Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d'un gène

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer le test de formation de foyer dans des lignées cellulaires de fibroblastes de souris, en utilisant un rétrovirus pour déterminer le potentiel oncogénique d’un gène. Pour ce faire, on clone d’abord la séquence du gène d’intérêt dans un vecteur rétroviral. La deuxième étape consiste à produire des particules rétrovirales à l’aide du vecteur viral et des cellules d’emballage PLA e.

Ensuite, le rétrovirus est utilisé pour infecter les cellules fibroblastiques de souris NIH trois T afin d’évaluer le potentiel de transformation du gène d’intérêt. La dernière étape consiste à permettre aux trois cellules T du NIH de se diviser pendant deux à trois semaines, suivies d’une coloration violette cristalline pour quantifier le nombre de foyers formés. En fin de compte, le test de formation de foyer est utilisé pour montrer si la surexpression d’un gène d’intérêt est suffisante pour induire une croissance indépendante de la densité dans les cellules de fibroblastes de souris.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, telles que le dépistage du potentiel oncogénique d’un gène. Pour commencer, créez le vecteur viral comme décrit dans le protocole texte. Ensuite, établissez des cultures de plaque E à partir de cellules congelées en décongelant rapidement les cellules de la plaque E dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius, puis en les transférant dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajoutez lentement neuf millilitres de PLA E medium dans le tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube à 180 fois G pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension avec 10 millilitres de milieu plat E et transférez-les dans une boîte de culture de 10 centimètres.

Ensuite, incubez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles soient entre 80 et 90 % de confluent. Effectuez la division des cellules en aspirant d’abord le milieu, puis lavez les cellules une fois avec du PBS avant d’ajouter deux millilitres de 0,05 % de tripsin EDTA et d’incuber pendant une minute à température ambiante, détachez les cellules en tapotant avec les doigts. Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu plat E et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Centrifugez le tube comme précédemment et remettez les cellules en suspension avec 10 millilitres de milieu plat E. Ensuite, ensemencez 2 millions de cellules par boîte de culture de 10 centimètres en utilisant le plat E milieu sans aucun antibiotique et laissez les cellules incuber pendant la nuit. Le lendemain, transférez 300 microlitres d’optimum dans un microtube de 1,5 millilitre.

Ajoutez 27 microlitres de polyéthylène amine dans le tube préparé avec Optum. Mélangez doucement en tapotant avec les doigts et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez neuf microgrammes d’ADN plasmidique de qualité transfection dans le tube mélangé doucement par vortex et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.

Ajoutez ensuite le mélange goutte à goutte dans le plat E avant d’incuber pendant la nuit. Le lendemain, aspirez le milieu contenant le réactif de transfection et ajoutez 10 millilitres de milieu frais plat E avant de retourner les cellules dans l’incubateur pour établir NIH trois T trois cultures. Tout d’abord, décongelez rapidement les cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et transférez-les dans un tube de 15 millilitres.

Ajoutez lentement neuf millilitres de milieu NIH trois, T trois dans les cellules, centrifugez le tube à 180 fois G pendant cinq minutes et jetez le snat. Ensuite, mettez les cellules en suspension avec 10 millilitres de milieu NIH trois, T trois et transférez-les dans une boîte de culture de 10 centimètres. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius 5 % de CO2, en les maintenant sous confluent à mesure que la fréquence de la transformation spontanée augmente.

Une fois qu’une culture atteint la co-fluidité, une fois cultivée, grainez trois fois 10 à la cinquième nih, trois T trois cellules par boîte de 10 centimètres et incubez toute la nuit pour l’infection le lendemain. Le lendemain, récoltez le surnageant rétroviral de la parabole à l’aide d’une seringue jetable de 10 millilitres, en le filtrant à travers un filtre à membrane en nylon de 0,45 micron et en le transférant dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de milieu plat E frais aux cellules avant de les remettre dans l’incubateur.

Ensuite, aspirez le milieu de la boîte NIH trois T trois cellules à infecter et ajoutez cinq millilitres de milieu NI H trois, T trois et cinq millilitres de surnageant filtré contenant un virus. Ensuite, ajoutez du poly brain dans le plat. Ajouter une concentration de six microgrammes par millilitre.

Incuber les cellules pendant la nuit avant de répéter les étapes de l’infection pour une deuxième série d’infection. Après l’infection, remplacer le virus, contenir le milieu par un milieu régulier IH trois T trois. Laissez les cellules IH trois T trois se développer pendant deux à trois, en remplaçant le milieu si nécessaire pour la coloration violette cristalline.

Aspirez le milieu NIH trois T trois et placez la vaisselle sur de la glace. Lavez la vaisselle deux fois avec du PBS glacé. Fixez les cellules avec du méthanol glacé pendant 10 minutes.

Retirez ensuite la vaisselle de la glace et aspirez le méthanol. Ajoutez trois millilitres de solution cristalline de violet à 0,5 % de méthanol et incubez les plats pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’incubation, aspirez la solution de violet cristallin et rincez soigneusement le plat avec de l’eau Milli Q jusqu’à ce qu’aucune couleur ne se détache dans le rinçage.

Laissez la vaisselle sécher à découvert pendant la nuit sur un plan de travail. Une fois que la vaisselle est sèche, utilisez une règle pour mesurer les foyers et comptez ceux qui ont plus de cinq millimètres de diamètre. Le nombre MXD trois est un facteur de transcription de base de la boucle d’hélice hélice leucine qui est un membre atypique de la famille MAD, et il a été rapporté qu’il est impliqué dans la cancérogenèse par rapport au contrôle négatif et au contrôle positif.

Les trois paraboles NIH trois T où MXD trois était surexprimé avaient significativement moins de foyers. Les données ont été recueillies à partir de plusieurs expériences pour déterminer la signification et les mêmes tendances ont été observées à partir de cet essai. Les résultats suggèrent que MXD trois ne fonctionne pas comme un oncogène à la suite de cette procédure.

D’autres méthodes telles que le test de formation de foyer avec des combinaisons de gènes, la croissance dans la prolifération de la tarière molle et l’analyse du cycle cellulaire peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires pour évaluer le rôle d’un gène d’intérêt dans la pathogenèse de l’oncogenèse.