Nanogold étiquetage du système levure endosomique pour les analyses ultrastructurales

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser au niveau ultrastructural les compartiments endosomaux de la levure Saccharomyces cerevisiae. Cela est réalisé en préparant des sphéroplastes de levure, qui internalisent ensuite par endocytose des nanoparticules d'or chargées positivement. Dans une deuxième étape, l'échantillon est fixé et inclus pour obtenir des coupes cryogéniques ultraminces des cellules.

Ensuite, les sections cryogéniques sont soumises à la réaction de développement argentique. Afin d'agrandir et de visualiser l'endocytose, des résultats positifs obtenus avec des nano-particules d'or chargées sont observés, révélant la morphologie des différents compartiments endosomaux de la levure, basée sur le marquage spécifique de cette procédure. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme le marquage ImmunoGold sur sections, est qu'elle ne dépend pas d'anticorps, qui ne fonctionnent souvent pas sur les préparations de microscopie électronique.

Bien que cette méthode puisse nous fournir des aperçus sur le système lysosomal de la levure sarchi ESIS vei, elle peut également être appliquée à d'autres modèles eucaryotes tels que d'autres levures et des cellules de mammifères. Les levures à partir desquelles les Sphéroplastes seront préparés sont d'abord incubées toute la nuit à 30 degrés Celsius dans 10 millilitres du milieu approprié, tel que déterminé par la conception de l'expérience du lendemain. Après avoir mesuré la densité optique de la culture à 600 nanomètres, diluez les cellules dans le même milieu de culture jusqu'à une DO 600 comprise entre 0,2 et 0,4.

Faire croître les cellules jusqu'à la phase de croissance exponentielle avec une DO 600 comprise entre 1 et 2, transférer l'équivalent de 10 DO 600 de cellules dans un tube de 50 millilitres et centrifuger à 2100 g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 5 millilitres de PIPES 100 millimolaire et de DTT 10 millimolaire à pH 7,4. Incuber à 30 degrés Celsius pendant 10 minutes. Récupérer les cellules par centrifugation.

Après avoir éliminé le surnageant Resus, resuspendre les cellules dans cinq millilitres de milieu contenant un molaire de sorbitol et cinq milligrammes d'enzyme lytique. Incuber le mélange à 30 degrés Celsius avec agitation douce pendant 30 minutes. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 Gs pendant cinq minutes pour recueillir une fraction en culot correspondant aux Sphero plats.

Jetez le surnageant et resuspendez les plastes dans 960 microlitres de milieu froid contenant un molaire de sorbitol. Transférez le mélange dans un tube microcentrifuge de deux millilitres préalablement refroidi. Pour commencer la procédure d'absorption de nano-or, utilisez une pipette et mélangez délicatement les plastes sphériques avec quatre particules de nano-or chargées positivement.

Resuspendre dans 40 microlitres d'eau. Le volume final du mélange doit être d'un millilitre. Placer la suspension cellulaire obtenue sur de la glace pendant 15 minutes.

Transférez la suspension à température ambiante et incubez pendant le temps requis pour permettre l'internalisation des nanoparticules d'or par endocytose. Lorsque l'absorption souhaitée des nanoparticules d'or est terminée, arrêtez la réaction en ajoutant un millilitre de fixateur double concentration contenant un molaire de sorbitol à la suspension cellulaire. Conservez le tube à température ambiante pendant 30 minutes.

Inverser doucement le tube de microcentrifugeuse manuellement plusieurs fois pendant les 30 minutes afin de maintenir la plastification PHE et la suspension. Centrifuger ensuite deux fois à 1700 G pendant 25 secondes, éliminer le surnageant et ajouter un millilitre de fixateur de concentration standard contenant un molaire de sorbitol. Incuber pendant deux heures à température ambiante sur une roue tournante lente. Par la suite, les cellules sont traitées et cryoséctionnées comme décrit dans le protocole écrit. Avant de commencer cette procédure, sortir le kit d'amplification argentique du congélateur et le faire décongeler dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Placer le kit décongelé dans un incubateur de paillasse à 24 degrés Celsius préalablement placé dans la chambre noire jusqu'à son utilisation.

Placer une plaque chauffante dans une pièce sombre et la réchauffer jusqu'à une température finale de 24 degrés Celsius. Recouvrir le dessus de la plaque chauffante avec une surface de protection de banc, côté brillant vers le haut, et la fixer avec du ruban adhésif. Placer du film parafilm sur le protecteur de surface et marquer les bords avec un marqueur noir afin de permettre la visualisation dans l'obscurité.

Fixez un thermomètre avec du ruban adhésif sur le dessus du protecteur de surface. Pour surveiller la température de la plaque chauffante, réglez progressivement la température. S’il ne s’agit pas de 24 degrés Celsius, placez un tube de 50 millilitres contenant de l’eau doublement distillée.

À l'intérieur de l'incubateur, remplir une petite boîte de Pétri avec de l'eau doublement distillée préchauffée à 37 degrés Celsius. Placer deux grilles en nickel, avec les sections cryogéniques, dans l'eau, côté échantillon vers le bas, pendant 30 minutes. Après 30 minutes, remplir une deuxième boîte de Pétri avec de l'eau doublement distillée préchauffée et placer les deux mêmes grilles en nickel dans l'eau pendant encore 30 minutes.

Rincez à nouveau les grilles en les faisant passer, côté échantillon vers le bas, sur plusieurs gouttes d'eau doublement distillée à 24 degrés Celsius déposées sur le parfum fixé sur la plaque chauffante. Assurez-vous que neuf autres gouttes d'eau doublement distillée sont prêtes sur le parfum pour le rinçage après la réaction d'amélioration argentique. À ce stade de la procédure, toutes les lumières de la chambre noire doivent être éteintes et la lumière rouge allumée.

Cependant, uniquement pour les besoins du tournage, la lumière restera allumée. Dans cette démonstration, sortez les solutions a et B du kit d'amplification argentique de l'incubateur à 24 degrés Celsius et placez-les dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre : ajoutez six gouttes de la solution A, suivies de six gouttes de la solution B, puis mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette en verre en évitant la formation de bulles. Vortexez la solution.

Replacez brièvement les solutions a et B dans l’incubateur à 24 degrés Celsius et sortez la solution C. Ajoutez six gouttes de la solution C au mélange AB. Mélangez à nouveau à l’aide d’une pipette Pasteur, puis par vortexage, en évitant de former des bulles.

Utilisez ce mélange final immédiatement. Déposez des gouttes sur le paraforme à l’aide d’une pince à épiler propre et anti-magnétique. Placez les grilles sur le mélange.

Il s'agit de la réaction de rehaussement argentique. Laisser les grilles de six à quinze minutes selon le niveau de rehaussement souhaité pour l'expérience. Retirer les grilles du mélange et les passer rapidement à travers une série de six gouttes d'eau doublement distillée placées sur du Perfil à 24 degrés Celsius pour les trois derniers rinçages.

Laissez les grilles sept minutes par goutte d'eau. Si vous réalisez une expérience réelle, rallumez les lumières lorsque le lavage est terminé. Ensuite, les résultats sont visualisés par marquage ImmunoGold ou coloration membranaire dans le cadre d'une analyse en microscopie électronique.

Divers types de compartiments endosomaux de levure peuvent être marqués au moyen de nano-or renforcé par l'argent et visualisés par microscopie électronique. Une incorporation de cinq minutes de nano-or marque la membrane plasmique et les compartiments endosomaux précoces, tels que des vésicules uniques, qui sont probablement des vésicules endocytaires, et des structures tubulaires, qui sont très probablement des endosomes précoces. Une incubation de 30 minutes avec le nano-or conduit au marquage des endosomes tardifs ou des corps multivésiculaires.

Le pouvoir de résolution de la combinaison d'une procédure de microscopie électronique immunocytochimique avec ce protocole de nano-renforcement argentique est souligné par la préservation et la qualité de la morphologie des organites montrés, en particulier les vésicules internes des corps multivésiculaires. Avant d'utiliser la méthode de renforcement argentique, il est nécessaire de réaliser une expérience pilote afin de déterminer les durées d'incubation optimales nécessaires à la fois pour la taille et l'uniformité de ces particules d'argent. Suivre cette procédure.

D'autres méthodes, comme le marquage immunologique, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions telles que la localisation d'une protéine particulière dans un compartiment marin spécifique.