale. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

En utilisant cette approche ex vivo pour l&#39;analyse de l&#39;activité antifongique des macrophages avec challenge in vivo fongique, nous avons précédemment montré que la NADPH oxydase dans les macrophages jouent un rôle important dans la défense contre A. fumigatus 4. L&#39;utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous permet de mettre l&#39;accent sur ​​leur activité antifongique en l&#39;absence d&#39;autres cellules du système immunitaire (par exemple, les neutro...

Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des microbes inhalés. Macrophages reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance, ingèrent et limitent la croissance des spores inhalées (conidies), et d&#39;initier des réactions inflammatoires. La NADPH oxydase phagocytaire convertit l&#39;oxygène moléculaire en anion superoxyde et des intermédiaires réactifs de l&#39;oxygène en aval (ROI). Granulomatose chronique (CGD) est un trouble héréditaire de la NADPH oxydase caractérisée par des infections bactériennes et fongiques graves et par des réactions inflammatoires excessives. Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l&#39;hôte médiée par les neutrophiles 1 - 3, l&#39;importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n&#39;est pas bien définie. Des études antérieures ont montré que les macrophages alvéolaires ingèrent et tuent les spores d&#39;Aspergillus, alors que les neutrophiles principalement cibler le stade des hyphes 5. Cependant, il ya eu des résul contradictoirests sur le rôle de la NADPH oxydase dans les macrophages dans le contrôle de la croissance de A. fumigatus spores 6, 7. Le but de cette méthode était de délimiter le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l&#39;hôte contre A. spores fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores 4. Pour modéliser le plus à la réponse de l&#39;hôte aux champignons inhalés, nous avons utilisé les macrophages alvéolaires récoltés par lavage broncho-alvéolaire des souris non stimulées immédiatement après le sacrifice. L&#39;utilisation de macrophages alvéolaires isolés nous a permis de mettre l&#39;accent sur ​​leur activité antifongique en l&#39;absence d&#39;autres cellules du système immunitaire (par exemple, des neutrophiles recrutés) qui défendent contre Aspergillus in vivo. Dans ce procédé, les macrophages alvéolaires ont été colorées in vivo avant la récolte de manière à minimiser la quantité de manipulation post-récolte. &lt;/ P&gt; Un autre avantage de ce protocole est l&#39;utilisation d&#39;un A. exprimant la GFP souche fumigatus. Ce champignon exprime la GFP de la scène conidies par le stade des hyphes et n&#39;a pas besoin de plus d&#39;une coloration. Pour obtenir des images avec plus de détails, nous avons choisi la microscopie confocale, qui permet la reconstruction de structures en trois dimensions à partir des images obtenues. Reconstruction tridimensionnelle donne la possibilité de différencier les hyphes croissante autour plutôt que dans ou à travers un macrophage. Conidies peut aussi être précisément distingués comme intracellulaire contre extracellulaire.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Kit de liaison cellulaire fluorescent rouge pour le marquage général de la membrane cellulaire</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Utilisé pour fabriquer AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Utilisé pour fabriquer AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039 ; s Solution saline tamponnée au phosphate (sans calcium ni magnésium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Utilisé pour fabriquer un tampon de lyse des globules rouges ACK</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Utilisé pour fabriquer un tampon de lyse des globules rouges ACK</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Utilisé pour fabriquer un tampon de lyse des globules rouges ACK</td></tr><tr><td>22 G x 1,00 pouce i.v. cathéter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard</td></tr><tr><td>Seringues</td><td></td><td></td><td></td>d’insuline</tr> ailées <tr><td>de 6 ml Seringues robinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’arrêt à 4 voies</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Fil</td><td></td><td></td><td></td>de suture</tr><tr><td>50 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td>à centrifuger coniques</tr><tr><td>éponges de gaze (4 pouces carrés)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td>Hema 3 Stain</td><td>Set Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar avec chloramphénicol et gentamicine</td><td>obliques BD</td><td>297252</td> souche <<td></td></tr><tr><td>em>Aspergillus fumigatous exprimant une protéine</td><td></td><td></td> fluorescente verte <td>fournie par le Dr Margo Moore, Université Simon Fraser, Burnaby, BC, Canada</td></tr><tr><td>100 &mu ; m Croires à cellules</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>Pince</tr><tr><td>Armoire de sécurité biologique Classe II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Centrifugeuse avec rotor</td><td></td><td></td><td></td>à godets pivotants</tr><tr><td>Leica DM1000 Microscope</td><td></td><td></td><td></td>optique</tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td> de culture cellulaire <td>37 &deg ; C, 5 %&nbsp ; CO2</td></tr><tr><td>22 x 22 mm verre de protection micro</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>lamelles de recouvrement 6</td></tr><tr><td>puits Plaques de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10 % Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage Vectashield avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Système Leica TCS SP2 avec scanner de points laser</td><td></td><td></td><td>Monté sur microscope à fluorescence DMIRE2</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Le poumon est une interface où les cellules hôtes sont fréquemment exposés à des microbes et des produits microbiens. Les macrophages alvéolaires sont des cellules phagocytaires de première ligne qui rencontrent des champignons et d&#39;autres microbes inhalés. Macrophages et d&#39;autres cellules immunitaires reconnaissent motifs Aspergillus par pathogènes récepteurs de reconnaissance et d&#39;initier des réactions inflammatoires en aval. L&#39;oxydase phagocyte NADPH génère des intermédiaires réactifs de l&#39;oxygène (ROI) et est essentiel pour la défense de l&#39;hôte. Bien que la NADPH oxydase est essentiel pour la défense de l&#39;hôte médiée par les neutrophiles 1 - 3, l&#39;importance de la NADPH oxydase dans les macrophages n&#39;est pas bien définie. Le but de cette étude était de définir le rôle spécifique de la NADPH oxydase dans les macrophages dans la médiation de défense de l&#39;hôte contre A. fumigatus. Nous avons constaté que la NADPH oxydase dans les macrophages alvéolaires contrôle la croissance de A. phagocyté fumigatus spores 4. Ici, nous décrivons une méthode pour évaluer la capacité des souris unmacrophages lveolar (AMS) pour contrôler la croissance des spores d&#39;Aspergillus phagocytés (conidies). Les macrophages alvéolaires sont colorées in vivo et dix jours plus tard isolées à partir de souris par lavage broncho-alvéolaire (BAL). Les macrophages sont étalées sur des lamelles de verre, puis ensemencées avec la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant A. spores fumigatus. À des moments précis, les cellules sont fixées et le nombre de macrophages avec des spores intactes phagocytées est évaluée par microscopie confocale.

<html> Collecte des macrophages alvéolaires par BAL de souris non stimulés se traduira par une population pure à&gt; 95% sur la base de la cytologie. Le 3 et 7 h (Figure 2) points de temps précèdent le stade des hyphes de la croissance fongique et permettent une comparaison de l&#39;efficacité de phagocytose des conidies chez les génotypes. Le point de temps de 14 h est l&#39;endroit où les génotypes peuvent être comparées en ce qui concerne l&#39;aptitude à inhiber la transition de conidies phagocyté à ...

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d&#39;Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

L'objectif général de cette procédure est de comparer la capacité des macrophages à contrôler la croissance de Candida ceto fongique ex vivo. Cela est réalisé en marquant d'abord les macrophages alvéolaires in vivo avec un colorant lipophile PKH26. La deuxième étape de la procédure consiste à récupérer les macrophages alvéolaires des souris inoculées par lavage bronchoalvéolaire.La troisième étape consiste à cultiver et à recueillir les spores fongiques positives pour la GFP. Les étapes finales consistent à stimuler les macrophages avec des Candida positifs pour la GFP et des cellules fixées à des points temporels prédéterminés. En fin de compte, avec une manipulation cellulaire ex vivo minimale, la microscopie confocale peut révéler la capacité des macrophages alvéolaires à contrôler la croissance des éléments phagocytés.Spores Tout d'abord, diluez le colorant lipophile P HK 26, de 1 à cinq dans le diluant C ; le colorant sera capté par les cellules acides FOC. Chargez 100 microlitres du P HK 26 dilué dans une seringue d'un demi-centimètre cube et injectez le colorant par voie intraveineuse rétro-orbitaire ou par la veine de la queue.Estimez que chaque souris fournira de trois à 5

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Source : Barbero, A. M., et.al. Analyses de fluorescence pour l’étude de l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le récepteur immunitaire SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Cette vidéo présente un test basé sur la fluorescence pour étudier l’interaction entre un récepteur macrophage et les antigènes Mycobacterium tuberculosis . Les antigènes marqués fluorescentement sur une couche de couverture sont incubés avec des extraits de protéiques de macrophages, réticulés, marqués par anticorps, et...

Essai à base de fluorescence pour étudier les interactions des récepteurs des macrophages avec les antigènes bactériens

Cette vidéo présente l’imagerie de cellules vivantes pour l’analyse de l’activité antifongique dans les neutrophiles humains à l’aide de conidies rapporteures d’Aspergillus fluorescentes. Initialement, la fluorescence rouge et magenta est détectée dans les neutrophiles, tandis que la fluorescence rouge diminue avec le temps, indiquant la dégradation des conidies et confirmant l’activité antifongique des neutrophiles.

Évaluation en temps réel de l’activité antifongique des cellules immunitaires humaines primaires

Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes...

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Ici, nous démontrons comment cytométrie d'image peut être utilisé pour la quantification des champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes en culture. Cette technique peut être utilisée comme une alternative à la CFU énumération.

Utilisation de la cytométrie d&#39;image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

Nous décrivons ici un protocole pour évaluer l' activité antifongique des cellules immunitaires humaines primaires en temps réel en utilisant fluorescent Aspergillus reporter conidies conjointement avec la microscopie vidéo en direct de cellules et cytométrie de flux. Les données obtenues permettent de mieux comprendre les interactions Aspergillus niger hôtes telles que l' activité fongicide, la phagocytose, la migration cellulaire et l' inhibition de la croissance fongique.

Imagerie en direct de l&#39;activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em&gt; A. fumigatus</em

Cette communication décrit les méthodes d’isolement et culture des macrophages alvéolaires, des humains et des modèles murins à des fins expérimentales.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Nous décrivons une méthode pour traiter le liquide de lavage bronchoalveolar et le sang périphérique assorti des individus chroniquement HIV-infectés sur la thérapie antirétrovirale pour évaluer les réservoirs pulmonaires de HIV. Ces méthodes ont comme conséquence l'acquisition des cellules T cD4 très pures et des macrophages alvéolaires qui peuvent plus tard être employés pour l'immunophénotypage et les quantifications d'ADN/ARN de HIV par réaction en chaîne ultrasensible de polymérase.

Traitement du liquide de lavage bronchoalvéolaire et du sang apparié pour le macrophage alvéolaire et le CD4- Immunophénotypage à cellules T et évaluation du réservoir du VIH

Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour mesurer quantitativement la phagocytose d'Aspergillus fumigatus conidia par les phagocytes primaires humains utilisant la cytométrie de flux et pour discriminer la phagocytose des conidies de la simple adhérence aux leucocytes.

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Nous décrivons la méthode d’analyse quantitative de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus (taille de 3 μm) dans les voies respiratoires de souris. La méthode peut également être utilisée pour l’analyse de la distribution des microparticules et des agglomérats de nanoparticules dans les voies respiratoires dans divers modèles d’état pathologique.

Analyse quantitative basée sur la microscopie confocale à balayage laser de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus dans le poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier

La technique impliquant la phagocytose des conidies fongiques par les macrophages est largement utilisée pour les études évaluant la modulation des réponses immunitaires contre les champignons. L’objectif de ce manuscrit est de présenter une méthode d’évaluation de la phagocytose et des capacités de clairance des macrophages dérivés de mononucléaires du sang périphérique humain stimulés par des conidies de Trichoderma stromaticum .

Essai de viabilité des conidies de Trichoderma stromaticum à l’intérieur des macrophages dérivés de mononucléaires du sang périphérique humain

Découvrez une méthode d'évaluation de l'activité anti-fongique des macrophages alvéolaires isolés par microscopie confocale. Cette technique permet d'étudier le contrôle de la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées.

Évaluation de l'activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

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