Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d'un gène

L'objectif général de cette procédure est de réaliser le test de formation de foyers dans des lignées cellulaires de fibroblastes de souris, en utilisant un rétrovirus pour déterminer le potentiel oncogène d'un gène. Cela est réalisé en premier lieu en clonant la séquence du gène d'intérêt dans un vecteur rétroviral. La deuxième étape consiste à produire des particules rétrovirales à l'aide du vecteur viral et de cellules d'emballage PLA e.

Ensuite, le rétrovirus est utilisé pour infecter des cellules de fibroblastes murins NIH trois T trois afin d'évaluer le potentiel transformant du gène d'intérêt. La dernière étape consiste à laisser les cellules NIH trois T trois se diviser pendant deux à trois semaines, suivie d'une coloration au violet de crésyl pour quantifier le nombre de foyers formés. En définitive, le test de formation de foyers permet de déterminer si la surexpression d'un gène d'intérêt est suffisante pour induire une croissance indépendante de la densité dans des cellules de fibroblastes murins.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, comme le dépistage du potentiel oncogénique d'un gène. Pour commencer, préparez le vecteur viral tel que décrit dans le protocole écrit. Ensuite, établissez des cultures de cellules plat E à partir de cellules congelées en décongelant rapidement les cellules plat E dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius, puis transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajouter lentement neuf millilitres de milieu E contenant du PLA dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 180 ×g pendant cinq minutes, puis jeter le surnageant. Resuspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu E pour plaques, puis transférer dans une boîte de culture de 10 centimètres.

Incuber ensuite les cellules dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence comprise entre 80 et 90 %. Réaliser le fractionnement des cellules en aspirant d'abord le milieu, puis laver les cellules une fois avec du PBS avant d'ajouter deux millilitres de trypsine 0,05 % EDTA et d'incuber pendant une minute à température ambiante ; détacher les cellules par de légers tapotements avec les doigts. Ajouter ensuite 10 millilitres de milieu pour plaque E et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Centrifuger le tube comme précédemment et resuspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu plat E. Ensuite, ensemencer 2 millions de cellules par boîte de culture de 10 centimètres en utilisant le milieu plat E sans antibiotiques et laisser les cellules incuber toute la nuit. Le jour suivant, transférer 300 microlitres d'optimum dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Ajouter 27 microlitres d'amines polyéthylènes au tube préparé contenant Optum. Mélanger doucement en tapotant du doigt et incuber cinq minutes à température ambiante. Ensuite, ajouter neuf microgrammes d'ADN plasmidique de qualité pour transfection dans le tube, mélanger doucement par vortexage et incuber 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajouter le mélange goutte à goutte dans la boîte de Pétri avant une incubation nocturne. Le jour suivant, aspirer le milieu contenant le réactif de transfection et ajouter 10 millilitres de milieu frais pour boîte de Pétri avant de replacer les cellules dans l'incubateur afin d'établir des cultures de NIH trois T trois. Dans un premier temps, décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et les transférer dans un tube de 15 millilitres.

Ajouter lentement neuf millilitres de milieu NIH trois, T trois aux cellules, centrifuger le tube à 180 ×g pendant cinq minutes et éliminer le surnageant. Resuspendre ensuite les cellules dans 10 millilitres de milieu NIH trois, T trois, puis transférer dans une boîte de culture de 10 centimètres. Incuber les cellules dans une étuve à 37 °C et 5 % CO₂, en les maintenant en dessous de la confluence car la fréquence de transformation spontanée augmente ainsi.

Une fois que la culture atteint une confluence, après avoir cultivé trois fois 10 à la puissance cinq cellules NIH 3T3 par boîte de 10 centimètres, incuber toute la nuit en vue d'une infection le lendemain. Le jour suivant, récolter le surnageant rétroviral à partir de la boîte Plat E à l’aide d’une seringue jetable de 10 millilitres, le filtrer à travers un filtre en membrane de nylon de 0,45 micron de taille de pore, puis le transférer dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 10 millilitres de milieu frais pour Plat E aux cellules avant de les remettre dans l’incubateur.

Ensuite, aspirez le milieu du plat de cellules NIH 3T3 à infecter et ajoutez cinq millilitres de milieu régulier NIH 3T3 et cinq millilitres de surnageant filtré contenant le virus. Ajoutez ensuite de la polybrene au plat. Ajoutez une concentration de six microgrammes par millilitre.

Incuber les cellules toute la nuit avant de répéter les étapes d'infestation pour un deuxième cycle d'infection. Après l'infection, remplacer le virus par le milieu IH trois T trois standard. Laisser les cellules IH trois T trois se développer pendant deux à trois jours, en renouvelant le milieu selon les besoins pour la coloration au violet de méthyle.

Aspirez le milieu NIH trois T trois et placez les boîtes sur de la glace. Rincez les boîtes deux fois avec du PBS glacé. Fixez les cellules avec du méthanol glacé pendant 10 minutes.

Ensuite, retirez les boîtes de la glace et aspirez le méthanol. Ajoutez trois millilitres de solution de violet de crésyl à 0,5 % préparée dans du méthanol à 25 % et incubez les boîtes pendant cinq minutes à température ambiante. Après l'incubation, aspirez la solution de violet de crésyl et rincez soigneusement la boîte avec de l'eau Milli Q jusqu'à ce que plus aucune couleur ne s'élimine lors du rinçage.

Laisser sécher les boîtes découvertes toute la nuit sur un plan de travail. Une fois les boîtes sèches, utiliser une règle pour mesurer les foyers et compter ceux dont le diamètre est supérieur à cinq millimètres. Le nombre MXD trois est un facteur de transcription à motif hélice-boucle-hélice et fermeture éclair de leucine, qui est un membre atypique de la famille MAD, et il a été signalé comme étant impliqué dans la carcinogenèse par rapport au témoin négatif et au témoin positif.

Les boîtes de culture NIH trois T trois où MXD trois était surexprimé présentaient significativement moins de foyers. Les données ont été recueillies à partir de plusieurs expériences afin de déterminer la significativité, et les mêmes tendances ont été observées dans cet essai. Les résultats suggèrent que MXD trois ne fonctionne pas comme un oncogène suite à cette procédure.

D'autres méthodes, telles que le test de formation de foyers avec des combinaisons de gènes, la prolifération en gélose molle et l'analyse du cycle cellulaire, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires pour évaluer le rôle d'un gène d'intérêt dans la pathogenèse de l'oncogenèse.