Appartement Mont imagerie de la peau de souris et son application à l'analyse des follicules pileux Modélisation et sensorielle Axon Morphologie

L'objectif général de cette procédure est de visualiser intégralement des structures cutanées telles que les follicules pileux et les terminaisons nerveuses, sans découper physiquement l'échantillon. Cette visualisation est réalisée en prélevant d'abord la peau de différentes régions du corps, notamment le dos, la patte postérieure et la queue. La deuxième étape consiste à aplatir et nettoyer les échantillons de peau.

Ensuite, les échantillons de peau sont soumis à une fixation appropriée. La dernière étape consiste à réaliser une immunomarquage ou une histochimie sur les échantillons de peau. Enfin, une imagerie à l’aide d’un microscope stéréo ou confocal est utilisée pour visualiser la géométrie des différentes structures cutanées.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la préparation de montages hormonaux épidermiques, est qu'elle peut être appliquée à la peau située à n'importe quel endroit du corps et ne nécessite pas la séparation de l'épiderme du derme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans l'étude de la polarité cellulaire plantaire. Étant donné que la géométrie bidimensionnelle de la peau et la disposition inhabituelle des follicules pileux en font un système idéal pour étudier ce processus, cette méthode ne permet pas seulement d'obtenir des informations sur la polarité cellulaire végétale, mais peut également être utilisée pour étudier d'autres aspects du développement cutané, tels que la définition des types de neurones somatosensitifs grâce à la visualisation directe des interactions individuelles sur les morphologies supérieures.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la dissection de la peau de certaines régions, comme les pieds et la queue, est difficile à apprendre ; il est important de l’aplatir parfaitement tout en évitant les plis et les étirements excessifs. Dans cette démonstration, la peau dorsale sera prélevée sur trois souris sacrifiées par inhalation d’isoflurane. À l’aide de lames, effectuez une incision horizontale à la base de la queue le long de chaque flanc, en passant sur le côté dorsal de la base de chaque membre, puis latéralement vers les oreilles, et terminez au niveau du nez.

Détacher délicatement la peau du tissu sous-jacent en progressant de l'arrière vers l'avant, en tenant la peau entre les doigts gantés afin qu'elle ne soit pas pincée par la pince. Lors du décollement de la peau au niveau des oreilles, couper d'abord les oreilles à l'aide d'une paire de ciseaux et procéder particulièrement lentement, car la peau peut se déchirer à cet endroit. À partir de ce stade, positionner la peau avec la face interne vers le haut.

Épingler la peau sur le S Guard à l'aide d'environ 20 épingles à insectes réparties uniformément autour de la périphérie. Ne pas trop tendre la peau. Recouvrir la peau de 10 à 20 millilitres de PBS à l'aide de pinces angulaires ou courbes.

Disséquez la graisse et les tissus conjonctifs associés à la peau. Orientez l'extrémité pointue de la pince horizontalement afin de minimiser le risque qu'elle pénètre la peau. Expulsez toutes les bulles d'air piégées sous la peau en faisant doucement rouler un applicateur en coton sur la surface cutanée.

L'étape suivante consiste à fixer l'épiderme. Si l'épiderme doit être utilisé pour l'imagerie de la mélanine ou pour l'histochimie de la phosphatase alcaline, ajouter 20 millilitres par plaque à cigare de 10 centimètres de PFA à 4 % fraîchement préparé dans du PBS ou de formol tamponné à 10 %. Si l'épiderme doit être utilisé pour une immunohistochimie ou la visualisation d'une kératine transgénique, KRT 17 GFP, ajouter 20 millilitres par plaque de 10 centimètres de PFA à 2 % fraîchement préparé dans du PBS, puis agiter doucement toute la nuit dans une chambre froide ; le jour suivant, rincer dans du PBS pendant plus de 10 minutes.

La procédure d'histochimie de la phosphatase alcaline ne sera pas démontrée dans cette vidéo. Pour l'imagerie de la mélanine, déshydratez la peau à l'aide d'une série éthanolique progressive pendant un jour à chaque étape, avec une rotation horizontale douce à température ambiante. Trois jours plus tard, éliminez les tissus conjonctifs résiduels de la peau déshydratée en plaçant la peau dans de l'éthanol à 100 %.

Retirez les épingles à insectes et transférez la peau dans une coupelle en verre de 10 centimètres de diamètre. Pour la réussite de cette procédure, l'échantillon de peau doit être prélevé en un seul morceau intact et aplati parfaitement. Placez deux lames de microscope en verre sur la peau pour l'aplatir et l'empêcher de se recourber.

Ajoutez 20 millilitres de benzoate de benzyle et d’alcool benzoïque, ou BBBA, qui durcira rapidement les tissus au cours des heures suivantes. Soulevez les lamelles de la peau pendant quelques secondes afin de permettre au BBBA de recouvrir la peau. La peau des pieds destinée à l’analyse du modèle des follicules pileux est généralement disséquée chez des animaux de P1 à P8. Après euthanasie, découpez les pieds au-dessus de l’articulation de la cheville et effectuez une incision droite unique le long de la surface ventrale à travers les plantes des pieds.

Détacher délicatement la peau du tissu sous-jacent en progressant du proximal vers le distal. Couper les doigts pour libérer la peau et épingler celle-ci sur du liège, la surface interne tournée vers le haut. Il y a peu de tissu conjonctif au niveau du pied.

Peau transgénique. La peau KRT17 GFP est désormais prête à être imagée pour l'imagerie de la mélanine. Fixer et traiter la peau comme indiqué précédemment pour la peau dorsale. Après l'euthanasie de l'animal P21, retirer les poils en appliquant un dépilatoire.

Appuyer sur la surface de la peau avec le doigt et le pouce gantés et attendre 10 minutes. Laver la surface de la peau à l’eau du robinet. Ensuite, disséquer et épingler la peau du pied sur le support S comme indiqué précédemment.

Fixer avec du P-F-A-P-B-S à 1 % pendant 30 minutes à température ambiante, puis rincer dans du PBS. Pour préparer la peau de la queue, effectuer une incision circulaire autour de la base de la queue, puis une incision longitudinale s'étendant sur toute la longueur de la queue le long de sa face ventrale. Détacher la peau de la queue en partant de l'extrémité en saisissant fermement l'extrémité du rachis ou du tissu conjonctif avec une première pince et la peau avec une deuxième pince.

Épingler la peau de la queue sur un support en SIL pour l'analyse de la distribution de la mélanine et de l'orientation des follicules pileux. Fixer et traiter la peau comme indiqué pour la peau dorsale en vue de l'analyse des glandes sébacées avant la fixation. Couper la peau de la queue en une série de segments d'environ 0,5 à un centimètre de longueur, puis incuber les morceaux de peau dans du PBS contenant 5 mmol/L de EDTA toute la nuit à 37 °C.

Pour affaiblir l'adhérence entre le derme et l'épiderme le jour suivant, détacher délicatement l'épiderme du derme. Épingler l'interface de l'épiderme vers le haut sur S guard et fixer dans du PFA à 4 % dans du PBS pendant une heure à température ambiante. Laver ensuite l'épiderme avec du PBS et le colorer au rouge d'huile O comme décrit dans le texte du protocole.

Un microscope stéréoscopique est utilisé pour imager les peaux du dos du pied ou de la queue immergées dans du BBBA, aplaties sous la lame de verre et encore placées dans la boîte en verre. Cette approche minimise la contamination du microscope par le BBBA. Illuminez la boîte par en dessous afin de réduire au minimum la variation spatiale de l'intensité lumineuse sur tout le champ de vision.

Élevez le plat en verre à une hauteur d’environ 10 centimètres au-dessus de la surface de travail standard du microscope stéréoscopique et placez une plaque en plastique ou en verre diffusant au-dessus de la source lumineuse. Une fois l’imagerie terminée, remettez la peau dans de l’éthanol à 100 % pour un stockage à long terme à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer la peau colorée à la phosphatase alcaline en vue de l’imagerie, placez-la entre deux plaques de verre du type utilisé pour les petits gels de protéines.

Veiller à éviter l'introduction de bulles d'air entre les plaques et la peau. Absorber soigneusement tout excès de BBBA à l'aide d'une serviette en papier. Placer cet empilement de plaque-peau-plaque sur la platine d'un microscope.

Utilisez un éclairage en champ clair ou en contraste de phase avec un objectif 10 x et des pas Z de deux micromètres ou de cinq micromètres. Utilisez une platine XY motorisée pour capturer un montage d'images XY qui seront assemblées afin de créer un ensemble de données tridimensionnel en niveaux de gris. Effectuez le traçage semi-automatisé des arborisations axonales à l’aide de l’un des nombreux logiciels disponibles.

L'imagerie en champ clair de montages plats de peau peut être utilisée pour visualiser un arbre sensitif cutané unique, montré ici avec son image tracée. L'imagerie en champ clair permet également la visualisation des motifs des follicules pileux en fonction de la pigmentation par la mélanine. Ces images montrent la peau du jour postnatal un chez des souris de type sauvage et chez des souris knock-out pour frizzled six, ainsi que la peau du jour postnatal sept chez des souris knock-out pour Frizzled six.

L'imagerie par microscopie optique de préparations cutanées à plat peut être utilisée pour définir la géométrie des glandes sébacées et des follicules pileux. Les glandes sébacées visualisées par la coloration au rouge d'huile apparaissent désorganisées chez la souris déficiente pour frizzled six par rapport à un pied dorsal de type sauvage. La peau prélevée chez des souris de type sauvage et chez des souris déficientes pour frizzled six, portant une kératine KRT17 marquée par une GFP, a été colorée au rouge d'huile.

Rouge O a révélé que la peau modifiée présente un tourbillon pileux en son centre. L'imagerie confocale de préparations cutanées à plat peut également définir la géométrie des follicules pileux visualisés à l'aide de KRT 17 GFP et d'une immunomarquage anti-GFP, ainsi que du muscle arrecteur du poil. Les muscles oculaires sont visualisés par immunomarquage anti-actine du muscle lisse.

Les agrégats de cellules de Merkel sont visualisés à l'aide d'une anticorps anti-cytokératine 8 ou par absorption du colorant AM 1-43, tandis que leur follicule pileux central est visualisé grâce à la GFP-KRT 17. Contrairement au cas où ils sont ouverts vers l'avant, les agrégats de cellules de Merkel chez les souris knock-out pour Frizzled six forment un cercle fermé. Une fois la technique maîtrisée, une dissection peut être réalisée en environ 30 minutes si elle est effectuée correctement, et différentes préparations peuvent être réalisées en quelques jours à une semaine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment prélever la peau à partir de différentes régions du corps et comment la monter afin de visualiser diverses structures cutanées en format whole-mount. Des images en épaisseur totale et haute résolution des structures cutanées peuvent être obtenues par microscopie optique classique et par microscopie confocale.

N'oubliez pas que manipuler le paraformaldéhyde et le BBBA peut être extrêmement dangereux. L'inhalation de vapeurs doit être minimisée en gardant ces solutions dans des récipients fermés, et tout contact avec la peau doit être évité. Ne laissez pas le BBBA entrer en contact avec du plastique.