Name: Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène dun gène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Apprenez le test de formation de foci pour évaluer le potentiel oncogène d'un gène en utilisant des cellules NIH 3T3 et des rétrovirus. Cette méthode permet de quantifier la croissance indépendante de la densité cellulaire.

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Ce travail a été financé par une subvention du Programme de bourse de nouveau Innovateur du directeur des NIH (ED). AA a été financé en partie par des prix de premier cycle de l&#39;Institut national du cancer et la Fondation nationale des sciences.

1. Faire les vecteurs viraux Les séquences codant pour le gène d&#39;intérêt, ainsi que des contrôles positifs et négatifs, sont insérés dans pBabePuro par des méthodes traditionnelles de clonage (amplification par PCR, digestion par restriction et ligature). Il ya quatre sites de restriction sur le vecteur où l&#39;ADN peut être inséré: BamHI, SnaBI, EcoRI et Sali. <ol><li> Préparer transfection qualité plasmide ADN provenant de cellules compétentes en utilisant le kit de plasmide QIAGEN midi. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop2000. </li></ol> 2. rétrovirus production La lignée cellulaire d&#39;encapsidation Plat-E est utilisé pour produire des retrovirus écotrope qui fournira l&#39;ADNc d&#39;intérêt à des cellules NIH 3T3. <ol><li> Établir Plat-E cultures de cellules congelées <ol><li> Dégeler rapidement les cellules Plat-E dans une ° C bain d&#39;eau 37 et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter lentement 9 ml de milieu Plat-E (Dumilieu de Eagle modifié lbecco (DMEM) + 10% de sérum bovin fœtal (FBS) + pénicilline et streptomycine). </li><li> Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu et de transfert Plat-E pour une boîte de culture de 10 cm. </li><li> Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur jusqu&#39;à ce qu&#39;elles soient confluentes à 80-90% (environ 2 jours). </li></ol></li><li> Fractionnement cellulaire <ol><li> Aspirer le milieu et laver les cellules une fois avec PBS. </li><li> Ajouter 2 ml de 0,05% de trypsine-EDTA et incuber pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Détacher les cellules par tapotement des doigts, ajouter 10 ml de milieu Plat-E, et transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml. </li><li> Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant. </li><li> Reprendre les cellules avec 10 ml de milieu Plat-E et semences dans de nouveaux plats au 1: 4-1: 6 dilutions. </li></ol></li><li> Plat-E semis et transfection <ol><li> Graine 2 x 10 6cellules par boîte de culture de 10 cm en utilisant un milieu Plat-E sans antibiotiques. </li><li> Incuber les cellules O / N dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Le lendemain, transférer 300 pi d&#39;Opti-MEM dans 1,5 ml tube de centrifugeuse. </li><li> Ajouter 27 ul de polyéthylènimine (PEI), un réactif de transfection rentable 12, au tube préparé avec Opti-MEM. Mélanger doucement par tapotement des doigts et incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 9 pg d&#39;ADN plasmidique transfection de qualité dans le tube Opti-MEM / PEI, mélanger doucement au vortex et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter l&#39;ADN / PEI goutte à goutte complexe dans le plat Plat-E, et incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain, aspirer le milieu contenant le réactif de transfection et ajouter 10 ml de milieu Plat-E frais (sans antibiotiques). </li><li> Remettre les cellules dans l&#39;incubateur. </li></ol></li></ol> 3. Les cellules NIH 3T3 et les infections <ol><li> Établir NIHCultures et Semis 3T3 <ol><li> Décongeler rapidement des cellules NIH 3T3 ° C dans un bain d&#39;eau 37 et les transférer à un tube de 15 ml. Ajouter lentement 9 ml de milieu NIH 3T3 (DMEM + 10% de FBS). </li><li> Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu et NIH 3T3 transfert à une boîte de culture de 10 cm. </li><li> Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Il est très important que les cellules NIH 3T3 sont toujours maintenus underconfluent (50-60%), comme la fréquence de transformation spontanée (et donc les niveaux basaux de formation de foyers) augmente une fois par culture atteint la confluence. </li><li> Seed 3 x 10 5 cellules par boîte de 10 cm et incuber O / N de l&#39;infection le lendemain. </li></ol></li><li> Infection <ol><li> Récolter le surnageant retroviral de la boîte Plat-E en utilisant une seringue jetable de 10 ml, en le filtrant à travers un filtre en nylon de taille de la membrane de 0,45 um de pores, et en le transférant dans un 15 mltube. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu Plat-E frais aux cellules (sans antibiotiques), et les retourner à l&#39;incubateur. </li><li> Aspirer le milieu de l&#39;antenne cellulaire NIH 3T3 d&#39;être infectés, et ajouter 5 ml de milieu régulière NIH 3T3 et 5 ml de surnageant filtré contenant le virus. </li><li> Ajouter à la boîte de polybrène à une concentration de 6 ug / ml. </li><li> Incuber les cellules O / N à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Le jour suivant, répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.5 pour un second tour de l&#39;infection. </li><li> Remplacez le support contenant le virus avec un milieu régulière NIH 3T3. </li><li> Laisser les cellules NIH 3T3 à croître pendant 2-3 semaines, en remplaçant le milieu, si nécessaire. Vérifier expression de la protéine d&#39;intérêt par électrophorèse des protéines classique et immunoblot des lysats de cellules entières de plaques de réplique. </li></ol></li></ol> 4. coloration et quantification <ol><li> Coloration au cristal violet <ol><li> Aspirer le milieu NIH 3T3 et placez les platssur la glace. </li><li> Laver les plats deux fois avec PBS glacé. </li><li> Fixer les cellules avec du méthanol glacé pendant 10 min. </li><li> Retirez les plats de la glace, aspirer le méthanol, et ajouter 3 ml de solution de cristal violet à 0,5% réalisés dans 25% de méthanol (RT). </li><li> Incuber les boîtes pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution de cristal violet et rincer soigneusement le plat avec Milli-Q H 2 O jusqu&#39;au pas de couleur se détache dans le rinçage. </li><li> Les laisser sécher O / N sur une paillasse (découverts). </li></ol></li><li> Foci Quantification <ol><li> Une fois les plats sont à sec, utiliser une règle pour mesurer les collections de couleur sombre de cellules sur la plaque. Ne compter que ceux qui sont plus de 5 mm de diamètre comme «foyers». Notez le nombre de foyers et de calculer des moyennes et de l&#39;importance par rapport aux contrôles. </li></ol></li></ol>

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<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

La FFA fournit une méthode rapide et facile pour évaluer la transformation maligne in vitro. Il se prête à la projection d&#39;un nombre relativement important de gènes candidats, et ses exigences techniques modestes rendre rentable. En outre, deux ou plusieurs gènes peuvent être co-exprimés (parfois appelé un dosage &quot;coopération&quot;) pour évaluer le potentiel tumorigène de la combinaison. Les avantages de ce test se appuient sur sa technique simple, sa facilité de quantification et de sa relativement co...

Les cellules tumorales peuvent être distingués de leurs homologues normales par un large éventail de modifications, de profils d&#39;expression génique pour Epigenomics à des changements morphologiques et proliferatives. Parmi ces derniers, réduction de la dépendance sur le sérum, la perte de contact (densité) l&#39;inhibition, l&#39;acquisition de la prolifération indépendante de l&#39;ancrage et, finalement, la capacité de former des tumeurs lorsqu&#39;elles sont injectées dans les animaux sont des indicateurs utiles, mesurables de transformation maligne 3. Plusieurs in vitro et in vivo ont été développés pour une transformation cellulaire. Les essais in vitro pour but d&#39;identifier et de mesurer des changements dans la morphologie de culture (test de formation de mise au point), la dynamique de culture (taux de croissance, la densité de saturation) et le facteur de croissance (croissance en sérum réduite) ou un mouillage (croissance dans la gélose molle) exigences. La méthode de référence pour la détermination de la nature maligne d&#39;un type de cellule reste la formation de tumeurs (les xénogreffes) chez les animaux expérimentaux. Cependant, til a coûté et la longueur des études in vivo ne font pas toujours les justifier comme une première étape de validation ou de dépistage des oncogènes candidats. Bien qu&#39;aucun essai in vitro fournit une évaluation précise du potentiel oncogène d&#39;un gène, ils ne donnent un aperçu de potentiel oncogène qui peuvent affiner l&#39;avenir des études in vivo. L&#39;un des systèmes les plus utilisés pour l&#39;évaluation du potentiel oncogénique in vitro est la Focus Formation Assay 2. Cette approche repose sur l&#39;utilisation de fibroblastes de souris NIH 3T3, une lignée cellulaire non transformée qui montre une forte inhibition de contact. Surexpression d&#39;un oncogène résultats en perte de croissance dépendante de la densité; les cellules transformées peuvent ensuite se développer dans des couches multiples, formant &quot;foyers&quot;, facilement visualisés contre la monocouche de cellules non transformées fond. La mise au point Formation Assay, puis, mesure la capacité d&#39;un oncogène candidat à induire une transformation maligne, comme le montre la perte de contact inhibition comme un phénotype mesurable. La FFA a été utilisée pour évaluer la transformation par la surexpression de protéines kinases (par exemple Src 4, BRAF 5), des facteurs de transcription (par exemple, N-myc 6) récepteurs, G couplés à la protéine (par exemple, P2RY8 7) et GTPases (par exemple, , Ras 1), entre autres. La relative facilité de ce test, il est un bon choix qui fournira une réponse rapide et visuellement évident de savoir si la surexpression du gène est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes de souris NIH 3T3 in vitro. La FFA décrit dans le présent protocole utilise la lignée cellulaire d&#39;encapsidation Plat-E 8, qui fournit les protéines virales d&#39;emballage, et le vecteur rétroviral 9 pBabePuro (Addgene plasmidique 1764) pour produire des retrovirus. Après la transfection avec la construction d&#39;pBabePuro contenant le gène d&#39;intérêt, la lignée cellulaire Plat-E produira retrovirus écotrope qui peut être utilisé pour infecter des cellules NIH 3T3. Tsa méthode virale de la livraison de gènes est plus efficace que les méthodes de transfection chimique traditionnels et offre un moyen d&#39;exprimer le gène 10 durable. Une fois incorporé dans le génome de cellules NIH 3T3, la surexpression du gène d&#39;intérêt est entraîné par le virus de longues répétitions terminales (LTR), le promoteur 11. Cette expression constante peut être utilisée pour déterminer si le gène d&#39;intérêt a une activité oncogène, tel que mesuré par la formation de foyers sur les cellules NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>Vecteur pBABE-puro</td><td>Addgene</td><td>Plasmide 1764</td><td>vecteur de clonage</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire d’emballage rétroviral platine-E, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>Lignée cellulaire RV-101</td><td>pour la production virale</td></tr><tr><td>NIH 3T3 Lignée cellulaire murine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>pour le test de formation de foyer</td></tr><tr><td>10 ml BD Seringue à embout Luer-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>réactif de production virale</td></tr><tr><td>0,45 &mu ; m Puradisc Seringue Filtre</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>réactif de production virale</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>réactif de transfection cellulaire</td></tr><tr><td>Polybrène Réactif d’infection / transfection</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>réactif de transfection cellulaire</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>réactif de coloration cellulaire</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>purification du plasmide</td></tr><tr><td>BD Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Fournitures de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>fournitures de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum</td><td>Medium Gibco</td><td>31985-062</td><td>milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>milieu de culture cellulaire</td></tr></tbody></table>

concentrez formation: un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d&#39;un gène

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

La transformation maligne des cellules est généralement associée à une prolifération accrue, à une perte d’inhibition du contact, à l’acquisition d’un potentiel de croissance indépendant de l’ancrage et à la capacité de former des tumeurs chez les animaux de laboratoire1. Dans les cellules NIH 3T3, la voie de transduction du signal Ras est connue pour déclencher bon nombre de ces événements, ce que l’on appelle la transformation Ras. L’introduction d’un gène surexprimé dans les cellules NIH 3T3 peut favoriser la transformation morphologique et la perte d’inhibition de contact, ce qui peut aider à déterminer le potentiel oncogénique de ce gène d’intérêt. Un test qui fournit une méthode simple pour évaluer un aspect du potentiel de transformation d’un oncogène est le Focus Formation Assay (FFA)2. Lorsque les cellules NIH 3T3 se divisent normalement en culture, elles le font jusqu’à ce qu’elles atteignent une monocouche confluente. Cependant, en présence d’un oncogène surexprimé, ces cellules peuvent commencer à se développer en foyers1 denses et multicouches qui peuvent être visualisés et quantifiés par coloration en violet cristallin ou en Hema 3. Dans cet article, nous décrivons le protocole FFA avec transduction rétrovirale du gène d’intérêt dans les cellules NIH 3T3, et comment quantifier le nombre de foyers par coloration. La transduction rétrovirale offre une méthode d’administration de gènes plus efficace que la transfection, et l’utilisation d’un rétrovirus murin écotrope fournit un contrôle de biosécurité lors de l’utilisation d’oncogènes humains potentiels.

MXD3 est une base hélice-boucle-hélice leucine fermeture à glissière (bHLHZ) facteur de transcription qui est un membre de la MYC / MAX / MAD réseau. Ce est un membre de la famille atypique de MAD 13 à 15, et il a été rapporté d&#39;être impliqués dans la carcinogenèse 16,17. Par rapport à pBabePuro (contrôle négatif) et MYC (contrôle positif), les plats NIH 3T3 où MXD3 a été surexprimé avaient significativement moins foyers (figure 1A). Les données de la figure 1B...

Le dosage Focus Formation fournit une méthode simple pour évaluer le potentiel de transformation d&#39;un oncogène candidat.

Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d&#39;un gène

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser le test de formation de foyers dans des lignées cellulaires de fibroblastes de souris, en utilisant un rétrovirus pour déterminer le potentiel oncogène d'un gène. Cela est réalisé en premier lieu en clonant la séquence du gène d'intérêt dans un vecteur rétroviral. La deuxième étape consiste à produire des particules rétrovirales à l'aide du vecteur viral et de cellules d'emballage PLA e.Ensuite, le rétrovirus est utilisé pour infecter des cellules de fibroblastes murins NIH trois T trois afin d'évaluer le potentiel transformant du gène d'intérêt. La dernière étape consiste à laisser les cellules NIH trois T trois se diviser pendant deux à trois semaines, suivie d'une coloration au violet de crésyl pour quantifier le nombre de foyers formés. En définitive, le test de formation de foyers permet de déterminer si la surexpression d'un gène d'intérêt est suffisante pour induire une croissance indépendante de la densité dans des cellules de fibroblastes murins.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, comme le dépistage du potentiel oncogénique d'un gène. Pour commencer, prépare

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La formation de dosage souple Agar Colony

L’identification de nouvelles cibles médicamenteuses qui passent des essais précliniques aux essais sur l’homme est une priorité scientifique. À cette fin, nous décrivons ici une approche de génomique fonctionnelle pour examiner l’impact de l’appauvrissement des gènes sur les sphéroïdes des lignées cellulaires cancéreuses, qui modélisent de manière plus appropriée les cancers humains in vivo.

Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

Nous décrivons ici les protocoles de validation chimique et génétique de c-Fos et Dusp1 comme cible de drogue dans la leucémie à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo de génétique et humanisé. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.

Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

Ce protocole décrit une méthode reproductible pour l'isolement des cellules primaires de rhabdomyosarcoma de souris, de la formation et du traitement de la tumorsphere, et de la transplantation d'allogreffe commençant des cultures de tumorspheres.

Dérivation et traitement de la tumorale à partir de cellules tumorales primaires isolées de la souris Rhabdomyosarcomas

Ce protocole expérimental offre une méthode stable, rentable et efficace qui combine le knockdown de l’ARNnc avec des tests formant des colonies afin de quantifier l’effet de l’ARNnc sur la prolifération cellulaire de l’ostéosarcome.

Essai de formation de colonie détectant la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome à élimination d’ARNCn

Apprenez le test de formation de foci pour évaluer le potentiel oncogène d'un gène en utilisant des cellules NIH 3T3 et des rétrovirus. Cette méthode permet de quantifier la croissance indépendante de la densité cellulaire.

Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d'un gène

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