Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

L’objectif global de cette procédure est de montrer comment générer une culture primaire de neurones dopaminergiques à partir de cerveaux de souris embryonnaires. Ceci est accompli en collectant d’abord des embryons de souris E 13.5. La deuxième étape consiste à disséquer le cerveau embryonnaire de souris et à isoler le mésencéphale.

Ensuite, une dissociation enzymatique et une dissociation mécanique sont appliquées au mésencéphale collecté. La dernière étape est le placage des cellules neuronales dissociées. En fin de compte, la coloration immunofluorescente est utilisée pour montrer la présence de neurones dopaminergiques dans la culture.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles neurologiques et psychiatriques tels que la schizophrénie, le trouble déficitaire de l’attention avec hyperactivité et la maladie de Parkinson. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de dissection et de dissociation cellulaire sont difficiles à apprendre car un geste précis et une identification anatomique de la structure sont nécessaires, la démonstration de la procédure sera donnée par Florence à un ingénieur de mon groupe pour commencer cette procédure. Après avoir sacrifié une souris enceinte E 13.5, nettoyez son abdomen avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, ouvrez la paroi de l’abdomen et récupérez les cornes utérines. Disséquez chaque embryon des cornes utérines et retirez les membranes amniotiques. Transférez ensuite les embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant des P-B-S-G-A-B stériles.

Lavez-les en les transférant dans trois bains identiques successifs. Après cela, transférez les embryons dans une boîte de Pétri stérile de 60 millimètres pour la dissection. Placez la boîte de Pétri sous le stéréomicroscope.

Ensuite, excisez le cerveau à l’aide de ciseaux Vanna. Retirez et jetez soigneusement les quatre régions cérébrales postérieures. Faites une incision près de la région thalamique du côté rostral, et une autre incision dans la région du ssus, du côté du dorlot.

Retirez ensuite la colonne supérieure. Une fois le mésencéphale ventral isolé, retirez soigneusement les méninges À l’aide d’une pince ultra-fine, prélevez les segments disséqués sans les méninges dans un tube stérile de 13 millilitres rempli de P-B-S-G-A-B. Nettoyez soigneusement le tube contenant le mésencéphale avec de l’éthanol à 70 %.

Placez-le ensuite sous le capot dans cette étape. Lavez le mésencéphale trois fois avec du P-B-S-G-A-B stérile. Laissez les fragments de cerveau se déposer entre chaque lavage et évitez de perturber les tissus après le dernier lavage.

Retirez soigneusement autant de solution que possible et incubez les segments cérébraux dans trois millilitres de trypsine EDTA pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. En attendant, polissez le feu PEs vos pipettes pour maximiser la survie des neurones car l’extrémité d’une pipette en verre non poli est tranchante et peut endommager légèrement les cellules pendant les étapes de dissociation. Réduire le diamètre des extrémités de la pipette PE tout en la polissant au feu.

Maintenant, retirez soigneusement autant de solution de trypsine EDTA que possible. Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu de culture, 10 % IFBS, et lavez les segments de cerveau trois fois avec. À l’aide de la pipette PEs polie au feu, commencer la dissociation du mésencéphale dans six millilitres de culture.

Moyen, 10 % IFBS taux trier 10 fois et essayez d’éviter les bulles d’air. Laissez ensuite les morceaux se déposer. Prélever le milieu dans un nouveau tube stérile de 13 millilitres.

Ajoutez six millilitres de culture, moyen et tri taux 10 fois plus. Laissez les morceaux se déposer et collectez le milieu contenant les cellules dissociées dans le même tube de 13 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 160 G pendant cinq minutes.

Après cela, jetez le surnageant et le réus. Suspendez les cellules dans un milieu de culture complété par 10 % d’hormone. Mélangez les cellules de comptage en suspension dans une cellule de mase et ajustez le volume du fluide à une concentration de 600 000 cellules par millilitre.

En général, environ 1 700 000 cellules peuvent être obtenues à partir d’un mésencéphale de souris. Retirez maintenant le milieu de revêtement contenant le FBS d’une plaque de 24 puits. Ajoutez un millilitre de suspension cellulaire à chacun.

Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone 95 % d’air Les neurones dopaminergiques sont matures après environ cinq à sept jours in vitro et les cellules peuvent être maintenues en culture jusqu’à 15 jours sans remplacement de milieu. La veille de la dissection, ajoutez 10 millilitres d’une molaire HCL dans une boîte de Pétri. Placez 12 à 15 lamelles en verre sur la surface liquide et attendez 15 minutes.

Appuyez ensuite sur le couvercle pour qu’il se glisse dans le liquide et attendez encore 15 minutes. Ensuite, retirez le HCL et lavez le couvercle Slips trois fois avec de l’eau, suivi d’un lavage rapide avec de l’éthanol pur. Ajoutez ensuite de l’éthanol pur dans le plat et attendez 30 minutes sous le capot.

Retirez les lamelles nettoyées de l’éthanol. Transférez ensuite les lamelles sur une plaque de culture cellulaire à 12 puits. Lavez les lamelles deux fois avec de l’eau stérile, puis lavez-les une fois avec du PBS stérile.

Ensuite, retirez le PBS et ajoutez deux XPLO à 500 microlitres par puits, incubez pendant quatre heures à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de dioxyde de carbone après quatre heures. Retirez la solution PLO et lavez-la trois fois avec du PBS stérile. Après cela, retirez le PBS et ajoutez 500 microlitres de laminine IFBS à 20 % à un microgramme par millilitre dans chaque puits incubé pendant la nuit à 30 degrés Celsius dans l’incubateur de dioxyde de carbone.

Pour l’immunofluorescence. Retirez le milieu de revêtement de la plaque à 12 puits. Ajoutez deux millilitres de cellules à 900 000 cellules par puits et cultivez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Les cellules peuvent être maintenues en culture jusqu’à 15 jours sans remplacement du milieu. Montré. Voici les images en contraste de phase de la culture à différents stades de développement. Cette figure montre la coloration à la tyrosine hydroxylase des neurones dopaminergiques à la DIV huit neurones D ont été détectés à l’aide d’anticorps anti-TH.

Le nombre de neurones TH positifs dans la culture du mésencéphale est fonction de l’âge de la culture. Voici les neurones et astrocytes représentatifs de la culture. À la quatrième division, les neurones dopaminergiques ont été détectés à l’aide d’anticorps anti-DAT ou anti-TH et des neurones GABAergiques.

Les neurones sérotoninergiques et les astrocytes ont été détectés à l’aide d’anticorps anti-GAD 67, anti-sérotonine et anti-GFAP, respectivement. Les cellules neuronales ont été colorées avec un anticorps anti carte deux. Voici la coloration représentative de plusieurs populations cellulaires de la culture de mésencéphale.

Un neurone dopaminergique a été détecté par coloration DAT à la DIV neuf et ces neurones GABAergiques ont été visualisés par coloration GAD 67 à la DIV neuf. Le neurone sérotoninergique a été coloré avec un anticorps anti-sérotonine à DI neuf. Les neurones ont été identifiés par cartographie à la coloration après son développement au début des années quatre-vingt.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer le développement des cellules dopaminergiques en culture primaire et peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux états physiologiques et pathologiques des neurones dopaminergiques. L’absence de vidéo présentant la dissection délicate a peut-être freiné les chercheurs à développer ce modèle de culture de souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler avec précision le fonctionnel du cerveau embryonnaire de la souris et d’effectuer des étapes de dissociation dédiées afin d’obtenir une belle culture primaire de dopaminergiques de souris.