Name: Culture primaire de souris dopaminergiques neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Apprenez à générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques à partir de mésencéphalon de souris embryonnaire. Cette méthode permet d'étudier la vulnérabilité neuronale dans le contexte de la maladie de Parkinson.

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Soutenu par des bourses du CNRS et de l’INSERM. Le PM remercie la Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC remercie la Fondation de France pour son soutien.

Les souris utilisées dans ce travail ont été pris en charge et traités en conformité avec les lignes directrices du Conseil de l&#39;Union européenne (86/609 / UE) pour l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1 Préparation des solutions obligatoires <ol><li> Solutions mères <ol><li> 10x poly-L-ornithine (OLP) Solution: peser 10 mg de bromhydrate OLP (poids moléculaire = 30,000-70,000) et dissoudre dans 70 ml d&#39;eau stérile. Filtrer la solution à l&#39;aide de 0,2 um filtre de la seringue, aliquote, et conserver à -20 ° C. </li><li> 30% Solution de glucose: peser sur 30 g de D (+) - glucose et le dissoudre dans de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C. </li><li> Milieu de Eagle modifié de 5x Dulbecco (DMEM) / mélange nutritif F-12 Ham: peser 6 g de poudre DMEM / Ham F-12 et les dissoudre dans de l&#39;eau stérile pour un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C. </li><li> 7,5% de bicarbonate de sodium (NaHCO 3) Solutile: peser 7,5 g de NaHCO 3 et dissoudre dans de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C. </li><li> 1 M HEPES Solution: Peser 23,8 g d&#39;HEPES et dissoudre dans de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à un volume total de 100 ml. Filtre aliquote, et conserver à 4 ° C. </li><li> 70% (v / v) d&#39;éthanol: Diluer 70 ml d&#39;éthanol absolu avec 30 ml d&#39;eau stérile. </li></ol></li><li> Phosphate Buffered Saline de glucose et les antibiotiques (PBS-GAB): ajouter 10 ml de solution à 30% de glucose et 5 ml de solution de pénicilline-streptomycine à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Conserver à 4 ° C. </li><li> Sérum bovin fœtal inactivé (IFB): Décongeler sérum bovin pendant une nuit à 4 ° C et inactiver à 56 ° C pendant 30 min. Aliquote dans 50 ml et conserver à -20 ° C. </li><li> Milieu de culture: Dans l&#39;eau stérile, mélanger successivement 40 ml de 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml de 1 M HEPES, 2 ml de 200 mM de L-glutamine, 2 ml de pénicilline-streptomycine, 4 ml de glucose à 30% unee 3 ml de 7,5% de NaHCO 3 à un volume final de 180 ml. Filtrer et utiliser le même jour. </li><li> Hormone Mix <ol><li> Préparer 180 ml de milieu de culture. Dissoudre 200 mg d&#39;apo-transferrine dans ce milieu. </li><li> Peser 50 mg d&#39;insuline et dissoudre dans 2 ml de HCl 0,1 M. Ajouter lentement 8 ml d&#39;eau stérile tout en mélangeant délicatement. Diluer cette solution dans le milieu de culture. </li><li> Peser 19,3 mg de dichlorhydrate de putrescine et de se dissoudre dans 10 ml d&#39;eau stérile. Ajouter 10 ml de la solution de la composition de l&#39;hormone. </li><li> Préparer une solution de sélénite de sodium à 3 mM dans de l&#39;eau stérile et une solution de 2 mM de progestérone dans l&#39;éthanol absolu. Ajouter 20 ul de chaque solution de la composition de l&#39;hormone. </li><li> Filtrer le mélange d&#39;hormones, en aliquote de 10 ml et conserver à -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2 Préparation de plaques et instruments Culture <ol><li> FBS revêtement des plaques Culture: Le jour avant la dissection, préparer 180 ml de milieu de culture. Ajouter 10 ml d&#39;IFBS à 90 ml de milieu de culture. Ajouter 300 ul / puits de milieu de culture / 10% IFBS dans des plaques à 24 puits pré-enduites de poly-D-lysine. Incuber une nuit à 37 ° C. Conserver les médias restants (avec et sans les appels d&#39;offres) à 4 ° C. </li><li> Stériliser les instruments et les pipettes Pasteur. Rassemblez les équipements énumérés dans le tableau des matériaux ainsi que d&#39;une hotte de classe II à flux laminaire et un incubateur à CO2. </li></ol> 3. dissection de souris Mésencéphale <ol><li> Sacrifier une souris enceinte de E13.5 (selon les directives institutionnelles). Nettoyez l&#39;abdomen de la souris avec 70% d&#39;éthanol et d&#39;ouvrir la paroi abdominale. Recueillir les cornes utérines, ouvrez-les avec des ciseaux délicats, disséquer chaque embryon de cornes utérines, et enlever les membranes amniotiques. Placer les embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant stérile PBS-GAB et lavez-les par transfert dans 3 salles de bains successifs identiques en utilisant une pince. Pour dissection, placer les embryons par 3 dans une boîte de Pétri stérile de 60 mm. </li><li> Move le plat final Petri sous la loupe binoculaire. Ne pas décapiter les embryons. Avec des ciseaux Vannas, exciser le cerveau. <ol><li> Retirez délicatement et jeter les régions contremaîtres et du cerveau postérieur. Pour le côté rostral, couper près de la région du thalamus, de la coupe de côté caudal à la région de l&#39;isthme, retirez le colliculus supérieur. </li><li> Une fois le mésencéphale ventral est isolé, retirer délicatement les méninges à l&#39;aide de pinces ultra-fines. Recueillir les segments disséqués, sans les méninges, dans un tube de 13 ml stérile remplie de PBS-GAB. </li></ol></li><li> Nettoyez le tube contenant le mesencephala à fond avec 70% d&#39;éthanol et l&#39;amener sous le capot. </li></ol> 4. cellule de dissociation <ol><li> Laver mesencephala 3x avec PBS stérile-GAB. Autoriser les fragments du cerveau à régler entre chaque lavage et d&#39;éviter de perturber le tissu. Après le dernier lavage, éliminer soigneusement autant que possible la solution et incuber segments du cerveau dans 3 ml de trypsine / EDTA pendant 15 min à 37 ° C dans unIncubateur à CO 2. </li><li> Feu-polissez les pipettes Pasteur afin de maximiser la survie des neurones que la fin d&#39;une pipette de verre non poli est forte et peuvent endommager les cellules au cours des étapes de dissociation. Légèrement réduire le diamètre de l&#39;extrémité (jusqu&#39;à 0,5 mm) de la pipette Pasteur tandis que le feu-polissage. </li><li> Retirez délicatement autant solution / EDTA trypsine que possible et ajouter 10 ml de milieu de culture / 10% les appels d&#39;offres. Laver les segments du cerveau 3x avec milieu de culture / 10% les appels d&#39;offres. </li><li> Utilisation de la pipette Pasteur polie au feu, commencer dissociation de mesencephala dans 6 ml de milieu de culture / 10% les appels d&#39;offres. Triturez 10x (éviter les bulles d&#39;air), permettent aux morceaux de s&#39;installer, puis recueillir la moyenne dans un nouveau tube stérile de 13 ml. </li><li> Ajouter 6 ml de milieu de culture, répéter l&#39;étape précédente une fois et récupérer le milieu contenant les cellules dissociées dans le même tube de 13 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 160 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du milieu de culture supplémenté avec10% mélange d&#39;hormones. </li></ol> 5. cellulaire Placage <ol><li> Compter les cellules en suspension dans une cellule de Malassez et ajuster le volume du milieu à une concentration de 600 000 cellules / ml. Environ 1,7 millions de cellules peuvent être obtenues à partir de l&#39;un mésencéphale de souris. </li><li> Retirer FBS contenant un milieu de revêtement de plaques à 24 puits et ajouter dans chaque puits 1 ml de suspension cellulaire (600 000 cellules / puits, 2-4% de cellules TH +). </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C et 5% CO2 / 95% air. Pas de changement de milieu est nécessaire. Les neurones dopaminergiques sont matures après environ 5 à 7 jours in vitro (expression cohérente du transporteur de la dopamine). Maintenir les cellules en culture jusqu&#39;à 15 jours sans remplacement du milieu. </li></ol> Protocole 6 de immunofluorescence <ol><li> Nettoyage des lamelles couvre- <ol><li> La veille de la dissection, ajoutez 10 ml d&#39;HCl 1 M dans une boîte de Pétri. Lay à la surface des liquides 12-15 lamelles de verre et attendre 15 min. </li><li> Coulez le couvercleglisser dans le liquide et attendre 15 min. </li><li> Retirer HCl et laver 3x avec de l&#39;eau. </li><li> Laver les lamelles rapidement avec de l&#39;éthanol pur une fois, puis ajouter de l&#39;éthanol pur à l&#39;antenne et attendre 30 min. </li><li> Sous le capot, enlever des lamelles nettoyés dans de l&#39;éthanol et ajouter 1 lamelle par puits d&#39;une plaque de culture cellulaire de 12 puits en utilisant des pinces stériles. </li><li> Laver deux fois avec de lamelles de l&#39;eau stérile (1 ml / puits). Ensuite, lavez-les une fois avec du PBS stérile. </li></ol></li><li> Revêtement des Lamelles <ol><li> Retirer PBS et ajouter 500 pl / puits de 2x OLP (dilué dans du PBS). Incuber pendant 4 h à 37 ° C dans l&#39;incubateur à CO 2. </li><li> Retirer la solution de l&#39;OLP et laver 3 fois avec du PBS stérile. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 500 pl / puits de 20% les appels d&#39;offres / 1 g / ml laminine. Incuber pendant une nuit à 37 ° C dans l&#39;incubateur à CO 2. </li></ol></li><li> Étalement des cellules pour immunofluorescence <ol><li> Éliminer le milieu de revêtement de plaques à 12 puits. </li><li> Ajouter 900,000 cellules / puits dans un volume de 2 ml et croître les cellules à 37 ° C dans l&#39;incubateur. Les cellules peuvent être maintenues en culture jusqu&#39;à 15 jours sans remplacement du milieu. </li></ol></li><li> Immunocoloration <ol><li> Retirer moyen de plaques à 12 puits et laver avec 500 pl / puits de DMEM préchauffé à 37 ° C. </li><li> Ajouter 500 pl / puits de DMEM préchauffé à 37 ° C, puis ajouter délicatement 160 pl / puits de 8% de paraformaldéhyde (PFA, 2% concentration finale) et incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Retirer PFA et laver 3 fois avec PBS / 0,1 M de glycine pendant 10 min. </li><li> Retirer PBS, ajouter 300 pl / puits de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de sérum de chèvre et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Éliminer le milieu, ajouter 300 ul / puits de l&#39;anticorps primaire dilué dans du PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de sérum de chèvre et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Les anticorps primaires qui peuvent être utilisés pour la détection des neurones dopaminergiques et la caractérisation de la culture sont indiqués dans le tableau des matériaux. Garder1 bien sans anticorps primaire à évaluer pour le fond des différents anticorps secondaires. </li><li> Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS / 0,2% de gélatine pendant 10 minutes. </li><li> Éliminer le milieu, ajouter 300 pl / puits d&#39;anticorps secondaire dilué dans du PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de sérum de chèvre et incuber pendant 1 heure à température ambiante, dans l&#39;obscurité. Anticorps secondaires utilisés sont indiqués dans le tableau des matériaux. </li><li> Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS / 0,2% de gélatine pendant 10 minutes. </li><li> Éliminer le milieu et laver 3 fois avec PBS. </li><li> Monter les lamelles sur le côté verre diapositives de cellule dans une goutte de Vectashield. Gardez les lames à température ambiante pendant la nuit pour laisser le milieu de montage à sec, puis les stocker à 4 ° C. </li><li> Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal ou un microscope à contraste de phase équipé pour l&#39;épifluorescence. Des images représentatives ont été acquises avec un microscope confocal Leica SP2 UV. </li></ol></li></ol>

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<li>Ramonet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+loss%2C+reduced+neurite+complexity+and+autophagic+abnormalities+in+transgenic+mice+expressing+G2019S+mutant+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2.</a> PLoS One. 6 (e18568), (2011).</li>
<li>Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+axon+guidance%3A+which+makes+what%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic axon guidance: which makes what.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li>
<li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li>
<li>Rayport, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+postnatal+mesolimbic+dopamine+neurons+in+culture%3A+morphology+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology.</a> J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).</li>
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<li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+allows+context-specific+isolation+of+progenitors+of+GABAergic+or+dopaminergic+neurons+during+neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole présente les procédures et les réactifs nécessaires à la préparation d&#39;une culture primaire de neurones mésencéphaliques de la souris embryonnaire et la procédure d&#39;immunofluorescence pour détecter les neurones dopaminergiques. Les étapes critiques de la procédure sont la dissection des embryons et la dissociation mécanique des fragments de cerveau prélevés. Instruments de dissection de haute qualité contribue à maîtriser la technique de dissection. Neurones dopaminergiques constituent une petite pr...

La dopamine, un des neurotransmetteurs du cerveau essentielles 1,2, est surtout rejeté par dopaminergiques du mésencéphale (DA) des neurones. La majorité des neurones dopaminergiques de séjourner dans la partie ventrale du mésencéphale 6.2. Schématiquement, les neurones dopaminergiques du mésencéphale peuvent être divisés en trois anatomiquement et fonctionnellement distinctes des systèmes de projection: mesostriatal, mésolimbique et les voies mésocorticales 2,5. La voie nigro est impliqué dans le comportement moteur, les voies mésolimbiques jouent un rôle important dans le renforcement, la motivation et l&#39;apprentissage, alors que les voies dopaminergiques projetant vers le cortex préfrontal sont impliquées dans la cognition 2. Neurones dopaminergiques sont impliqués dans plusieurs troubles neurologiques humains tels que la schizophrénie, déficit de l&#39;attention, trouble de l&#39;hyperactivité, et la maladie (le PD) de Parkinson 2,4. PD est caractérisée par une dégénérescence progressive et sélective des neurones dopaminergiques de la substance noire de liaisonpars compacta (SNC) dans le striatum. La perte de nigro-striée DA neurones entraîne un grave appauvrissement de la dopamine dans le striatum qui est responsable des symptômes moteurs de la maladie (bradykinésie, tremblement de repos, et la rigidité) 7. La cause initiale de la MP idiopathique n&#39;a pas été établie et les traitements actuels ne sont symptomatiques, visant à restaurer le niveau de dopamine dans le striatum. Le médicament le plus prescrit est la L-Dopa (lévodopa), le précurseur naturel de la dopamine. Bien que l&#39;administration de lévodopa compense la perte de dopamine pendant un certain temps, des complications motrices surviennent après un traitement de longue durée (dyskinésie et états ON / OFF) 8,9. La recherche sur les neurones dopaminergiques et PD est en constante progression et les efforts intenses sont déployés pour développer des traitements basés sur la transplantation de cellules, la thérapie génique, ou agents neuroprotecteurs 10,11. Cependant, reste un problème majeur non élucidé: quelle est la cause de l&#39;extrême vulnerabilité des neurones DA? Une partie de la réponse peut être trouvée dans l&#39;activité des neurones dopaminergiques. Une réduction de l&#39;activité électrique et de l&#39;excitabilité des neurones dopaminergiques semblent augmenter leur propension à dégénérer 12. Néanmoins, la complexité du PD pathogénie nécessite d&#39;autres études pour identifier les mécanismes impliqués dans la dégénérescence des neurones DA 13-15. Les cultures primaires sont particulièrement pertinentes pour l&#39;étude des propriétés des neurones DA 16-19 et de contester ces neurones à différentes contraintes pour l&#39;évaluation des agents neuroprotecteurs 20-24. des modèles de culture de Rat sont le plus souvent utilisés, comme la dissection du mésencéphale embryonnaire de rat est plus facile, par rapport à la souris, et des quantités plus élevées de neurones peuvent être obtenus chez le rat. Toutefois, la production de modèles de souris transgéniques de la maladie 25 a considérablement augmenté l&#39;intérêt de la communauté neuroscientifique pour des cultures primaires de la souris 26-29. Bien que les cultures prepared des animaux nouveau-nés peuvent être utilisés, il est préférable de les préparer à partir d&#39;embryons au stade post-mitotique (E13.5 pour les neurones de mésencéphale), lorsque les neurones ont conservé leur capacité de se différencier. Le protocole ci-dessous présente les neurones de mésencéphale en culture primaire isolés à partir d&#39;embryons de souris (de E13.5), qui sont les plus difficiles à préparer. En particulier, nous fournissons un protocole utilisant un milieu de culture sans sérum pour une meilleure reproductibilité. Les deux étapes les plus critiques dans la préparation de la culture (dissection et dissociation mécanique) seront soigneusement détaillés dans la vidéo associée.

<table><tbody><tr><td>Sérum fœtal de veau</td><td>Lonza</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L de glucose avec L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1x), rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, solution de 200 mM</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>25030123</tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Mélange moyen/nutritif F-12 Jambon</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>D0547</td><td>Laminine en poudre</td></tr><tr><td>- 1 mg/ml dans du NaCl Sigma-Aldrich tamponné Tris</td><td>&nbsp ;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Insuline du pancréas porcin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin humain</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de putrescine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>H4034&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>G7126</td><td>Solution mère 1 M dans l’eau</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>G9391</td><td>Solution mère à 2 % (p/v) dans l’eau</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 16 % dans l’eau</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Merck Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose monohydraté</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Eau stérile - Aqua B. Braun</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu NORMAPUR réactif analytique</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre ordinaire - Wilhem Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Malassez</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>Serum Acrodisc Serum Serum Filtre seringue avec membrane Supor, stérile, GF/0.2 &micro ; m, 37 mm</td><td>PALL Life science</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux - Droits, tranchants-tranchants, 14,5 cm de long</td><td>Outils de sciences fines</td><td>14002-14</td><td>Pour ouvrir la paroi abdominale</td></tr><tr><td>Ciseaux - Droits, pointus, délicats, 10 cm de long</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>Pour ouvrir la paroi utérine</td></tr><tr><td>Pinces - Mâchoires courbées, habituelles, dentelées 1 mm</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>Pour manipuler les embryons</td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas - Courbes, pointues, lames de 7 mm</td><td>MORIA</td><td>MC50</td><td>Pour retirer le mésencéphale</td></tr><tr><td>Pince ultra fine - Courbée, délicate, 13 cm de long</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>Pour enlever les méninges</td></tr><tr><td>BD BioCoat Poly-D-Lysine Plaques multipuits 24 puits</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Plaque de culture cellulaire 12 puits, fond plat avec couvercle</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope SuperFrost, bords rectifiés 90&ordm ;</td><td>MENZEL-GL&Auml ; SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection de précision épaisseur n° 1.5H circulaire 18 mm & Oslash ;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal de lapin anti-microtubule-associé 2 (MAP2)</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Anticorps anti-glutamate décarboxylase de souris monoclonale (GAD67), clone 1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-transporteur de dopamine (DAT) de rat, clone DAT-Nt&nbsp ;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Souris monoclonale Anticorps</td><td></td><td></td> anti-5-HT <td>1/8 000 - Don généreux d’Yves Charnay (Suisse, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre, Nouvelle-Zélande Origine</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Souris IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Chèvre Anti-Rat IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11007</td><td>1/1 000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Montage Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner FIREBOY</td><td>VWR</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Les neurones dopaminergiques représentent moins de 1% du nombre total de neurones dans le cerveau. Cette faible quantité de neurones du cerveau régule les fonctions importantes telles que le contrôle moteur, la motivation et la mémoire de travail. Neurones dopaminergiques nigro-strié sélectivement dégénèrent dans la maladie de Parkinson (MP). Cette perte neuronale progressive est sans équivoque associée aux moteurs symptômes de la pathologie (bradykinésie, tremblement de repos, et une rigidité musculaire). Le principal agent responsable de la dégénérescence des neurones dopaminergiques est encore inconnue. Cependant, ces neurones semblent être extrêmement vulnérables dans diverses conditions. Les cultures primaires constituent l&#39;un des modèles les plus pertinents pour étudier les propriétés et les caractéristiques des neurones dopaminergiques. Ces cultures peuvent être soumis à différents agents de stress qui imitent PD pathologie et de composés neuroprotecteurs pour arrêter ou ralentir la dégénérescence neuronale. Les nombreux modèles de souris transgéniques de la MP qui ont été généATED au cours de la dernière décennie a encore augmenté l&#39;intérêt des chercheurs pour les cultures neuronales dopaminergiques. Ici, le protocole vidéo met l&#39;accent sur la dissection fine de cerveaux de souris embryonnaires. Excision précise de mésencéphale ventral est crucial d&#39;obtenir des cultures de neurones suffisamment riches en cellules dopaminergiques pour permettre des études ultérieures. Ce protocole peut être réalisée avec des souris transgéniques embryonnaires et est approprié pour la coloration par immunofluorescence, de PCR quantitative, la quantification de second messager, ou mort neuronale évaluation / de survie.

Un organigramme illustré les étapes de culture de mésencéphale est représenté sur la figure 1. Brièvement, après la collecte d&#39;embryons E13.5 de souris Swiss enceinte, mésencéphale ventral est disséqué à partir de l&#39;ensemble de l&#39;embryon. Les fragments isolés du cerveau sont successivement soumis à une digestion enzymatique et dissociation mécanique. Les cellules dissociées sont sédimentées par centrifugation, remises en suspension dans du milieu de culture et étalées dans des plaques à 12 o...

Les neurones dopaminergiques jouent un rôle régulateur essentiel dans le cerveau. Leur perte est associée à la maladie de Parkinson. Dans cette vidéo, nous montrons comment générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques centraux à partir de mésencéphale embryonnaire de souris. De telles cultures sont utiles pour étudier l’extrême vulnérabilité de ces neurones à divers stress.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment générer une culture primaire de neurones dopaminergiques à partir de cerveaux de souris embryonnaires. Cela est réalisé en premier lieu en collectant des embryons de souris E 13,5. La deuxième étape consiste à disséquer les cerveaux de souris embryonnaires et à isoler le mésencéphale.Ensuite, une dissociation enzymatique et une dissociation mécanique sont appliquées au mésencéphale collecté. La dernière étape consiste en la mise en culture des cellules neuronales dissociées. Enfin, une coloration immunofluorescente est utilisée pour révéler la présence de neurones dopaminergiques dans la culture.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles neurologiques et psychiatriques tels que la schizophrénie, le trouble du déficit de l'attention avec hyperactivité et la maladie de Parkinson. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de dissection et de dissociation cellulaire sont difficiles à apprendre en raison de la précision gestuelle et de l'identification anatomique exacte de la structure requises. La procédure sera démontrée par Florence, une ingénieure

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Primaire dissocié des cultures de cellules dopaminergiques du mésencéphale permettre l'étude des caractéristiques des neurones à dopamine présynaptique. Ils peuvent être utilisés pour surveiller en temps réel des cinétiques de libération de dopamine et de la protéine / ARNm niveaux de régulation de l'exocytose de dopamine. Ici, nous vous montrons comment générer ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à disséquer, transfecter par électroporation et de neurones de souris de la culture de l'hippocampe et du cortex. Cultures à court terme peut être utilisé pour des études d'excroissance axonale et d'orientation, tout en cultures à long terme peut être utilisé pour des études de la synaptogenèse et l'analyse des épines dendritiques.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Cet article décrit les méthodes pour estimer la population enrichie des cellules précurseurs des oligodendrocytes murins (OPC) en culture primaire, qui se différencier pour produire des oligodendrocytes matures (MCO). En outre, ce rapport décrit des techniques pour produire murin myélinisantes co-cultures par semis OPC de la souris sur un lit de neurites de souris dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs).

Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Cette vidéo décrit une méthode de culture de neurones dopaminergiques à partir de tissu cérébral embryonnaire de souris. Le processus comprend le traitement du mésencéphale avec une enzyme protéolytique, le détachement des cellules et leur culture sur des lamelles enrobées de polymère dans un milieu riche en nutriments avec des antibiotiques pour leur croissance et leur viabilité à long terme.

Culture et maintien de neurones dopaminergiques à partir de tissu cérébral embryonnaire de souris

La vidéo montre le processus d’isolement et de culture des neurones dopaminergiques du mésencéphale d’embryons de souris. Les planchers ventraux isolés du mésencéphale sont dissociés à l’aide d’enzymes. Les neurones dopaminergiques qui en résultent sont récoltés et transférés dans des micro-îlots à l’intérieur de plaques multi-puits. Les cellules sont incubées avec un milieu neuronal dopaminergique pour maintenir les cellules à une densité élevée à l’intérieur des micro-îles.

Isolement et culture de neurones dopaminergiques du mésencéphale embryonnaire primaire de souris

Cette vidéo démontre le processus de quantification de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires de souris prétraités avec des fibrilles préformées d’alpha-synucléine. Il décrit les étapes de fixation, de coloration et de quantification des neurones dopaminergiques contenant des agrégats d’alpha-synucléine à l’aide de l’immunofluorescence.

Étude de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires de souris

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la production simultanée de cultures de cellules de précurseur de neurones, soit comme des monocouches ou des neurosphères adhérentes, à partir de la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de souris individuels adultes.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d'une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l'ARN-seq.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l&#39;ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

Mener des expériences in vitro pour refléter les conditions in vivo aussi adéquatement que possible n'est pas une tâche facile. L'utilisation des cultures cellulaires primaires est une étape importante vers la compréhension de la biologie cellulaire dans un organisme entier. Le protocole fourni décrit comment se développer avec succès et cultiver les neurones cérévelaires embryonnaires de souris.

Culture primaire des neurones isolés du cervelet de souris embryonnaire

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour étudier l’accumulation neuronale de α-synucléine dans les neurones primaires de dopamine de souris. Les agrégats α-synucléine phosphorylés dans les neurones sont induits avec des fibrilles préformées d’α-synucléine. L’imagerie automatisée des cellules immunofluorères et l’analyse impartiale de l’image rendent ce protocole robuste adapté au dépistage moyen à élevé des médicaments qui inhibent l’accumulation de synucléine.

Étude de l’accumulation préforme induite d’α-synucléine par fibrile dans les neurones dopaminergiques de la souris embryonnaire primaire

Apprenez à générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques à partir de mésencéphalon de souris embryonnaire. Cette méthode permet d'étudier la vulnérabilité neuronale dans le contexte de la maladie de Parkinson.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

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